超聲處理對(duì)牙本質(zhì)玷污層性狀及粘接強(qiáng)度的影響

王如玉，潘雅慧，聶蓉蓉，孟翔峰

在口腔修復(fù)領(lǐng)域，牙本質(zhì)粘接一直以來(lái)都是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，其粘接效果受許多因素影響[1]。其中牙本質(zhì)在打磨過(guò)程中產(chǎn)生的玷污層是影響粘接強(qiáng)度的重要因素之一[2]，所以玷污層的預(yù)處理方式也是歷代粘接劑改良的重點(diǎn)[3]。目前運(yùn)用廣泛的通用型樹(shù)脂粘接劑通常屬于弱酸型，它無(wú)法徹底去除牙本質(zhì)表面的玷污層，只能部分溶解或改性，尤其是超弱酸型粘接劑作用的深度僅為幾百納米[4-5]，幾乎無(wú)法在粘接界面形成樹(shù)脂突，所以牙本質(zhì)表面玷污層的性狀會(huì)極大地影響其粘接效果。

超聲技術(shù)是現(xiàn)代口腔治療中一種有效的清潔方式。在牙周領(lǐng)域，其通過(guò)高頻振蕩和在水中產(chǎn)生的空穴效應(yīng)去除菌斑牙石等附著物[6-7]；在牙體牙髓領(lǐng)域，通過(guò)超聲蕩洗可以去除根管內(nèi)壁附著的玷污層及殘留細(xì)菌等[8]。受此啟發(fā)，如果在牙體預(yù)備后輔助使用超聲器械處理牙體表面玷污層，也許有助于提高弱酸型通用樹(shù)脂粘接劑與牙本質(zhì)間的粘接強(qiáng)度。因此本研究采用了弱酸型和超弱酸型兩種不同的通用型樹(shù)脂粘接劑，旨在探究超聲處理對(duì)離體牙牙體預(yù)備后表面玷污層性狀以及粘接強(qiáng)度的影響，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本院口腔頜面外科門(mén)診收集的新鮮拔除的40顆無(wú)齲下頜第三磨牙(去除附著軟組織，經(jīng)消毒處理后保存在4 ℃生理鹽水中，1個(gè)月內(nèi)使用)；320目碳化硅砂紙(鷹牌，香港瑞新行有限公司，中國(guó))；2種通用型樹(shù)脂粘接劑：All-Bond Universal (pH=3.1，Bisco，美國(guó))，Clearfil Universal Bond (pH=2.3，Kuraray，日本)；光固化復(fù)合樹(shù)脂Z350(3M，美國(guó))；自凝牙托粉及牙托水(滬鴿，中國(guó))；Rhodamine B(Sigma，美國(guó))；氰基丙烯酸酯粘接劑(Alteco，日本)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

LED光固化燈(EliparTMDeepCure-S，3M，美國(guó))；慢速切割機(jī)(Isomet 1000，標(biāo)樂(lè)，美國(guó))；超聲潔牙機(jī)(Piezon Master 700，EMS，瑞士)；C尖(Piezon System，EMS，瑞士)；掃描電子顯微鏡(JEM-200CX，JEOL，日本)；激光掃描共聚焦顯微鏡(LSM800，ZEISS，德國(guó))；體視顯微鏡(SMA1500，Nikon，日本)；微拉伸測(cè)試儀(T-61010K，Bisco，美國(guó))；電子游標(biāo)卡尺(JEM-200CX，上海精密儀器儀表公司，中國(guó))；37 ℃生化培養(yǎng)箱(SPX-80，上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，中國(guó))。

1.3 牙本質(zhì)表面玷污層的制備

將40顆離體牙以近中頰軸角釉牙骨質(zhì)界與近中頰尖連線的上1/2處為切割點(diǎn)，在水流冷卻條件下利用慢速切割機(jī)垂直牙體長(zhǎng)軸切割暴露牙本質(zhì)。體視顯微鏡下確認(rèn)表面無(wú)釉質(zhì)殘留后，將40顆離體牙用320目碳化硅砂紙流水下打磨30 s，隨機(jī)選擇其中一半的離體牙繼續(xù)用超聲潔牙機(jī)C尖(水流速度40 mL/min，頻率32 kHz)處理牙本質(zhì)表面，工作尖與牙面輕接觸無(wú)壓力，確保超聲充分且無(wú)重復(fù)，移動(dòng)速度1 mm/s。處理結(jié)束后，用氣槍以水噴霧方式徹底清洗牙本質(zhì)表面后備用(實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)圖1)。

圖1 實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)略圖

1.4 掃描電子顯微鏡(SEM)觀測(cè)牙本質(zhì)表面玷污層性狀

分別從320目碳化硅砂紙打磨組及超聲處理組中隨機(jī)選取離體牙，利用慢速切割機(jī)垂直于牙體長(zhǎng)軸切割形成2 mm厚度的牙本質(zhì)薄片，固定、脫水、干燥，離子濺射器噴金后粘臺(tái)，用SEM觀察牙本質(zhì)表面玷污層性狀差異。每組隨機(jī)選取3張2 000倍電鏡照片，利用ImageJ軟件對(duì)圖片中牙本質(zhì)小管暴露情況進(jìn)行量化分析：牙本質(zhì)小管完全暴露或暴露3/4以上評(píng)分為1.00，暴露1/2～3/4評(píng)分為0.75，暴露1/4～1/2評(píng)分為0.50，暴露1/4以下評(píng)分為0.25。利用此方法來(lái)客觀評(píng)價(jià)牙本質(zhì)小管暴露情況。

1.5 激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)觀測(cè)粘接界面樹(shù)脂滲透情況

Rhodamine B是由電中性、非游離分子組成的熒光染料，極易溶解于有機(jī)溶劑，能夠在粘接劑中均勻分布，從而獲得良好的熒光成像效果[9]，可以直觀地對(duì)樹(shù)脂突的數(shù)目與長(zhǎng)度進(jìn)行觀測(cè)，并且不會(huì)對(duì)樹(shù)脂粘接效果產(chǎn)生影響。將Rhodamine B(1 g/L)分別溶解于2種粘接劑中(Clearfil Universal Bond和All-Bond Universal)。從320目碳化硅砂紙打磨組及超聲處理組中隨機(jī)選取離體牙，按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)要求分別用上述已制備好的粘接劑與復(fù)合樹(shù)脂Z350進(jìn)行粘接。粘接過(guò)程如下：將牙本質(zhì)表面用水噴霧徹底清洗，氣槍輕吹去除多余水分(不要完全干燥)，在牙本質(zhì)表面反復(fù)均勻涂布粘接劑15 s，氣槍吹至表面看不見(jiàn)流動(dòng)的粘接劑，光照10 s后，分層堆塑復(fù)合樹(shù)脂(Z350)，形成厚度為4 mm的樹(shù)脂層，光照20 s，完成固化。粘接好的離體牙儲(chǔ)存在37 ℃蒸餾水中。24 h后用慢速切割機(jī)將各組粘接好的離體牙沿頰舌向垂直于粘接界面切開(kāi)，切成1.0 mm厚的薄片，用LSCM觀察各試件粘接界面的微觀形態(tài)。

1.6 樣本粘接

分別將320目碳化硅砂紙打磨組(320目)及超聲處理組(320目+C尖)隨機(jī)分為2組，按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)要求分別用All-Bond Universal和Clearfil Universal Bond粘接復(fù)合樹(shù)脂Z350。實(shí)驗(yàn)組最終分為4組即All-Bond (320目，320目+C尖)，Clearfil (320目，320目+C尖)。粘接過(guò)程如步驟1.5中所述。粘接好的離體牙儲(chǔ)存在37 ℃蒸餾水中備用。

1.7 切割試件

利用慢速切割機(jī)將各組粘接好的離體牙切割成長(zhǎng)方體形微拉伸試件，粘接面積約1.0 mm×1.0 mm，試件長(zhǎng)度需≥8.0 mm(圖1)。體視顯微鏡下排除有裂紋及粘接界面有釉質(zhì)的試件后，儲(chǔ)存在37 ℃蒸餾水中。

1.8 微拉伸粘接強(qiáng)度測(cè)試

利用電子游標(biāo)卡尺測(cè)量試件粘接界面處的厚度(a)和寬度(b)，計(jì)算粘接面積(S=a×b)。將微拉伸試件粘固在微拉伸測(cè)試儀上，保持加載頭與試件長(zhǎng)軸在同一直線上，設(shè)置加載速度為0.5 mm/min，直至試件粘接界面斷裂，此時(shí)得到最大載荷力F。微拉伸粘接強(qiáng)度=最大載荷力÷粘接面積。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS 23.0軟件，使用雙因素方差分析(two-way analysis of variance)對(duì)牙本質(zhì)表面處理方式和樹(shù)脂粘接劑類型進(jìn)行分析，并判斷兩者的交互作用。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 掃描電子顯微鏡結(jié)果

SEM結(jié)果顯示(圖2)，經(jīng)過(guò)320目碳化硅砂紙打磨后牙本質(zhì)表面玷污層劃痕明顯，牙本質(zhì)小管幾乎完全被碎屑堵塞，未見(jiàn)明顯牙本質(zhì)小管暴露；而經(jīng)過(guò)C尖超聲處理之后，牙本質(zhì)表面玷污層劃痕不明顯，可見(jiàn)大量牙本質(zhì)小管暴露。對(duì)放大2 000倍的電鏡圖片進(jìn)行量化分析，統(tǒng)計(jì)牙本質(zhì)小管暴露評(píng)分之和，結(jié)果顯示超聲處理后牙本質(zhì)小管暴露評(píng)分明顯增加(P<0.01)。

A：牙本質(zhì)表面掃描電子顯微鏡圖;B：牙本質(zhì)小管暴露評(píng)分，**：P<0.01

2.2 樹(shù)脂滲透結(jié)果

粘接劑向牙本質(zhì)小管內(nèi)滲透形成的樹(shù)脂突性狀對(duì)粘接強(qiáng)度影響顯著，所以本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了經(jīng)過(guò)不同方法處理之后的牙本質(zhì)表面樹(shù)脂滲透情況。由圖3可見(jiàn)，相比單純的320目碳化硅砂紙打磨，經(jīng)過(guò)C尖超聲處理過(guò)后的粘接劑滲透形成的樹(shù)脂突更多更長(zhǎng)，表現(xiàn)在紅色熒光沿牙本質(zhì)小管更加滲透入牙本質(zhì)深部。

圖3 樹(shù)脂滲透的激光共聚焦顯微鏡觀察 ( ×40)

2.3 微拉伸粘接強(qiáng)度測(cè)試

所有實(shí)驗(yàn)組的微拉伸粘接強(qiáng)度結(jié)果見(jiàn)表1。All-Bond Universal和Clearfil Universal Bond的320目+C尖組的粘接強(qiáng)度均顯著高于各自的320目砂紙打磨組(P<0.05)。相同的牙本質(zhì)表面處理?xiàng)l件下，All-Bond Universal和Clearfil Universal Bond的粘接強(qiáng)度無(wú)顯著差異。

表1 通用型樹(shù)脂粘接劑微拉伸粘接強(qiáng)度

3 討 論

在牙本質(zhì)打磨切割過(guò)程中不可避免會(huì)有玷污層的產(chǎn)生，它是一層由變性有機(jī)物和無(wú)機(jī)物碎屑混合血液、唾液及牙本質(zhì)小管滲出液形成的不定型結(jié)構(gòu)[10]，如圖2所示，牙體預(yù)備后，厚而粗糙的玷污層會(huì)直接堵塞牙本質(zhì)小管，常規(guī)用氣槍進(jìn)行水噴霧沖洗，并不能對(duì)玷污層的去除產(chǎn)生積極作用。有研究證明在自酸蝕粘接系統(tǒng)中，較厚的玷污層會(huì)中和粘接劑中的酸性單體，從而影響粘接劑向牙本質(zhì)小管的滲透，降低粘接強(qiáng)度[2]。

當(dāng)通用型樹(shù)脂粘接劑采用酸蝕-沖洗方式，可以通過(guò)強(qiáng)酸完全去除表面玷污層，提高粘接強(qiáng)度，但面臨著與傳統(tǒng)酸蝕-沖洗方式相同的弊端即術(shù)后敏感、技術(shù)敏感性高等[11]。而通用型樹(shù)脂粘接劑采用自酸蝕粘接模式相當(dāng)于傳統(tǒng)的一步法自酸蝕粘接劑，大多屬于弱酸型(pH≈2)和超弱酸型(pH≥2.5)[12]，故本研究納入了兩種粘接劑分別為弱酸型(Clearfil Universal Bond)和超弱酸型(All-Bond Universal)，探究超聲處理對(duì)不同pH值通用型樹(shù)脂粘接劑粘接效果的影響。如圖3所示，未經(jīng)超聲處理的樹(shù)脂粘接界面無(wú)明顯的樹(shù)脂突形成，因?yàn)殓栉蹖訒?huì)中和粘接劑中的酸性單體，使得弱酸型通用樹(shù)脂粘接劑對(duì)下方牙本質(zhì)表面脫礦不足，阻礙其向牙本質(zhì)小管的滲透以及樹(shù)脂突的形成[13]。這說(shuō)明雖然pH的提高使得通用型樹(shù)脂粘接劑應(yīng)用更加安全，但同時(shí)也存在對(duì)玷污層溶解不夠、粘接強(qiáng)度低等問(wèn)題[14]。提示通用型樹(shù)脂粘接劑的自酸蝕粘接模式需要尋找一種有效的方法來(lái)處理牙本質(zhì)表面玷污層，從而提高粘接性能。

超聲器械作為牙周科以及牙體牙髓病科臨床的常用器械，利用高頻振蕩以及空穴效應(yīng)可以去除牙石、菌斑以及根管內(nèi)殘留的細(xì)菌和玷污層[15-16]。同時(shí)相對(duì)于可能會(huì)導(dǎo)致牙本質(zhì)燒焦或者融化的激光處理，超聲通過(guò)聲波介導(dǎo)的能量相對(duì)較小且安全，在輕接觸無(wú)壓力的正確操作下，不會(huì)對(duì)牙本質(zhì)內(nèi)部造成傷害[17]。同時(shí)超聲潔牙尖具有多種型號(hào)可選，C尖具有較寬的工作尖，可以增加接觸面積，提升清潔效率，減小對(duì)牙面的損傷[18]。基于此理論基礎(chǔ)，本研究利用超聲器械對(duì)牙本質(zhì)打磨后產(chǎn)生的玷污層進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)超聲處理能夠部分去除玷污層，暴露其下方牙本質(zhì)小管(如圖2A所示)。暴露的牙本質(zhì)小管，有利于粘接劑對(duì)牙本質(zhì)小管內(nèi)部的滲透，并且牙本質(zhì)表面未見(jiàn)明顯損傷痕跡，提示C尖超聲處理方式的安全性。如圖3所示，本研究中利用Rhodamine B對(duì)粘接劑進(jìn)行染色，清楚地顯示了經(jīng)過(guò)超聲處理后粘接劑向牙本質(zhì)深處滲透得更多更長(zhǎng)。超聲的機(jī)械蕩洗作用，使得玷污層被去除或者變薄，從而有利于通用型樹(shù)脂粘接劑的滲透，形成更多更長(zhǎng)的樹(shù)脂突，為提高牙本質(zhì)樹(shù)脂粘接強(qiáng)度創(chuàng)造了條件。

微拉伸強(qiáng)度結(jié)果(表1)顯示經(jīng)過(guò)C尖超聲處理的牙本質(zhì)表面，其與2種通用型樹(shù)脂粘接劑間的粘接強(qiáng)度均得到顯著提高。表1中還顯示All-Bond Universal 和Clearfil Universal Bond(pH=3.1vs. pH=2.3)間粘接強(qiáng)度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所以pH值不是決定自酸蝕粘接劑性能的唯一因素，更為重要的是粘接劑的組成成分，尤其是酸性單體的種類和濃度等[19]。通用型樹(shù)脂粘接劑向牙本質(zhì)小管的更深滲透，形成更長(zhǎng)的樹(shù)脂突，一方面增加了粘接劑與牙本質(zhì)表面間的機(jī)械結(jié)合力，另一方面，通過(guò)擴(kuò)大接觸面積，提高了通用型樹(shù)脂粘接劑與牙本質(zhì)表面間的化學(xué)結(jié)合力。本研究利用的通用型樹(shù)脂粘接劑均含有酸性功能單體10-甲基丙烯酰氧癸基磷酸酯(10-MDP)。10-MDP含有磷酸基團(tuán)，在氫離子的攻擊下，牙本質(zhì)表面淺層脫礦，10-MDP的磷酸基可與牙體中羥基磷灰石晶體(HAP)的鈣離子形成穩(wěn)定的結(jié)合[20]。超聲處理暴露了牙本質(zhì)小管口，有利于粘接劑向牙本質(zhì)小管的滲透，在提高機(jī)械固位的同時(shí)，也擴(kuò)大了與牙本質(zhì)表面接觸面積，實(shí)現(xiàn)10-MDP與更多的HAP鈣離子產(chǎn)生化學(xué)結(jié)合，從而優(yōu)化了通用型樹(shù)脂粘接劑的雙重粘接機(jī)制即“機(jī)械固位”和“化學(xué)結(jié)合”，顯著提高粘接強(qiáng)度[21-22]。

本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)初步探究了超聲處理對(duì)牙本質(zhì)表面玷污層的影響，證實(shí)了超聲振蕩能夠部分去除玷污層，暴露牙本質(zhì)小管，增加通用型樹(shù)脂粘接劑的滲透深度以及粘接強(qiáng)度，是一種具有臨床應(yīng)用潛能的方法。