賀蘭山東麓4個(gè)免埋土品種葡萄酒香氣成分比較分析

馬軍，劉成敏，單守明，雷昊，李亞川，邵潔玲

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021）

葡萄果實(shí)中存在大量通常不具有香氣屬性的前體物質(zhì)（如糖苷、氨基酸等），在釀酒過程中經(jīng)微生物、酶的作用發(fā)生一系列生化反應(yīng)，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為香氣化合物[1]。葡萄酒香氣主要來源于品種自身香氣，是人們?cè)u(píng)價(jià)葡萄酒品質(zhì)的重要指標(biāo)[2]。香氣化合物分為游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩類，其中游離態(tài)香氣對(duì)葡萄酒的香氣構(gòu)成有直接貢獻(xiàn)，而結(jié)合態(tài)香氣是在葡萄酒發(fā)酵和陳釀過程中，利用酵母分泌的糖苷酶對(duì)結(jié)合態(tài)的無味糖苷的糖苷鍵進(jìn)行水解，釋放具有香氣特性的游離糖苷配體，進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)榭蓳]發(fā)的和可感知的游離態(tài)香氣成分，從而增強(qiáng)葡萄酒的香氣感知度[1-3]。醇、酯、酸、醛酮以及萜烯類物質(zhì)是組成葡萄酒香氣的主要成分，其種類、含量、感官閾值、存在形式及其之間的相互作用因葡萄品種的不同而千差萬別，進(jìn)而決定著葡萄酒的風(fēng)味和典型性[4]。在葡萄酒香氣物質(zhì)檢測(cè)方面，HS-SPME與GC-MS技術(shù)被廣泛運(yùn)用于食品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分析檢測(cè)，這兩種方法的結(jié)合可以提高檢測(cè)靈敏度，為快速準(zhǔn)確地檢測(cè)葡萄酒揮發(fā)性成分提供了有效工具[5]。研究不同品種葡萄酒香氣特點(diǎn)，對(duì)葡萄種質(zhì)資源、葡萄和葡萄酒產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

寧夏賀蘭山東麓被認(rèn)為是我國優(yōu)質(zhì)葡萄酒產(chǎn)區(qū)，但頻繁發(fā)生的凍害嚴(yán)重制約著葡萄酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[6-7]。近年，抗逆性強(qiáng)的“北”字系山歐雜種在賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)栽培表現(xiàn)較好[8-9]，但對(duì)其釀酒品質(zhì)及葡萄酒香氣物質(zhì)方面的研究還不夠深入。為此，試驗(yàn)以‘北璽’‘新北醇’‘北全’‘北香’品種所釀葡萄酒為對(duì)象，采用頂空固相微萃取（HS-SPME）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)，檢測(cè)其香氣成分，以期為賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)品種推廣提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試品種：寧夏銀川市平吉“寧夏現(xiàn)代農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)工程技術(shù)研究中心”試驗(yàn)園4個(gè)免埋土的紅色釀酒葡萄品種（北璽、新北醇、北全和北香）。沙質(zhì)土壤，植株為7年生，均為“廠”形架式，管理方式基本一致。

1.2 主要儀器和設(shè)備

GCMS-QP 2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀和HP-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），日本島津公司；75 μm聚二甲基硅氧烷/碳分子篩/二乙烯苯（PDMS/CAR/DVB）萃取頭，美國Supelco公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 釀造工藝

在果實(shí)可溶性固形物22%左右開始采摘，參考李華[13]干紅葡萄酒小容器釀酒方法。葡萄采收分選、除梗破碎、入罐，加50 mg·L-1SO2、果膠酶35 mg·L-1、酵母150 mg·L-1，發(fā)酵溫度26 ℃。發(fā)酵期間監(jiān)測(cè)其密度變化情況，待密度降至1.00以下且不再發(fā)生變化視為發(fā)酵結(jié)束，裝瓶低溫冷藏待測(cè)。

1.3.2 葡萄酒基本理化指標(biāo)檢測(cè)

依據(jù)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》檢測(cè)酒精發(fā)酵結(jié)束后酒樣的酒精度、可滴定酸以及揮發(fā)酸[11]。采用福林-肖卡法測(cè)定單寧[11]、福林酚法測(cè)定總酚[12]。

1.3.3 HS-SPME法提取香氣

取葡萄酒樣5 mL，置于15 mL頂空瓶，并加入1 g NaCl，添加5 μL 2-辛醇（用無水乙醇稀釋200倍）作為內(nèi)標(biāo)物，密封頂空瓶，用已活化的75 μm聚二甲基硅氧烷/碳篩/二乙烯苯（PDMS/CAR/DVB）萃取頭插入頂空瓶距離液面1 cm處，置于磁力攪拌加熱臺(tái)上，60 ℃萃取30 min，使頂空瓶中的揮發(fā)性物質(zhì)達(dá)到平衡狀態(tài)，然后從樣品瓶中取出萃取頭插入GC進(jìn)樣口，解析溫度250 ℃，解析時(shí)間5 min。

1.3.4 GC-MS條件

GC條件：汽化室溫度為250 ℃；載氣為高純氦氣（純度≥99.999 %）；流速1.5 mL·min-1，采用手動(dòng)進(jìn)樣，不分流模式；柱溫箱程序升溫：起始柱溫35 ℃，保持3 min，然后以4 ℃·min-1的速度升溫至120 ℃，保持2 min，再以10 ℃·min-1升溫至230 ℃，保持8 min。MS條件：離子源溫度為200 ℃，離子能量70 eV，電離方式EI，檢測(cè)器電源350 eV。

1.3.5 定性與定量分析

將未知物圖譜與NIST 17標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行比對(duì)并初步鑒定，再結(jié)合保留時(shí)間、參考文獻(xiàn)、質(zhì)譜離子圖對(duì)香氣物質(zhì)進(jìn)行定性分析；以2-辛醇為內(nèi)標(biāo)物，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行相對(duì)定量計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用IBM SPSS Statistics 23進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，用OriginPro 2021、Microsoft Word 2016進(jìn)行繪圖，制表。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒精發(fā)酵結(jié)束后的葡萄酒基本理化指標(biāo)

由表1可知，供試葡萄酒各理化指標(biāo)除總酚外均存在顯著差異，酒精度在8.8%～12.5%（Vol，下同），‘北璽’‘新北醇’的酒精度顯著高于‘北全’和‘北香’。4個(gè)品種葡萄酒揮發(fā)酸在0.06～0.09 g·L-1，其中‘北璽’葡萄酒揮發(fā)酸最高，‘北香’最低?！卤贝肌傻味ㄋ岷匡@著高于其他品種，為11.06 g·L-1；‘北全’單寧含量最低為0.03 g·L-1。發(fā)酵結(jié)束后各酒樣總酚含量從高到低依次為新北醇＞北香＞北璽＞北全。

表1 供試樣品葡萄酒理化指標(biāo)Table 1 Physical and chemical indexes of wine samples

2.2 不同葡萄酒游離態(tài)香氣成分定性與定量分析

對(duì)4個(gè)免埋土品種的葡萄酒樣香氣成分定性與定量分析，共檢出79種揮發(fā)性物質(zhì)，包括酯類27種、醇類22種、酸類5種、醛酮類6種、萜烯類6種和其他類13種?！杯t’‘新北醇’‘北全’‘北香’分別檢測(cè)出香氣物質(zhì)種類依次為52種、33種、34種、32種，香氣物質(zhì)總量分別為7155.17、6812.43、5230.03、5105.23 μg·L-1。

2.2.1 各品種葡萄酒酯類揮發(fā)性化合物比較

由表2所示，‘北璽’‘新北醇’‘北全’和‘北香’酒樣酯類揮發(fā)性化合物種類依次為17種、14種、13種和12種，分別占各品種香氣種類的32.69%、42.42%、38.24%和37.5%，其中酯類總量分別占各品種香氣總含量48.05%、47.06%、46.73%和37.25%。各品種酯類含量差異顯著，由高到低依次為北璽＞新北醇＞北全＞北香。辛酸乙酯在4個(gè)品種酒樣中含量最高，且在‘北全’中最高，‘北香’中最低。

表2 4個(gè)葡萄酒樣品酯類香氣成分定性定量結(jié)果Table 2 Qualitative and quantitative results of ester aroma components in wine samples

‘北璽’葡萄酒特有的酯類化合物有7種，分別為柳酸甲酯、甲酸香茅酯、3-甲基戊酸異戊酯、戊酸5-羥基-2,4-二叔丁基苯基酯、環(huán)丙烷羧酸2-苯乙酯、4-(乙氧基)-2-氧代丁基-3-烯酸乙酯、乳酸乙酯?！卤贝肌咸丫铺赜械孽ヮ惢衔镉?種，乙酸己酯、順式-3-己烯醇苯乙酸酯、癸酸乙酯?！比咸丫铺赜械孽ヮ惢衔镉?種，分別為壬酸乙酯、庚酸乙酯、戊酸甲酯?！毕恪咸丫铺赜械孽ヮ惢衔镉袃煞N，分別為甲酸辛酯、己-2-烯酸乙酯。

2.2.2 各品種葡萄酒醇類揮發(fā)性化合物比較

由表3所示，‘北璽’‘新北醇’‘北全’‘北香’酒樣醇類化合物種類為17種、8種、9種、9種，分別占各品種香氣種類的32.69%、24.24%、26.47%、28.13%，其中醇類總量分別占各品種香氣總量的38.91%、42.39%、35.11%、64.01%。各品種醇類含量差異顯著，由高到低依次為北香＞新北醇＞北璽＞北全，4個(gè)葡萄酒中異戊醇和苯乙醇含量較高，且差異顯著。

表3 葡萄酒樣品醇類香氣成分定性定量結(jié)果Table 3 Qualitative and quantitative results of alcohol aroma components in wine samples

‘北璽’葡萄酒特有的醇類香氣化合物有8種，分別為(S)-3,7-二甲基-7-辛烯-1-醇、α-松油醇、芳樟醇、3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇、1-(4-甲基苯基)-1-乙醇、3,4-二羥基苯乙醇、三氟乙酰薰衣草醇、(-)-4-萜品醇。‘新北醇’特有的醇類化合物有1種，為4-甲基-1-戊醇?！比赜械拇碱惢衔镉袃煞N，分別為4-甲基-1-己醇、3-乙基-4-甲基戊烷-1-醇。3-乙基-3-戊醇化合物只有在‘北香’中被測(cè)到。

2.2.3 各品種葡萄酒酸類揮發(fā)性化合物比較

由表4所示，‘北璽’‘新北醇’‘北全’‘北香’酒樣酸類揮發(fā)性化合物種類為4種、3種、4種、3種，分別占各品種香氣種類的7.69%、9.09%、11.76%、9.38%，其中酸類總量分別占各品種香氣總量的2.33%、4.40%、8.16%、3.24%。各品種酸類含量差異顯著，由高到低依次為北全＞新北醇＞北璽＞北香。4個(gè)品種當(dāng)中辛酸含量較高且差異顯著，順序?yàn)楸比拘卤贝迹颈杯t＞北香。香葉酸只在‘北璽’中檢到，同樣(S)-2-羥基丙酸肌乳酸只在‘北全’中檢到。

表4 葡萄酒樣品酸類香氣成分定性定量結(jié)果Table 4 Qualitative and quantitative results of acid aroma components in wine samples

2.2.4 各品種葡萄酒醛酮、萜烯類揮發(fā)性化合物比較

由表5所示，‘北璽’‘新北醇’‘北全’‘北香’酒樣醛酮、萜烯類揮發(fā)性化合物種類為7種、2種、3種、2種，分別占各品種香氣種類的13.46%、6.06%、8.82%、6.25%，其中醛酮、萜烯類總量分別占各品種香氣總含量的1.84%、0.24%、0.91%、0.69%。各品種葡萄酒醛酮、萜烯類總含量差異顯著，由高到低依次為北璽＞北全＞北香＞新北醇。

表5 葡萄酒樣品醛酮、萜烯類香氣成分定性定量結(jié)果Table 5 Qualitative and quantitative results of aldehyde, ketone and terpene aroma components in wine samples

‘北璽’特有的醛酮、萜烯類化合物有6種，分別為4-甲基苯戊酮、4-(正丁氧基)苯乙酮、六氟乙酰丙酮、2-甲基戊醛、松油烯、3-甲基-6-(1-甲基乙亞基)環(huán)己烯。‘新北醇’只有2種此類化合物，分別為夫洛丙酮、辛酸異戊酯。2,4-二甲基苯甲醛、3,7-二甲基辛基-6-烯基碳酸乙酯化合物只在‘北全’中檢出?！毕恪赜谢衔镉?種，分別為β-紫羅蘭酮、(4E)-3,3,6-三甲基-1,4-庚二烯。

2.2.5 各品種葡萄酒其他類揮發(fā)性化合物比較

由表6所示，‘北璽’‘新北醇’‘北全’‘北香’酒樣其他類揮發(fā)性化合物種類為7種、6種、5種、6種，分別占各品種香氣總種類的13.46%、18.19%、14.71%、18.75%，其中其他類物質(zhì)總量分別占各品種香氣總含量的8.87%、5.90%、9.09%、10.43%。各品種其他類總量差異顯著，由高到低依次為北璽＞北香＞北全＞新北醇。氨基甲酰肼、十二甲基環(huán)六硅氧烷化合物為4個(gè)品種共有化合物且差異顯著，其中氨基甲酰肼化合物含量北香＞北全＞新北醇＞北璽；十二甲基環(huán)六硅氧烷化合物含量‘北璽’最高，‘北香’‘北全’次之，‘新北醇’最低。

表6 葡萄酒樣品其他類香氣成分定性定量結(jié)果Table 6 qualitative and quantitative results of other aroma components in wine samples

‘北璽’特有的其他類化合物有4種，分別為3-乙?；?2,5-二甲基呋喃、甲基肼、氨基甲酸銨、芐基氯。環(huán)五聚二甲基硅氧烷、丙基環(huán)丙烷只在‘新北醇’中被檢出；2,2,5,5-四甲基己烷在‘北全’被檢出；乙丙醚只在‘北香’中被檢出。

2.2.6 不同品種葡萄酒香氣成分分析

通過香氣成分定性定量結(jié)果對(duì)各品種酯類、醇類、酸類、醛酮類、萜烯類和其他類香氣化合物含量和種類進(jìn)行比較分析。由圖1可知，賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)4個(gè)免埋土品種的葡萄酒香氣成分酯類、醇類化合物含量和種類數(shù)量占比為主，各個(gè)品種其余類別香氣成分含量以及種類數(shù)量占比基本相似，體現(xiàn)了葡萄酒香氣特性，但在不同雜交改良、芽變育種過程中葡萄酒香氣化合物存在一定差異。為了進(jìn)一步分析4個(gè)品種葡萄酒的特征香氣成分，需要通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析加以判定[14-15]。

圖1 各類化合物含量占比（左）和各類化合物數(shù)量占比（右）Figure 1 Proportion of various compounds (Left) and proportion of quantity compounds (Right)

2.3 四個(gè)品種葡萄酒揮發(fā)性香氣含量主成分分析

對(duì)4個(gè)品種揮發(fā)性成分提取2個(gè)主成分（PC）。由圖2可知，酒精發(fā)酵后葡萄酒中揮發(fā)性化合物的PC1和PC2分別為50.13%和26.96%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為77.09%。4個(gè)品種的葡萄酒有較好的分布，且從揮發(fā)性成分的變量因子和葡萄酒品種的分布來看，不同揮發(fā)性成分對(duì)不同品種葡萄酒的貢獻(xiàn)有所差異。

圖2 不同品種葡萄酒香氣成分主成分分析Figure 2 Principal component analysis of aroma components of different varieties of wine

‘北璽’葡萄酒分布于第一象限，位于該象限的獨(dú)有香氣化合物明顯高于其他品種，共有化合物中辛酸乙酯、正己酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸甲酯、苯乙醇、(2S,3S)-(+)-2,3-丁二醇揮發(fā)性化合物對(duì)該品種葡萄酒香氣的貢獻(xiàn)較其他品種顯著?！比咸丫品植加诘诙笙?，對(duì)于該象限的辛酸、正癸酸、(S)-2-羥基丙酸肌乳酸、夫洛丙酮、3,7-二甲基辛基-6-烯基碳酸乙酯、1-癸醇、庚酸乙酯、戊酸甲酯揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)‘北全’葡萄酒香氣貢獻(xiàn)較其他品種顯著?！卤贝肌咸丫品植加谪?fù)半軸貼近中軸線位置，對(duì)于該位置的環(huán)五聚二甲基硅氧烷、丙基環(huán)丙烷、乙酸己酯、順式-3-己烯醇苯乙酸酯、癸酸乙酯揮發(fā)性化合物對(duì)‘新北醇’葡萄酒香氣的貢獻(xiàn)較其他品種顯著?！毕恪咸丫品植加诘谌笙蓿挥谠撓笙薜囊宜岜揭阴?、甲酸辛酯、β-紫羅蘭酮、正己醇、3-乙基-3-戊醇、辛酸異戊酯、(4E)-3,3,6-三甲基-1,4-庚二烯揮發(fā)性化合物對(duì)該品種葡萄酒香氣的貢獻(xiàn)較其他品種顯著。

3 討論

葡萄酒中的揮發(fā)性香氣成分主要由C6化合物、酸類、醇類、酯類、萜烯類等組成[16]，含量差異很大，這些香氣之間相互作用，進(jìn)行復(fù)雜的轉(zhuǎn)化，構(gòu)成了葡萄酒的特色風(fēng)味。葡萄酒的香氣取決于葡萄原料的香氣，而葡萄的香氣會(huì)受到外界因素的影響，如土壤、氣候條件、管理模式、采摘成熟度等[17-18]。Schreier[19]在1974年從葡萄中檢測(cè)出220多種揮發(fā)性化合物，其中有81種烴類、30種醇類、47種酸類、22種醛類、17種酮類、10種酯類和12種雜環(huán)化合物。Sefton等[20]在‘霞多麗’葡萄汁中檢測(cè)出181種成分，其中13-碳去甲基異戊二烯占70%左右，苯衍生物占20%左右，單萜占5%，大馬酮、γ-內(nèi)酯及一些小分子物質(zhì)占比不到6%。本研究通過賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)4個(gè)免埋土品種的葡萄酒香氣進(jìn)行了分析比較，共檢測(cè)出79種揮發(fā)性物質(zhì)，包括酯類27種，醇類22種，酸類5種，醛酮類6種，萜烯類6種和其他類13種。酯類含量占比37.25%～48.05%、醇類含量占比38.91%～64.01%，其余類別香氣化合物含量占比均在11%以下，其中4種葡萄酒中醇類和酯類香氣物質(zhì)占比較高，同產(chǎn)區(qū)的不同品種葡萄酒香氣成分具有一定差異，這與前人研究一致[21]。

此外，吡嗪類物質(zhì)主要由美拉德反應(yīng)微生物代謝，加熱分解蛋白質(zhì)和氨基酸等途徑產(chǎn)生，該物質(zhì)特殊的藥理作用又賦予其在酒中的保健功能[22]。本研究中在‘北璽’葡萄酒中檢測(cè)到呋喃類物質(zhì)，這可能與該品種在不同地區(qū)的表現(xiàn)有關(guān)。

4 結(jié)論

‘北璽’‘新北醇’‘北全’‘北香’品種分別檢測(cè)到香氣化合物依次為52種、33種、34種、32種，獨(dú)有的香氣化合物依次為30種、9種、10種、6種。所鑒定的揮發(fā)性物質(zhì)酯類、醇類、酸類、醛酮類、萜烯類、其他類香氣成分含量以及種類數(shù)量占比以‘北璽’表現(xiàn)突出，‘北全’醇類和酸類含量占比較高，‘新北醇’和‘北香’含量占比相似，4個(gè)品種以酯類和醇類為主。

對(duì)79種揮發(fā)性化合物利用主成分分析，提取兩個(gè)主成分因子分離度將個(gè)體品種進(jìn)行區(qū)分。辛酸乙酯、正己酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸甲酯、苯乙醇、(2S,3S)-(+)-2,3-丁二醇為‘北璽’主要貢獻(xiàn)特征化合物；辛酸、正癸酸、(S)-2-羥基丙酸肌乳酸、夫洛丙酮、3,7-二甲基辛基-6-烯基碳酸乙酯、1-癸醇、庚酸乙酯、戊酸甲酯為‘北全’主要貢獻(xiàn)特征化合物；環(huán)五聚二甲基硅氧烷、丙基環(huán)丙烷、乙酸己酯、順式-3-己烯醇苯乙酸酯、癸酸乙酯為‘新北醇’主要貢獻(xiàn)特征化合物；乙酸苯乙酯、甲酸辛酯、β-紫羅蘭酮、正己醇、3-乙基-3-戊醇、辛酸異戊酯、(4E)-3,3,6-三甲基-1,4-庚二烯為‘北香’主要貢獻(xiàn)特征化合物。