乙肝血清學(xué)檢測研究進展

吳詩陽 ，孫加進，楊 州

（無錫市第八人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 無錫 214011）

在我國，乙型肝炎是一個嚴重的公共衛(wèi)生問題，主要由乙型肝炎病毒（HBV）感染引發(fā)，每年有大量新發(fā)感染病例，且HBV 感染者數(shù)量龐大。乙型肝炎是一種損害肝臟的病毒感染，可引起急性或慢性疾病，可發(fā)展為肝硬化和肝細胞癌。因此，乙型肝炎的診斷、治療和預(yù)防都非常重要。HBV 血清學(xué)檢測作為診斷和治療的重要手段，其應(yīng)用價值不言而喻。在臨床應(yīng)用方面， HBV 血清學(xué)檢測可以用于診斷乙型肝炎、評估病情、監(jiān)測治療效果、指導(dǎo)抗病毒治療、評估疫苗接種效果等，如通過檢測HBV、脫氧核糖核苷酸（DNA）可以了解病毒復(fù)制水平，判斷病情嚴重程度；通過檢測乙肝表面抗體（HBsAb）可以了解疫苗接種后的免疫效果等。此外， HBV 血清學(xué)檢測也在流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)揮重要作用。通過對不同人群進行血清學(xué)調(diào)查，可以了解HBV 的感染狀況和流行趨勢，為制定預(yù)防措施提供依據(jù)。本文主要探討HBV 血清學(xué)檢測的研究進展，現(xiàn)綜述如下。

1 HBV 血清標志物

HBV 血清標志物是HBV 感染和復(fù)制的重要指標，其檢測簡單易得，也是乙型肝炎診斷和治療的關(guān)鍵依據(jù)。HBV 血清標志物如乙肝表面抗原（HBsAg）、乙肝表面抗體（HBsAb）、乙肝病毒e 抗體（HBeAg）等在疾病進展中具有指示作用，可以反映肝臟受損程度和病毒復(fù)制情況，從而幫助評估患者病情和指導(dǎo)治療[1]。如HBsAg 和HBsAb的檢測可以一定程度反映病毒復(fù)制情況和肝臟受損程度，從而幫助評估病情和指導(dǎo)治療。同時，HBeAg 和HBeAb的檢測可以反映病毒復(fù)制和傳染性的強弱，從而指導(dǎo)抗病毒治療。在臨床上，將HBsAg 和HBV DNA 進行聯(lián)合檢測，可以更準確地診斷HBV 感染[2]。由于某些基因和環(huán)境因素可能會影響到血清標志物的表達水平，從而影響患者病情的發(fā)展和治療效果。

2 HBV 核酸檢測方法

核酸檢測方法在HBV的檢測中得到廣泛應(yīng)用，這些方法包括聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、實時熒光定量PCR、堿基化反應(yīng)測序等。核酸檢測方法具有高靈敏度和高特異性，并可以檢測到病毒的脫氧核糖核苷酸（DNA）/核糖核苷酸（RNA），可以有效確定HBV 感染者的感染狀況、病毒載量和突變情況。結(jié)合實驗室中開發(fā)的新型自動化和智能化的系統(tǒng)，可以通過機器學(xué)習(xí)和人工智能技術(shù)實現(xiàn)自動化樣本處理、數(shù)據(jù)分析等功能，進一步提高檢測的準確性和可重復(fù)性，減少人為誤差。各項檢測技術(shù)也經(jīng)常與其他血清學(xué)指標（如肝功能、肝炎病毒標志物等）聯(lián)合使用，形成綜合診斷方案，以提高診斷的準確性和治療效果的評估。

2.1 PCR 技術(shù)PCR 技術(shù)是以DNA 的半保留復(fù)制機制為基礎(chǔ)，發(fā)展出的體外酶促合成、擴增特定核酸片段的一種方法。目前通過優(yōu)化PCR 反應(yīng)體系、采用低濃度引物多重PCR 等技術(shù)，成功提高了HBV 的檢測靈敏度。根據(jù)最新研究顯示，該技術(shù)已經(jīng)能夠檢測到低至單個拷貝的HBV DNA，極大地提高了早期診斷的準確性[3]。在臨床上，通過采用高特異性的引物和探針，結(jié)合嚴謹?shù)膶嶒炘O(shè)計，PCR 技術(shù)對HBV 的檢測特異性有了顯著提高，其有助于減少誤診和漏診，提高診斷的準確性[4-5]。多重PCR技術(shù)使得HBV 的基因分型和耐藥性檢測得以實現(xiàn)，該技術(shù)可以通過同時檢測多個基因片段，可以更準確地了解病毒的變異情況，為臨床治療提供指導(dǎo)。

2.2 基因測序技術(shù)采用高深度測序技術(shù)能夠更準確地檢測HBV 的基因序列，采用這種方法有助于了解病毒的變異情況，為臨床治療提供指導(dǎo)。目前可以利用堿基化反應(yīng)測序技術(shù)，進行全基因組測序[6]。采用這種方法有助于全面了解HBV 的基因組結(jié)構(gòu)和功能，為抗病毒藥物研發(fā)提供重要信息?？梢酝ㄟ^堿基化反應(yīng)測序技術(shù)，檢測HBV 對藥物的耐藥性，有助于指導(dǎo)醫(yī)師選擇合適的藥物治療方案，提高治療效果?？梢岳脡A基化反應(yīng)測序技術(shù)，精確地進行HBV 的基因分型和進化分析，有助于了解病毒的傳播和演化情況，為疫情防控提供重要信息。

3 血清學(xué)標志物檢測方法

HBV 血清學(xué)標志物包括HBsAg、HBeAg、HBsAb 等，近年來，一些新的檢測方法，如熒光免疫分析法（FIA）、化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）等的引入，提高了HBV 血清學(xué)標志物檢測的靈敏度和特異度。

3.1 FIA通過采用新型的熒光標記技術(shù)和信號放大技術(shù)，熒光免疫分析法的靈敏度得到了顯著提高，比傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）方法更靈敏[7]。FIA 利用熒光標記的特異性探針，可以同時檢測多個病毒抗原或抗體，包括乙肝表面抗原、e 抗原、核心抗原和抗體等，有助于全面了解HBV 的感染和復(fù)制情況[8]。FIA 通過優(yōu)化熒光標記物的選擇和制備過程，提高熒光標記物的質(zhì)量和穩(wěn)定性，從而提高檢測的靈敏度。此外，還可通過改進熒光免疫分析法的實驗條件和操作流程，以降低背景信號和噪聲，提高檢測的信噪比，利用納米材料和量子點等新型熒光標記物，提高熒光免疫分析法的靈敏度和穩(wěn)定性。FIA通過同時使用多種熒光標記物，對不同目標分子進行標記和檢測，以實現(xiàn)多重檢測。此外，還可通過將FIA 與其他技術(shù)相結(jié)合，如質(zhì)譜技術(shù)、芯片技術(shù)和納米技術(shù)等，以進一步提高多重檢測的靈敏度和特異性[9]。利用納米材料和量子點等新型熒光標記物，實現(xiàn)多重?zé)晒饷庖叻治?；將不同熒光標記物與不同的抗體或核酸等目標分子結(jié)合，形成具有高熒光性能的標記物，從而實現(xiàn)對不同目標分子的多重檢測。

3.2 CLIA 通過優(yōu)化CLIA的反應(yīng)條件和探針設(shè)計，提高了檢測的靈敏度和特異性，新型的CLIA 可以檢測到低至單個拷貝的HBV 表面抗原，具有較高的準確性[10]。新型的CLIA 結(jié)合了量子點和磁性納米顆粒的優(yōu)勢，實現(xiàn)了對目標分子的高靈敏度和高特異度檢測，還可以將CLIA與其他技術(shù)聯(lián)用，如質(zhì)譜技術(shù)、納米技術(shù)等，以進一步提高CLIA 的靈敏度和特異性。在臨床應(yīng)用方面，目前已開發(fā)自動化、微型化的CLIA 儀器，實現(xiàn)快速、簡便的檢測。目前臨床正在探索新型的化學(xué)發(fā)光標記物，如量子點、納米線等，這些新型標記物具有更高的發(fā)光效率和穩(wěn)定性，可以進一步提高CLIA 的靈敏度和特異性。金屬有機框架（MOFs）作為新型發(fā)光標記物具有高穩(wěn)定性、高靈敏度、高發(fā)光效率等優(yōu)點，為化學(xué)發(fā)光免疫分析提供了新的選擇， MOFs 是一種由金屬離子或團簇與有機配體相互連接形成的具有多孔結(jié)構(gòu)的晶體材料，具有高比表面積、高孔容、可調(diào)的孔徑和化學(xué)功能性等優(yōu)點，為化學(xué)發(fā)光標記物的制備提供了新的平臺，將CLIA 與納米技術(shù)、生物技術(shù)等相結(jié)合，開發(fā)出更加靈敏、特異的檢測方法[11]。

3.3 免疫學(xué)檢測方法免疫學(xué)檢測方法包括ELISA、放射免疫測定法（RIA）等。近年來，研究人員對這些方法進行了改進，提高了乙肝病毒抗體的檢測靈敏度和特異性。

3.3.1 ELISA ELISA 方法通過將酶與抗體結(jié)合，形成酶 - 抗體復(fù)合物，然后將該復(fù)合物與目標分子結(jié)合，實現(xiàn)信號的第一次放大。接著，通過將另一個酶與第一個酶 - 抗體復(fù)合物結(jié)合，形成第二個酶 - 抗體復(fù)合物，實現(xiàn)對目標分子的多級放大，從而極大地提高了檢測的靈敏度。目前臨床致力于優(yōu)化ELISA 的反應(yīng)條件和探針設(shè)計，以進一步提高檢測的靈敏度和特異性。新型的ELISA 方法可以檢測到低至單個拷貝的HBV 表面抗原，具有較高的準確性；基于信號放大的ELISA 方法利用多個酶 - 抗體復(fù)合物對目標分子進行多級放大，從而極大地提高了檢測的靈敏度[12-13]。通過選擇具有高親和力和特異性的抗體，以及優(yōu)化實驗條件和操作流程，以降低背景信號和噪聲，提高檢測的信噪比和特異性，還可以于開發(fā)自動化、微型化的ELISA 儀器，以實現(xiàn)快速、簡便的檢測。

3.3.2 RIA 通過采用新型的放射性核素和抗體， RIA 的靈敏度和特異度得到了顯著提高[14]。新型的RIA 方法可以檢測到低至單個拷貝的HBV 表面抗原，具有較高的準確性。通過改進放射性核素的標記技術(shù)和優(yōu)化實驗條件，提高放射免疫測定法的靈敏度和特異性。如利用新型的放射性核素，如64Cu、18F 等，具有較長的半衰期和較高的能量分辨率，可以提高檢測的靈敏度和準確性。將RIA 與其他技術(shù)相結(jié)合，以實現(xiàn)多組分聯(lián)合檢測和自動化檢測，如將放射免疫測定法與磁性分離技術(shù)、光學(xué)成像技術(shù)等相結(jié)合，利用磁性納米顆粒對目標分子的高效吸附和光學(xué)成像技術(shù)的高分辨率優(yōu)勢，可以實現(xiàn)高靈敏度和高特異性的檢測。目前臨床正在探索新型具有更高的靈敏度和更低的輻射劑量的放射性核素，可以進一步提高RIA 的檢測效果。利用納米技術(shù)制備出具有高比表面積、高發(fā)光效率、低毒性的新型納米發(fā)光材料，并將其與放射性核素結(jié)合，形成具有高效發(fā)光性能和低毒性的納米發(fā)光標記物，從而利于提高檢測的靈敏度和安全性。另外還可將放射免疫測定法與其他技術(shù)相結(jié)合，如將RIA 與質(zhì)譜技術(shù)、芯片技術(shù)等相結(jié)合，通過分析目標分子的質(zhì)譜特征或與芯片上的抗體或核酸探針結(jié)合，實現(xiàn)高靈敏度和高特異性的檢測。

4 HBV 血清學(xué)檢測的應(yīng)用領(lǐng)域和現(xiàn)狀

HBV 血清學(xué)檢測廣泛應(yīng)用于以下幾個方面：①HBV的篩查和診斷；②乙型肝炎病情監(jiān)測和預(yù)后評估；③乙型肝炎疫苗接種后的效果評估。目前，HBV 血清學(xué)檢測技術(shù)已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用，但仍然存在一些問題，如試劑的質(zhì)量和標準化問題、交叉反應(yīng)和假陽性等。

4.1 乙型肝炎的篩查和診斷

4.1.1 篩查 HBV 血清學(xué)檢測常用于乙型肝炎的篩查，特別是對于HBV 攜帶者和乙型肝炎患者。通過檢測HBsAg、 HBsAb、 HBeAg、 HBeAb 和乙型肝炎病毒核心抗體（HBcAb）等指標，可以有效地發(fā)現(xiàn)HBV 的存在和復(fù)制情況，進而進行必要的治療和管理[15]。然而對于一些隱性感染或病毒攜帶者，可能會出現(xiàn)漏檢的情況。此外，由于不同地區(qū)和人群的感染模式和免疫狀態(tài)不同，血清學(xué)檢測的陽性率也會有所差異。

4.1.2 診斷 HBV 血清學(xué)檢測在乙型肝炎的診斷方面也具有重要作用，通過檢測血清中的病毒標志物和其他相關(guān)指標，可以確定乙型肝炎的感染狀態(tài)、病情進展和治療效果等[16]。如 HBV DNA 的檢測可以用于判斷病毒復(fù)制情況和治療效果，而 HBsAg 和HBsAb 的檢測可以用于判斷感染狀態(tài)和免疫情況。然而有時也會出現(xiàn)假陽性或假陰性的情況，比如可能會出現(xiàn)一些非特異性免疫因素從而導(dǎo)致假陽性的結(jié)果，而病毒變異或低水平復(fù)制則可能導(dǎo)致假陰性的結(jié)果。

4.2 乙型肝炎病情監(jiān)測和預(yù)后評估

4.2.1 病情監(jiān)測 在臨床上，常通過定期檢測ALT、 AST等肝功能指標，來了解肝臟的功能狀況，進而評估病情的進展和治療效果；然而并不能完全反映肝臟病變的情況，這是因為一些血清標志物的變化可能滯后于病情變化，因此需要結(jié)合其他檢查和臨床數(shù)據(jù)進行綜合判斷[17]。HBV血清學(xué)檢測可以用于監(jiān)測乙肝患者的病情變化。例如，HBsAg 和HBsAb 的檢測可以反映病毒復(fù)制情況和免疫狀態(tài)，而HBeAg 和HBeAb 的檢測可以反映病毒復(fù)制和傳染性的強弱[18]。通過定期檢測這些指標，可以評估病情的進展和治療的效果。病毒載量可以反映乙型肝炎病毒在體內(nèi)的復(fù)制活躍程度，高病毒載量提示傳染性強、疾病進展快，而低病毒載量則提示傳染性低、疾病進展緩慢，血清HBV DNA 水平是反映病毒復(fù)制活躍程度的重要指標。

4.2.2 預(yù)后評估 HBV 血清學(xué)檢測在抗病毒治療方面也具有指導(dǎo)作用，通過檢測HBV DNA 的水平，可以判斷抗病毒藥物的治療效果和病毒的復(fù)制情況，進而調(diào)整治療方案。 HBV 血清學(xué)檢測可以用于指導(dǎo)抗病毒治療，但并不能完全反映病毒對藥物的反應(yīng)情況。一些藥物可能不能有效降低HBV DNA 水平，但可以改善肝功能和減少肝組織炎癥反應(yīng)，因此需要結(jié)合其他檢查結(jié)果進行綜合評估。HBV 血清學(xué)檢測也可以用于評估患者的預(yù)后情況。 HBsAg定量檢測可以預(yù)測抗病毒治療的效果和預(yù)后，而HBsAg和HBcAb 的定量檢測可以預(yù)測疾病進展和肝硬化的風(fēng)險。如HBsAg 通常在癥狀出現(xiàn)后1 至3 個月消失，而乙肝核心抗體（抗-HBc）在窗口期可能是唯一存在的血清學(xué)標志物。在慢性乙型肝炎中， HBsAg 持續(xù)存在和抗-HBc 總陽性是疾病進展為肝纖維化、肝硬化和肝細胞癌的主要危險因素[19]。同時，血清學(xué)指標如透明質(zhì)酸、層粘連蛋白、Ⅳ型膠原等被用于評估肝纖維化的程度，這些指標可以反映肝臟損傷的程度和疾病的預(yù)后[20]。

4.3 乙肝疫苗接種后的效果評估HBV 血清學(xué)檢測可以用于評估乙肝疫苗接種后的效果。在疫苗接種后，通過定期檢測HBsAg、 HBsAb、 HBeAg、 HBeAb 和HBcAb 等指標，可以了解疫苗接種后的免疫應(yīng)答情況，包括疫苗接種的有效性和持久性等[21]。數(shù)字免疫分析法是一種新型的免疫分析方法，具有快速、自動化、高精度和低成本等優(yōu)點。數(shù)字免疫分析法通過將抗體與磁性納米顆粒結(jié)合，然后利用磁分離技術(shù)將抗體與抗原結(jié)合形成的免疫復(fù)合物分離，最后通過檢測光信號來定量抗原濃度，可以用于乙肝疫苗接種后的效果評估。

5 HBV 血清學(xué)檢測的局限性及進一步研究方向

目前，HBV 血清學(xué)檢測方法在臨床應(yīng)用中已然取得了顯著的成效，但仍存在一定的局限性。如常規(guī)的電鏡法雖然標本用量小、制作速度快，但在觀察過程中直觀性較差，且靈敏度較低。免疫電鏡法雖然高靈敏度、高精密度，但樣本制備過程較為復(fù)雜，對操作者技能要求較高。另外，目前對于HBV 的檢測主要集中在其表面抗原的檢測上，而對于病毒基因突變以及其他未知病毒蛋白的檢測尚不完善[22]。

進一步的研究方向可以從探索新型生物標志物、聯(lián)合應(yīng)用多種檢測方法、自動化和智能化、個性化治療、疫苗接種效果評估、肝病預(yù)防、預(yù)后評估等方面。具體分析如下：①探索新型生物標志物：除了目前的乙肝表面抗原、e 抗原、e 抗體和核心抗體等指標外，還可以探索其他與HBV 感染和復(fù)制相關(guān)的生物標志物，比如微小RNA、循環(huán)DNA 等，以更準確地反映 HBV 的感染狀態(tài)、復(fù)制程度和治療效果。②聯(lián)合應(yīng)用多種檢測方法：可以將不同的 HBV血清學(xué)檢測方法進行聯(lián)合應(yīng)用，如免疫化學(xué)發(fā)光法、時間分辨熒光免疫法、電化學(xué)發(fā)光免疫法等，可以提高檢測的準確性和靈敏度。③借助自動化和智能化系統(tǒng)：還可以進一步開發(fā)自動化儀器和智能化系統(tǒng)，實現(xiàn)樣本自動處理、數(shù)據(jù)分析等功能，提高檢測的可重復(fù)性和準確性，減少人為誤差。④個性化治療：可以通過HBV 血清學(xué)檢測，可以了解患者的病毒復(fù)制情況、基因型等個體差異，為制定個性化的抗病毒治療方案提供依據(jù)。⑤疫苗接種效果評估：HBV 血清學(xué)檢測可以評估疫苗接種后的免疫應(yīng)答情況，預(yù)測疫苗的保護效果，為優(yōu)化疫苗接種方案提供參考。⑥肝病預(yù)防：可以通過HBV 血清學(xué)檢測，可以發(fā)現(xiàn)潛在的感染者，及時采取預(yù)防措施，降低乙型肝炎的傳播風(fēng)險。⑦預(yù)后評估：可以通過對乙型肝炎患者的長期隨訪和檢測，可以評估患者的預(yù)后情況，預(yù)測疾病的發(fā)展趨勢，為臨床治療提供指導(dǎo)。

6 小結(jié)與展望

HBV 血清學(xué)檢測在臨床上有重要的應(yīng)用價值，主要包括診斷和鑒別診斷、病情監(jiān)測和預(yù)后評估、抗病毒治療指導(dǎo)、疫苗接種效果評估以及流行病學(xué)調(diào)查等方面。通過乙肝血清學(xué)檢測，醫(yī)師可以判斷患者是否感染了HBV，了解病毒的復(fù)制水平，評估病情嚴重程度，監(jiān)測治療效果，指導(dǎo)抗病毒治療，評估疫苗接種效果等。雖然HBV 血清學(xué)檢測技術(shù)已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用，但仍需要進一步改進和完善，提高其靈敏度和特異性，降低交叉反應(yīng)和假陽性率。同時，隨著新技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，HBV 血清學(xué)檢測技術(shù)也將得到更廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。