牙頜發(fā)育模式及分子機制

張 然，沈宗杉，吳曉珊，王松靈

生物體的發(fā)育一直是生物醫(yī)學領域高精尖前沿研究陣地，從一個受精卵細胞發(fā)育成各種細胞、組織、器官及生物個體，這種神奇復雜的生物學過程都是發(fā)育生物學研究范疇。在口腔醫(yī)學領域，對牙和頜骨發(fā)育的研究可以全面認知口腔頜面基本結構及功能的形成過程，在此基礎上可以進一步研究疾病的發(fā)生發(fā)展機制，進而為口腔疾病診療和再生醫(yī)學打下基礎。以往牙頜發(fā)育的理論體系大多基于模式動物——小鼠，但鼠牙發(fā)育與人類存在一定的差異，所以對與人類牙頜發(fā)育較近的小型豬進行牙頜發(fā)育研究具有重要意義。另外，學者們正在創(chuàng)造條件研究人類牙頜發(fā)育模式與分子調(diào)控系統(tǒng)，這將極大推進牙頜發(fā)育理論體系。

1 牙發(fā)育

牙發(fā)育分為三個主要階段：牙胚發(fā)生期、牙冠形成期和牙根形成期。小鼠牙發(fā)育始于胚胎期第11.5天(E11.5)，人牙發(fā)育始于胚胎第8周?？谇簧掀ぴ谖磥沓裳赖奈恢镁植吭龊裥纬裳腊澹S著進一步發(fā)育，牙板局部上皮增生，形成馬蹄狀的上皮細胞團，形似花蕾，是最早的成釉器，也是牙發(fā)育的起始階段，叫蕾狀期(bud stage)[1]。隨后，蕾狀期上皮不斷生長、增大，約在人胚胎期第10周時，上皮細胞的形態(tài)開始發(fā)生變化。由于成釉器上皮外層的細胞生長速度較快，靠近釉結區(qū)的細胞生長較慢，使上皮細胞形成中央?yún)^(qū)凹陷，形狀似帽子，稱帽狀期(cap stage)。約在人胚胎期第12周時，成釉器結構分化形成外釉上皮、內(nèi)釉上皮和星網(wǎng)狀層。隨著成釉器的進一步增大，牙胚進入鐘狀期(bell stage)，鐘狀期牙胚成釉器的發(fā)育接近成熟，從內(nèi)向外可分為4層：內(nèi)釉上皮層、中間層、星網(wǎng)狀層、外釉上皮層。內(nèi)釉上皮由單層的柱狀細胞組成，外釉上皮由立方狀細胞組成，兩者在牙頸部相連，形成頸環(huán)結構。頸環(huán)進一步向未來根尖孔的方向生長，形成上皮隔，上皮隔的發(fā)育決定了牙根的數(shù)目[2]。

上皮隔形成后，其位置相對較為固定，此時牙冠已經(jīng)形成并逐漸向冠方移動，頸環(huán)處細胞增生并逐漸延伸，形成赫特維希上皮根鞘(Hertwig′s epithelial rest，HERS)。伴隨著HERS的形成，牙胚根方的間充質細胞被劃分成兩部分：HERS內(nèi)側的牙乳頭細胞和包繞著HERS的外側牙囊細胞。牙乳頭細胞和內(nèi)釉上皮的基底膜接觸，在其誘導下分化形成未來的根部成牙本質細胞。成牙本質細胞分泌基質并礦化形成根部牙本質。隨著根部牙本質的形成，HERS發(fā)生斷裂，形成Malassez上皮剩余。外部的牙囊細胞通過斷裂的HERS和新生成的根部牙本質相接觸，分化形成成牙骨質細胞并分泌形成根部牙骨質[3-4]。與此同時，牙囊細胞分泌膠原纖維埋入新生成的牙骨質中，將牙根固定在牙槽窩內(nèi)。牙根形成1/2或3/4時，牙尖開始萌出進入口腔內(nèi)。牙萌出后的一段時間里，牙根還要繼續(xù)發(fā)育，待根尖部完全形成時，牙的發(fā)育才算完成[5]。

1.1 牙發(fā)育精細化調(diào)控

牙發(fā)育是一個精細化調(diào)控的過程，包含關鍵基因的序列、時空性表達，上皮和周圍間充質細胞之間相互作用，以及以釉結為代表的特殊細胞群對牙形態(tài)的精準調(diào)控等多事件。這些關鍵時期的關鍵生物學事件，對牙發(fā)育的精細化調(diào)控至關重要(圖1)。

按照基因在牙發(fā)育中的功能，筆者將牙發(fā)育中的功能分子簡要分類為：形態(tài)發(fā)生相關分子、能量代謝相關分子及微環(huán)境穩(wěn)態(tài)相關分子。

1.1.1 形態(tài)發(fā)生相關分子

和牙胚形態(tài)發(fā)生密切相關的分子主要為經(jīng)典的五大信號家族，Wnt、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)、Sonic hedgehog (Shh) 以及成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)信號通路。

Wnt信號通路有19個Wnt蛋白配體和10個受體，經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路傳遞過程可概述為：當Wnt配體缺失的時候，細胞質內(nèi)的β-catenin蛋白持續(xù)被Axin蛋白復合體(Axin/APC/CK1/GSK3)降解。CK1和GSK3可依次磷酸化β-catenin。特定位點被磷酸化的β-catenin被E3泛素連接酶β-Trcp識別，經(jīng)歷泛素化后被蛋白酶體降解，從而使胞質中的β-catenin維持在較低的濃度。當Wnt蛋白出現(xiàn)的時候，Wnt蛋白和細胞表面的卷曲蛋白(frizzled, Fzd)以及LRP5/6蛋白形成的共受體結合。結合后通過抑制下游Axin蛋白復合物活性，從而抑制細胞內(nèi)信號分子β-catenin的降解。隨后β-catenin進入胞核，與LEF/TCF轉錄因子家族結合，共同調(diào)節(jié)下游靶基因的轉錄。Wnt/β-catenin信號通路參與調(diào)節(jié)多個生物學發(fā)育過程，包括細胞增殖、細胞遷移以及細胞分化等[6]。

在早期牙發(fā)育啟動中，Wnt信號通路非常關鍵。臨床中，約46%的人類無牙癥患者攜帶WNT10A或AXIN2基因的突變，在小鼠模型中Lef1或組織特異性在上皮或間充質細胞中失活β-catenin基因，小鼠牙發(fā)育停滯在蕾狀期[7-10]。在小鼠口腔上皮細胞中過表達β-catenin則導致多生牙的發(fā)生[11]。Wntless(Wls)是調(diào)節(jié)Wnt配體分泌的一個重要蛋白，Wls基因的缺陷可導致Wnt配體分泌障礙，通過構建在早期牙源性上皮特異性Wls基因敲除的小鼠模型，阻斷早期牙源性上皮中Wnt配體的分泌，發(fā)現(xiàn)牙乳頭細胞分化障礙[12-13]。相比牙冠發(fā)育，Wnt信號通路在牙根發(fā)育中的研究較少。先前的研究觀察到Wnt/β-catenin信號通路靶基因Axin2可聚集表達在發(fā)育中的HERS細胞以及根部牙乳頭細胞中，與Wnt10a的表達模式較為一致，提示W(wǎng)nt信號通路在牙根發(fā)育中具有一定功能[14]。通過在成牙本質細胞中過表達β-catenin基因，成牙本質細胞提前分化成熟，牙根發(fā)育異常[15]。值得一提的是，成牙本質細胞特異性敲除β-catenin基因后，其分化完全受阻，細胞增殖能力和對照小鼠相比明顯減弱，根部牙本質缺如。這說明β-catenin介導的信號通路在根部成牙本質細胞分化、增殖中具有決定性作用[16]。此外，一些體內(nèi)外研究均證實，在牙根發(fā)育的過程中，Wnt信號通路還可調(diào)節(jié)成牙骨質細胞的增殖和分化[17]。

TGF-β/BMP信號通路對成牙本質細胞分化具有重要的作用。在發(fā)育中的成牙本質細胞中，可以檢測到TGF-β1的表達。分析其表達模式推測TGF-β1可促進成牙本質細胞的終末分化[18]。牙源性間充質細胞中特異性敲除Smad4，導致經(jīng)典Wnt信號通路抑制分子Dkk1、Sfrp1的表達下調(diào)，成牙本質細胞中Wnt信號通路活化從而使其分化命運發(fā)生改變，髓腔中出現(xiàn)類似于骨樣結構的鈣化團塊；在根部成牙本質細胞中敲除Tgfbr2同樣可以導致細胞分化命運的改變，成牙本質細胞不再具有成牙本質細胞的特征(表達Dspp)，轉而表達成骨分化標志分子Ibsp[19-20]。先天無牙的患者可攜帶BMP4的基因突變，Bmp4突變的小鼠，牙胚發(fā)育停滯在蕾狀期。在分化中的成牙本質細胞中敲除Bmp4可引起冠部、根部成牙本質細胞的分化障礙，冠部和根部的牙本質厚度均有明顯的降低，髓腔變大，類似牛牙[21-22]。在HERS特異性敲除Smad4基因的小鼠中，發(fā)現(xiàn)牙源性上皮中Smad4介導的TGF-β/BMP信號通路對間充質中Nfic的表達非常關鍵，而Nfic正是調(diào)節(jié)根部成牙本質細胞分化的關鍵因子[23]。TGF-β1在牙周組織的形成中也具有重要的調(diào)控作用[24]。

Shh信號通路與牙冠、牙根的發(fā)育密切相關。Shh表達在早期牙上皮發(fā)育啟動的位置，Shh信號通路相關的分子，Patched1、Smo、Gli1、Gli2和Gli3表達在周圍間充質細胞中[25]。牙根發(fā)育過程中，Shh和Patched2表達在HERS中，Patched1、Smo和Gli1表達在HERS、根部牙乳頭細胞以及牙囊細胞中[26]。在間充質突變Patched1的小鼠中，HERS周圍的細胞增殖減弱，磨牙萌出異常伴隨著所有磨牙牙根和對照小鼠相比均縮短，提示Shh信號通路在牙根發(fā)育中具有重要功能[27]。此外，Shh可部分挽救HERS特異性敲除Smad4而導致的無牙根小鼠表型，表明Smad4介導的Shh信號通路在調(diào)控牙根發(fā)育中起到了重要作用[23]。

在牙冠發(fā)育過程中，F(xiàn)gfs可表達在牙源性上皮以及間充質中，然而在出生后小鼠牙發(fā)育過程中，F(xiàn)gfs表達模式發(fā)生改變。在蕾狀期和鐘狀期時Fgf3和Fgf10表達在間充質中，出生后其表達量顯著下調(diào)。在小鼠切牙中，表達在切牙間充質中的Fgf3和Fgf10用以維持干細胞在切牙唇側頸環(huán)處的增殖活性[28]。而在磨牙發(fā)育中，F(xiàn)gf10在牙根發(fā)育前表達消失。如果在牙冠向牙根發(fā)育轉化期間，在根部持續(xù)過表達Fgf10，HERS因無法延伸而膨大，牙根發(fā)育異常[29]。FGF-2表達在根部正在分化中的成牙本質細胞，以及成牙骨質細胞中，并且可以促進再植牙牙周膜的形成和防止牙根吸收[30]。

1.1.2 能量代謝相關分子

能量代謝對機體發(fā)育十分重要，牙早期發(fā)育的過程中，多種能量代謝相關分子參與牙發(fā)育過程，其中作為代表的有三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)、環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)、去乙酰化酶(sirtuins 3, SIRT3)等。成牙本質細胞可以通過釋放ATP來響應外界的物理刺激，從而產(chǎn)生痛覺。通過加入磷脂酶C抑制劑，阻斷ATP受體和Gq/11蛋白的耦合，在成牙本質細胞中可觀察到鈣動員被抑制。鈣相關的ATP受體亞型在牙某個特定的細胞亞群中特異性高表達，提示細胞外ATP是成牙本質細胞功能的潛在信號媒介。SIRT4是位于線粒體的基因，通過催化一系列反應來調(diào)節(jié)線粒體中ATP的生成。在成牙本質細胞分化過程中，SIRT4隨著細胞分化而表達增強，Sirt4敲除引起成牙本質細胞分化和礦化的下調(diào)[31]。

1.1.3 微環(huán)境穩(wěn)態(tài)相關分子

牙發(fā)育除了受內(nèi)在因素的調(diào)控，還需要外在因素(微環(huán)境)的共同調(diào)節(jié)，其中微環(huán)境對決定細胞分化命運方面起著關鍵作用。微環(huán)境由直接影響細胞或細胞周圍條件的因素構成，這些因素通過與細胞的動態(tài)相互作用直接或間接地影響細胞生物學行為。和微環(huán)境相關的因素包括炎性微環(huán)境、低氧微環(huán)境、力學微環(huán)境以及細胞外基質等，這些微環(huán)境相關的因素穩(wěn)態(tài)維持對正常牙發(fā)育至關重要。

炎性介質如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素(interleukin，IL)的產(chǎn)生可使牙髓等組織處于炎性微環(huán)境中。利用牙本質基質蛋白1(dentinmatrixprotein1,Dmp1)-Cre工具小鼠在牙髓和牙槽骨中過表達TNF-α可引起繼發(fā)性的牙髓炎和骨喪失[32]。低氧條件對早期胚胎發(fā)育是一個關鍵因素，這一過程受缺氧誘導轉錄因子-1(hypoxia-inducible transcription factor-1，HIF-1)的調(diào)控，在體外牙胚培養(yǎng)體系中加入HIF-2α抑制劑可顯著抑制牙胚大小，同時可以促進成釉細胞的分化[33]。外界的機械應力可刺激力學感受器激活細胞內(nèi)信號通路，能改變細胞形態(tài)、結構甚至調(diào)控細胞的功能。機械應力在牙發(fā)育中廣泛存在，在牙發(fā)育初期，牙板期向蕾狀期轉化時，上側的牙板細胞平面收縮，產(chǎn)生引導牙板上皮彎曲的側向拉力，導致牙上皮內(nèi)陷，這種側向拉力可能和細胞運動相關的蛋白，例如肌動蛋白、肌球蛋白有著聯(lián)系。通過對機械應力系統(tǒng)重要分子肌動蛋白纖維(F-actin)、非肌肉肌球蛋白ⅡB(non-muscle myosin ⅡB，NMⅡB)在牙發(fā)育早期的各個時期免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，機械應力參與牙早期發(fā)育過程[34]。此外，筆者課題組的研究發(fā)現(xiàn)，乳恒牙之間的內(nèi)應力可抑制恒牙的啟動發(fā)育，該內(nèi)應力的釋放可激活恒牙的發(fā)育[35]。因此，力學微環(huán)境調(diào)控很可能會成為牙形態(tài)調(diào)控的一個有效靶點。多細胞有機體中，細胞周圍由多種大分子組成的復雜網(wǎng)絡稱為細胞外基質(extracellular matrix, ECM)。每種組織的ECM都有特定的特征，指導該組織的分化、遷移以及免疫反應等功能。DMP1是一種酸性氨基酸的非膠原蛋白，在骨和牙本質的ECM中均有表達。DMP1通過和牙本質涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein, DSPP)的啟動子區(qū)結合調(diào)控成牙本質細胞的分化。DSPP是小分子整聯(lián)蛋白結合配體N-連接糖蛋白家族成員，DSPP在成牙本質細胞中富集高表達，在骨中表達量極低。DSPP可啟動羥基磷灰石晶體的成核過程，在基質礦化和信號轉導中具有廣泛且關鍵的作用[36]。

1.2 上皮與間充質相互作用

以牙為代表的外胚層來源的器官在早期發(fā)育均離不開上皮和間充質的相互作用，在牙發(fā)育的不同階段，上皮和間充質的相互作用具有不同特點(圖2)。

圖2 牙發(fā)育期上皮和間充質相互作用模式圖

1.2.1 牙發(fā)育早期上皮和間充質的相互作用

牙發(fā)育早期信號來自上皮，隨后信號從上皮轉移到間充質。在小鼠中，小鼠牙源性上皮成全牙能力在蕾狀期由上皮轉移到了間充質，表現(xiàn)為小鼠蕾狀期之前的上皮可以誘導非牙源性間充質細胞成牙。而在人中，人牙源性上皮這種成牙能力從上皮到間充質的轉換發(fā)生于帽狀期到鐘狀期[37]。在E10小鼠中，未來形成前牙的口腔外胚層的部位表達Bmp4，在隨后的蕾狀期和帽狀期，Bmp4表達從上皮細胞轉移到上皮下方間充質，Bmp4表達異常引起牙發(fā)育停滯[22，38]。此外， 間充質細胞可響應來自牙上皮的信號，表現(xiàn)為Msx1、Pax9等基因表達上調(diào)。Msx1不僅調(diào)節(jié)Bmp4等牙發(fā)育重要基因，也可向牙上皮提供反饋信號[39]。

牙上皮釋放Shh信號分子作用周圍間充質，在牙發(fā)育早期同樣起重要作用。Ptch1、Smo、Gli1、Gli2和Gli3等Shh信號相關分子在早期牙上皮尤其是釉結中高表達。牙上皮釋放Shh 信號分子作用周圍間充質，可促進間充質細胞增殖，調(diào)節(jié)牙形態(tài)發(fā)生。抑制Shh 信號分子，不僅導致牙上皮細胞的增殖活性受到抑制，不能發(fā)生內(nèi)陷折疊，無法分化為具有成牙功能的成釉細胞，還會影響周圍間充質細胞形成牙本質，導致牙發(fā)育異常[40]。

牙上皮分泌的 FGF信號分子誘導間充質Msx1、Pax9表達對于牙發(fā)育至關重要。牙上皮和間充質高表達FGF信號通路相應受體Fgfr1和Fgfr2，F(xiàn)GF信號通路異常導致牙上皮增殖異常，間充質細胞凋亡增加，影響牙形態(tài)及萌出[41]。牙上皮和間充質的 FGF信號受Wnt信號通路調(diào)節(jié)，抑制上皮中Wnt 信號會導致Eda表達減少，下游主要效應分子Fgf20下調(diào)導致牙數(shù)量、大小異常，牙尖扁平[42]。因此，F(xiàn)GF、Wnt信號在牙上皮細胞內(nèi)陷、形態(tài)發(fā)生以及牙上皮、間充質增殖、分化中具有重要作用。

1.2.2 牙本質和牙釉質形成過程中上皮和間充質相互作用

牙本質和牙釉質形成于鐘狀期間充質和上皮交界，受上皮、間充質中BMP、FGF、Shh和 Wnt等信號調(diào)節(jié)。BMP信號通路具有誘導成釉細胞、成牙本質細胞分化的作用，在牙本質、釉質形成中起關鍵作用，相關分子異常導致牙本質和牙釉質形成障礙。例如，BMP信號通路關鍵分子Smad4缺失，小鼠成牙本質細胞分化缺陷，形成異位骨樣結構而非牙的結構[43]；Bmp2缺失，切牙牙釉質層變薄的、礦化程度降低[44]。Wnt信號同樣參與成釉細胞、成牙本質細胞分化，與釉質、牙本質形成關系密切。上皮中Wnt信號缺失導致成牙本質細胞分化障礙，成牙本質細胞標志物Dspp下調(diào)，牙本質厚度減少，而上調(diào)β-catenin激活 Wnt 信號，會導致牙本質和牙骨質過度形成[45]。Wnt信號缺失也會引起牙源性上皮細胞增殖、存活受影響，成釉上皮形成受阻，牙大小、形態(tài)發(fā)生明顯異常，而間充質的BMP等信號能反饋調(diào)節(jié)上皮細胞中的Wnt信號[46]。上皮和間充質間BMP、Wnt等信號通路的精密調(diào)節(jié)，在釉質、牙本質形成中至關重要。

1.2.3 牙根形成中上皮和間充質相互作用

牙根發(fā)育主要由牙上皮來源的HERS和神經(jīng)嵴來源的牙髓干細胞介導形成。HERS作為信號中心，通過調(diào)控HERS基因表達，可影響牙根大小，形狀和數(shù)量。BMP信號在牙上皮、間充質中高表達，參與HERS形成。BMP-Smad4-SHH-Gli1信號參與調(diào)節(jié)牙上皮干細胞的命運，牙上皮中BMP信號的缺失導致Shh信號激活，牙上皮干細胞持續(xù)存在，HERS的形成受阻，牙根不能形成[45]。HERS的上皮細胞分泌Shh在牙根形成中也至關重要，分泌Shh作用間充質細胞并介導其分化，最終形成牙根。核因子Ic(Nfic)敲除小鼠的牙冠正常，牙根形成缺陷，HERS缺失Shh會抑制周圍間充質Nfic表達。因此，Shh是HERS-間充質相互作用的重要信號分子，調(diào)節(jié)牙根形成。

1.3 釉結對牙尖和牙冠形態(tài)的調(diào)控

牙板從蕾狀期到帽狀期發(fā)育過程中，原發(fā)釉結信號發(fā)揮重要作用。原發(fā)釉結位于牙上皮的基底層，通過產(chǎn)生Wnt、Shh、BMP、TGF-β和FGF等信號，調(diào)節(jié)周圍牙上皮增殖并影響牙形態(tài)發(fā)生。原發(fā)釉結細胞表達Bmp2、Bmp4和細胞周期抑制蛋白P21(Cdkn1a)，影響釉結細胞增殖、凋亡，調(diào)控釉結信號中心[47]。單尖牙、多尖牙對應釉結數(shù)目、大小也有所不同，單尖牙僅形成原發(fā)釉結，不形成繼發(fā)釉結，而多尖牙則形成多個繼發(fā)釉結。關于原發(fā)釉結和繼發(fā)釉結的形成尚不清楚，原發(fā)釉結的大小和位置會影響繼發(fā)釉結的形成。

1.4 牙萌出替換

與嚙齒類動物不同，人類存在兩副牙列，即乳牙和恒牙，乳恒牙的替換是精細調(diào)控的過程。非哺乳類脊椎動物一生中存在多個牙更換周期，在不同發(fā)育階段牙板持續(xù)存在，人類只存在一套恒牙替換乳牙。恒牙牙板在乳牙處于牙胚的鐘狀期時，就已經(jīng)獨立存在于頜骨中，但恒牙啟動發(fā)育以及替換的機制不清楚。目前初步發(fā)現(xiàn)，在乳牙萌出前，乳牙的快速發(fā)育可引發(fā)頜骨內(nèi)應力，通過Integrin β1-RUNX2通路抑制恒牙牙板的啟動發(fā)育；乳牙萌出可釋放頜骨內(nèi)應力，進而激活恒牙牙板的啟動發(fā)育[48]。

牙板從帽狀期到鐘狀期，形成內(nèi)釉上皮、外釉質上皮等重要結構，并初步形成牙外形。內(nèi)釉上皮位于牙上皮內(nèi)側，是未來成牙的重要結構，外釉上皮位于牙上皮的外側，內(nèi)釉、外釉上皮間的結構稱為星狀網(wǎng)層。牙上皮周圍充滿間充質，與內(nèi)釉上皮相鄰的間充質細胞稱為牙乳頭，而外釉上皮及牙乳頭周圍的間充質細胞稱為牙囊。牙上皮延伸到下方的牙乳頭形成頸環(huán)，每一側頸環(huán)處有繼發(fā)釉結。鐘狀期后期牙冠、牙根逐步形成，上皮來源的成釉細胞形成牙釉質，間充質來源的成牙本質細胞形成牙本質。頸環(huán)處牙源性上皮進一步伸長到下方的間充質，形成HERS。HERS通過與下方間充質相互作用或通過上皮間充質轉換，未來形成牙根及牙周組織[45]。

牙冠形成后進入牙萌出期，牙穿過口腔黏膜向牙合面移動，并伴隨牙根形成。牙根的生長速率與牙冠的移動速度相一致，但目前的研究表明，牙根發(fā)育缺失對牙萌出影響有限[16，49]。牙萌出過程涉及多個精密調(diào)控的生物學過程，例如：牙胚周圍牙囊誘導破骨細胞活化，參與冠部牙槽骨的骨改建；牙冠表面的縮余釉上皮分泌多種酶，通過解離牙冠上方的軟組織，解除牙萌出的阻力?？傊?，牙萌出涉及牙囊、破骨細胞等精密調(diào)控，任何環(huán)節(jié)異常，可引發(fā)牙萌出障礙。

2 頜骨發(fā)育

2.1 頜骨發(fā)育的過程

上、下頜骨來自第一鰓弓，由顱神經(jīng)嵴細胞分化形成。在未來第一磨牙位置，神經(jīng)嵴來源的間充質發(fā)生聚集，分化成軟骨細胞并形成雙側棒狀軟骨，即梅克爾軟骨(Meckel's cartilage)，是下頜形成的模板[50]。下頜骨骨化在梅克爾軟骨周圍發(fā)生。上頜骨也由神經(jīng)嵴來源的間充質聚集分化形成，骨化時間略遲于下頜骨[51]。目前關于第一鰓弓如何差異形成上、下頜骨還未完全闡明，有學者提出的“鉸鏈和蓋帽”模型可部分解釋上下頜骨形成的差異[52]。此外，下頜骨發(fā)育模式較上頜骨復雜，前、中、后份成骨方式有所區(qū)別。一般認為下頜骨前份以軟骨成骨的方式形成正中聯(lián)合，后份髁突由次級軟骨的軟骨內(nèi)成骨形成，而下頜骨的主體中間段以膜內(nèi)成骨方式形成[51]。盡管目前認為下頜骨中間段以膜內(nèi)成骨方式形成，梅克爾軟骨在其中可能起到重要作用，因為在人類疾病和小鼠模型中，梅克爾軟骨發(fā)育受阻，影響整個下頜骨的發(fā)育。目前關于梅克爾軟骨與下頜骨發(fā)育的具體機制以及它的轉歸還未完全闡明(圖3)。

A：人梅克爾軟骨及下頜骨骨化區(qū)域時間序列變化模式；B：下頜骨前份軟骨內(nèi)成骨、中份膜內(nèi)成骨模式圖

2.2 頜骨發(fā)育中的一些特殊結構和信號通路

2.2.1 梅克爾軟骨

神經(jīng)嵴衍生間充質在下頜骨形成位置發(fā)生聚集分化形成梅克爾軟骨，作為下頜骨形成的始基。梅克爾軟骨組織學上表現(xiàn)為典型的透明軟骨，富含Ⅱ型膠原蛋白的細胞外基質包裹軟骨細胞[53]。目前認為梅克爾軟骨的正常增殖、延伸對于下頜骨發(fā)育必不可少。特定敲除顱神經(jīng)嵴細胞Sox9基因，梅克爾軟骨生長障礙，下頜骨發(fā)生嚴重缺陷，可見梅克爾軟骨在下頜骨的發(fā)育中起重要作用[54]。此外，Shh信號對梅克爾軟骨發(fā)育也至關重要，Shh缺失導致梅克爾軟骨發(fā)育障礙，下頜骨細胞凋亡增加，導致嚴重的下頜短縮[55]。

梅克爾軟骨轉歸不清楚，其降解轉歸機制是近年研究熱點。目前認為梅克爾軟骨降解與軟骨細胞自噬、凋亡及生物應力相關。小鼠E15開始，在位于下頜前份梅克爾軟骨中依次檢測到自噬調(diào)節(jié)因子 Beclin1、LC3和凋亡相關分子Caspase 3，表明軟骨細胞依次發(fā)生自噬和凋亡[56]。梅克爾軟骨降解過程也受BMP信號調(diào)控，BMP信號過度激活可維持梅克爾軟骨細胞高度增殖狀態(tài)，梅克爾軟骨中份不發(fā)生降解，經(jīng)歷軟骨內(nèi)骨化形成下頜骨[57]。表觀遺傳調(diào)控也是影響梅克爾軟骨降解的因素，組蛋白H3賴氨酸殘基的甲基化負向調(diào)控基因表達，缺乏Setdb1(負責合成組蛋白H3蛋白賴氨酸9殘基甲基化酶)可引發(fā)BMP信號激活，小鼠梅克爾軟骨降解延遲[58]。此外，周圍環(huán)境生物應力在調(diào)控梅克爾軟骨礦化和降解中也起一定作用[59]。

梅克爾軟骨與機體其他部位軟骨相比具有一些共性也存在異質性。Ihh、Sox9、Bmp7等基因在軟骨分化中起重要作用，在梅克爾軟骨與四肢軟骨均高表達[50]。但也有多個信號分子在梅克爾軟骨與四肢軟骨中表達模式并不同。例如，四肢軟骨在靜止和增殖的軟骨細胞中不表達熱休克蛋白(heat shock protein, Hsp)25，僅在肥大軟骨細胞中表達，但在梅克爾軟骨增殖的成軟骨細胞中也能檢測到Hsp25[60]。此外，Rankl特定表達在四肢軟骨肥大軟骨細胞中，但在未成熟和成熟的梅克爾軟骨細胞中也表達Rankl[61]。此外，與四肢軟骨相比，梅克爾軟骨的前體細胞來源不同，梅克爾軟骨細胞主要來源于顱神經(jīng)嵴，而肢體生長板軟骨細胞來源于中胚層，表達不同的譜系標志。

梅克爾軟骨發(fā)育缺陷在人類疾病和模式動物中均引起下頜發(fā)育異常。多種導致梅克爾軟骨短縮或缺失的模式小鼠，下頜骨也出現(xiàn)不同程度的縮短。例如，在敲除顱神經(jīng)嵴細胞Sox9的小鼠中，下頜骨嚴重縮短[54]；Fuz基因缺失小鼠梅克爾軟骨變小，下頜骨發(fā)育短縮[62]。軟骨細胞內(nèi)Fgfr3異常激活的小鼠，軟骨細胞分化異常，肥大軟骨細胞減少，導致梅克爾軟骨和下頜骨異常[63]。與小鼠類似，梅克爾軟骨缺陷會導致胎兒的下頜骨短小，從而導致無頜、小頜或下頜發(fā)育不全。短指發(fā)育不良綜合征中，人類SOX9中發(fā)生致病突變，由于梅克爾軟骨缺陷出現(xiàn)小頜畸形[64]。在Pierre-Robin綜合征中，小頜畸形對上腭抬高產(chǎn)生連鎖反應，從而導致腭裂[65]。在轉鐵蛋白受體敲除小鼠中，梅克爾軟骨未能伸展，同樣出現(xiàn)腭裂[50]。梅克爾軟骨發(fā)育缺陷在人類疾病和模式動物中均可下頜發(fā)育異常，可見梅克爾軟骨在下頜骨發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

2.2.2 上下頜骨的成骨中的信號調(diào)控

上頜骨和下頜骨主要由顱神經(jīng)嵴細胞通過膜內(nèi)成骨的方式形成。上、下頜骨具有不同的形態(tài)，其早期發(fā)育模式的差異可能與接受不同的上皮信號有關。例如，內(nèi)皮素1(endothelin1，ET1)參與介導上、下頜骨差異化形成。其主要表達在下頜突遠端的外胚層，而內(nèi)皮素受體 (endothelin receptor α， Ednra)僅在間充質中表達，ET1缺失導致下頜骨向上頜骨轉變[66]。Six1主要表達在上頜和下頜突的口腔側，負調(diào)節(jié)內(nèi)皮素信號，維持上頜特征。Six1缺失小鼠，第一咽弓的近端內(nèi)皮素信號上調(diào)，導致在顴弓處形成棒狀軟骨結構，發(fā)生類似下頜骨的轉變[66]。可見，早期上、下頜骨受不同信號分子調(diào)控，發(fā)育模式存在差異。后期骨化過程上、下頜骨大致相同，即顱神經(jīng)嵴細胞受Dlx5、Runx2等轉錄因子調(diào)控，逐步分化為成骨細胞。不同之處在于下頜骨的成骨受到梅克爾軟骨等多個結構的調(diào)控更為復雜，下面主要介紹下頜骨的成骨方式。

下頜骨中份以膜內(nèi)成骨的方式形成，其特征是間充質干細胞增殖并形成小而密的細胞簇，隨后這些干細胞分化成成骨細胞，并伴隨發(fā)生從梭形到柱狀的轉變。同時，成骨細胞產(chǎn)生類骨質的細胞外基質，富含Ⅰ型膠原纖維并能夠結合鈣鹽。類骨質組織礦化形成原始骨組織，中間有成熟的骨細胞，成骨前緣有活躍的成骨細胞。膜內(nèi)成骨受Dlx5、Runx2等基因調(diào)控。骨祖細胞中表達Dlx5，可通過誘導 Runx2表達促進成骨細胞生成。Runx2缺失小鼠成骨細胞分化受阻，不能形成骨組織。骨祖細胞分化后期，Alp和Osx表達上調(diào)，表明向成骨細胞分化。Osx也是膜內(nèi)成骨的重要調(diào)控基因，Osx缺失導致幾乎所有顱面骨缺陷[67]。

目前認為下頜骨前份通過軟骨內(nèi)成骨的方式形成正中聯(lián)合。軟骨內(nèi)成骨中，間充質細胞凝聚并分化為軟骨細胞，分泌膠原蛋白和聚集蛋白聚糖，軟骨細胞歷經(jīng)增殖、成熟、肥大，最終由于微環(huán)境的劇烈變化發(fā)生細胞凋亡，留下軟骨殘余物作為成骨細胞鋪設支架[68]。通過與報告小鼠雜交，Col10a1-Cre可示蹤肥大軟骨細胞，肥大軟骨衍生細胞在骨組織發(fā)育中可形成表達Col1a1的成骨細胞，但在正中聯(lián)合部位梅克爾軟骨轉歸目前尚缺乏確鑿證據(jù)。此外，敲除Ihh的小鼠下頜聯(lián)合部位軟骨祖細胞增殖受抑制，正中聯(lián)合部位形成障礙[69]，但該部位梅克爾軟骨以何種方式影響成骨尚不清楚。

下頜骨冠狀突、髁突和喙突主要由繼發(fā)軟骨的軟骨內(nèi)成骨形成。繼發(fā)軟骨成骨前沿部位，祖細胞同時表達Runx2、Osx 和 Sox9等成骨和成軟骨標志物，因此被稱為骨軟骨祖細胞。骨軟骨祖細胞的命運受TGF-β 等信號調(diào)控。例如，顱神經(jīng)嵴細胞缺失Tgfbr2小鼠，骨軟骨祖細胞成骨分化標志上調(diào)，即ColⅠ表達升高而Sox9表達下降，骨軟骨祖細胞傾向于成骨而不是軟骨，下頜骨近端區(qū)域的軟骨生成異常，導致下頜骨短縮[70]。顳下頜關節(jié)形成和髁突生長需要Ihh信號傳導。Ihh缺失的小鼠髁突軟骨細胞增殖均受到抑制，顳下頜關節(jié)和髁突發(fā)育嚴重障礙[71]。綜上，TGF-β、Ihh 等信號參與調(diào)控下頜后份軟骨內(nèi)成骨。

值得注意的是，下頜骨的成骨方式仍然存在很大爭議。目前認為下頜骨主體通過膜內(nèi)成骨形成，但膜內(nèi)成骨的界面與梅克爾軟骨緊密相連，梅克爾軟骨是否參與調(diào)控膜內(nèi)成骨過程以及哪一群細胞與梅克爾軟骨關系緊密尚不清楚。盡管目前認為下頜骨前份可能通過軟骨內(nèi)成骨的方式形成正中聯(lián)合，但這一結論主要通過組織學觀察得出，缺乏特定轉基因小鼠的證明。此外，下頜骨遠端區(qū)軟骨快速降解形成空隙，與軟骨內(nèi)成骨的骨、軟骨交界面的組織學表現(xiàn)差異較大，兩者間是否有區(qū)別尚不清楚。研究下頜骨成骨模式，有助于開發(fā)下頜骨乃至其他骨缺損的仿生治療策略，具有重要社會意義。

3 牙和頜骨發(fā)育中的相互作用關系

牙和頜骨有一個共同的起源：它們都起源于第一鰓弓，牙、頜骨的發(fā)育過程是一個有機整體，發(fā)育過程協(xié)同，關系緊密，影響早期下頜骨發(fā)育的突變也會影響牙的形成。例如，Msx1基因缺失小鼠下頜、牙發(fā)育異常，牙發(fā)育終止于蕾狀期。Pax9缺陷小鼠，牙槽骨缺失，牙發(fā)育停留在蕾狀期。牙胚通過釋放活性因子，介導周圍牙槽骨的改建。例如，牙胚可釋放破骨誘導因子RANKL，激活破骨細胞活性，促進牙槽骨吸收，為牙在頜骨內(nèi)的發(fā)育提供空間[72]。牙和頜骨之間的機械力也可對兩者發(fā)育及結構改建產(chǎn)生影響。牙脫落后對牙槽骨作用力降低，牙槽嵴高度下降，可見牙-頜骨間的機械力在維持頜骨穩(wěn)態(tài)中也起重要作用[73]。

4 未來展望

雖然人和小鼠之間的基因相似性高達90%，但不可否認的是，在牙發(fā)育中，小鼠模型對于研究牙形態(tài)調(diào)控以及乳恒牙列替換仍具有局限性。經(jīng)典的上皮和間充質重組實驗證實，小鼠和人牙成牙能力從上皮到間充質轉移的時期不同，開發(fā)大型哺乳動物作為牙發(fā)育的研究模型具有必要性。小型豬和人牙具有相似的數(shù)目，有前牙、磨牙豐富的牙類型，并且和人類似，存在乳恒牙雙副牙列，作為牙發(fā)育的研究模型，極具開發(fā)和應用價值。

牙和頜骨發(fā)育為有機的整體，應用先進的測序手段，如單細胞聯(lián)合空間轉錄組測序技術、單細胞開放染色質測序技術，對早期牙(尤其是啟動期)及頜骨細胞亞群的動態(tài)演變規(guī)律，細胞之間的相互作用關系，結合擬時序分析及譜系示蹤等技術手段，解析各細胞亞群的發(fā)育和分化軌跡。并且探究在分化過程中，特異性標志物的變化規(guī)律，篩選牙細胞亞群和頜骨亞群互相的特異性靶分子，通過牙、頜骨類器官及遺傳修飾小鼠等功能模型加以驗證。在完整地獲得和驗證以上信息后，篩選獲取人牙源性上皮的祖細胞，作為真正的牙再生種子細胞植入適當?shù)念M骨微環(huán)境中，人工構建牙和頜骨的一體化再生模型。相信通過幾代人的不懈努力，這一理想的牙再生模式不再是夢想。

致謝：感謝周含章女士繪制本文圖片。