UPLC-MS/MS測定葡萄酒中類黃酮化合物方法的建立

王一名，衛(wèi)曉紅，王忠一，于曉靜，吳帥

（煙臺市食品藥品檢驗檢測中心，山東煙臺 264000）

類黃酮化合物是自然界存在的酚類化合物中最大的一個亞類，在植物中廣泛存在。其基本骨架具有C6=C3=C6結(jié)構(gòu)，即由2個芳香環(huán)A和B，通過中央三碳鏈相互連結(jié)而成。已經(jīng)有4000多種類黃酮化合物被分離鑒定，由于化學結(jié)構(gòu)的不同，這些化合物呈現(xiàn)出不同的特性。葡萄酒中的類黃酮根據(jù)其結(jié)構(gòu)分為黃酮、黃酮醇、黃烷酮和黃烷-3-醇等，主要包括槲皮素、楊梅素、兒茶素等組分。類黃酮物質(zhì)是葡萄酒中主要的苦味及澀味物質(zhì)[1-3]，構(gòu)成了葡萄酒的基本骨架，有助于增強酒的結(jié)構(gòu)感。在葡萄酒成熟過程中，這些苦味、澀味和酸味物質(zhì)發(fā)生變化，形成復雜的聚合物，提高味感質(zhì)量。此外，類黃酮具有抗氧化的功效，通過自身氧化可降低葡萄酒變質(zhì)的速度，有利于葡萄酒成熟過程中醇香的產(chǎn)生。在植物體內(nèi)的多酚物質(zhì)中，多數(shù)類黃酮化合物具有生理或藥理活性，對人體健康有重要作用[4]，除了可作為抗氧化劑和自由基清除劑[5]外，還能抗炎、抑菌、抗病毒、預防高血壓以及抑制血栓形成等[6-7]。越來越多的研究表明，類黃酮化合物具有很高的醫(yī)用價值，如山奈酚和槲皮素具有抗癌、心臟保護和抗炎作用[8]；槲皮素對心血管疾病高危人群的健康有積極影響；柚皮素具有神經(jīng)保護和抗氧化特性[9]。因此，研究建立一種簡便、快速、準確、靈敏并能夠同時測定葡萄酒中多項類黃酮組分的分析方法顯得尤為重要。

目前，檢測類黃酮的方法主要有分光光度法[10]、高效液相色譜法[11]、薄層色譜法[12]、毛細管電泳法[13]、核磁共振法[14]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15-16]和紅外光譜法[17]等。近年來，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法以準確度高、靈敏度好、分析速度快等特點已廣泛應用于類黃酮檢測的各個領(lǐng)域，包括植物[18-19]、中成藥[20]和食品[21]等，如毛慧慧等[22]采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分離鑒定了銀線蓮中兩種黃酮類化合物，白海玉等[23]利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對野菊花中的黃酮成分進行了分析，均取得良好的效果。但是，采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLCMS/MS），對葡萄酒進行多指標類黃酮化合物的定量分析卻少見報道。迄今為止，對葡萄酒中酚類物質(zhì)的研究報道仍以生物活性、感官特性等為主。本研究建立了一種測定葡萄酒中17種類黃酮物質(zhì)含量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，對葡萄酒中類黃酮化合物的含量進行了定量分析，結(jié)果準確、可靠，可以作為葡萄酒中類黃酮物質(zhì)定量檢測的技術(shù)依據(jù)，為葡萄酒中這類化合物的綜合分析提供參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

TQ-S超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Waters公司）；賽多利斯CPA225D型電子天平（德國賽多利斯公司）；Milli-Q型超純水機（美國Millipore公司）。

標準品（純度≥98%）：花旗松素（Taxifolin）、楊梅素（Myricetin）、楊梅苷（Myricitrin）、表兒茶素（Epicatechin）、兒茶素（Catechin）、表沒食子兒茶素（Epigallocatechin），購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；槲皮素（Quercetin）、山奈酚（Kaempferol）、蘆丁（Rutin）、刺槐苷（Robinin），購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；柚皮素（Naringenin）、沒食子兒茶素（Gallocatechin），購自上海安譜實驗科技股份有限公司；金絲桃苷（Quercetin-3-galactoside）、異槲皮苷（Quercetin-3-O-glucodise），購自上海甄準生物科技有限公司；表兒茶素沒食子酸酯（Epicatechin gallate）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate），購自壇墨質(zhì)檢；水仙苷（Isorhamnetin-3-O-glucoside），購自Panphy-chemicals。葡萄酒購買于超市。

甲酸、甲醇、乙腈（色譜純，美國Merck公司）；實驗用純水由Milli-Q超純水機（美國Millipore公司）制備。

1.2 實驗條件

1.2.1 UPLC條件

色譜柱為HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm，美國Waters公司）；流動相A為有機相（0.1%甲酸-乙腈溶液），B為水相（0.1%甲酸-水溶液）；柱溫35 ℃；流速300 μL·min-1；進樣量2 μL。洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure of mobile phases

1.2.2 MS條件

電噴霧離子源（ESI），同時采用ESI＋（毛細管電壓3.5 kV）和ESI-（毛細管電壓2.9 kV）模式切換掃描；多反應監(jiān)測模式（MRM）；離子源溫度為150 ℃，去溶劑氣溫度為500 ℃，去溶劑氣流量為1000 L·h-1，錐孔氣流量為150 L·h-1，碰撞氣流量為0.15 mL·min-1。類黃酮化合物的定性/定量離子對、碰撞能量（CE）及錐孔電壓（CV）見表2。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準品溶液和模擬酒基的配制

將標準品用甲醇溶液配制成1000 mg·L-1的標準儲備液，置于﹣20 ℃保存?zhèn)溆?。使用時，將標準儲備液用甲醇溶液逐級稀釋成所需標準工作液，且現(xiàn)用現(xiàn)配。

取120 mL食用酒精和5 g食品級酒石酸，移到1 L容量瓶中，用去離子水定容，即得到模擬酒基。

1.3.2 樣品處理

葡萄酒在分析前室溫避光保存。開瓶后，馬上轉(zhuǎn)移到棕色瓶中，以避免氧化，置于﹣4 ℃避光保存。上機前取2 mL樣品過0.22 μm濾膜過濾，也可以根據(jù)實際測定結(jié)果取樣1 mL稀釋至適當濃度，過濾膜后上機分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化

為獲得各待測化合物的最優(yōu)質(zhì)譜參數(shù)，本研究利用注射泵直接進樣，將1 mg·L-1的標準工作液以0.01 mL·min-1流速注入離子源，分別測定了每一種化合物在ESI＋和ESI-模式下的質(zhì)譜信號強度。由于類黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中既具有-OH基團，又具有堿性O原子[24]，因此在正、負離子模式下均具有相應的質(zhì)譜信號。通過對比后發(fā)現(xiàn)，槲皮素、山奈酚、楊梅苷、蘆丁等在正離子模式下的響應強度較強，因此選擇ESI＋電離模式；而柚皮素、楊梅素、兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯等化合物在負離子模式下的響應強度較強，因此選擇ESI-電離模式。在各化合物最優(yōu)的離子化模式下，分別對母離子進行碰撞解離，二級掃描得到裂解碎片離子。通過對CE的優(yōu)化選取響應值高、干擾小的碎片離子用于定性和定量分析。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 類黃酮化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometry parameters of flavonoid compounds

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 色譜柱

試驗考察了待測物在HSS T3（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）色譜柱和C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）色譜柱的保留情況，主要有峰形和響應值兩個方面的差異。從峰形來看，除表兒茶素、金絲桃苷和異槲皮苷外，其它化合物在兩只色譜柱上相差不大。在T3色譜柱上，表兒茶素、金絲桃苷和異槲皮苷的分離效果明顯優(yōu)于C18，分別見圖1和圖2。從響應值來看，所有待測物在T3色譜柱上的響應信號均高于C18。其中，刺槐苷、表兒茶素、表沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯在T3上的響應值比C18高約51%～100%；其余化合物在T3上的響應值高約14%～47%。綜合考慮色譜峰的分離效果和響應信號，選擇T3作為分析用色譜柱。

圖1 表兒茶素在不同色譜柱中的峰形對比Figure 1 Peak comparison of epicatechin in different chromatographic columns

圖2 金絲桃苷和異槲皮苷在不同色譜柱中的峰形對比Figure 2 Peak comparison of quercetin-3-galactoside and quercetin-3-O-glucodise in different chromatographic columns

2.2.2 流動相

考察了17項類黃酮化合物在不同流動相條件下的分離情況，結(jié)果表明在僅含有乙腈和水的液相條件下，花旗松素、楊梅素、山奈酚、表兒茶素沒食子酸酯等化合物分離效果不佳，且峰形拖尾嚴重。在流動相中添加甲酸后這些化合物的分離效果改善，色譜圖更窄、更對稱且多數(shù)化合物的響應更強。待測物在3種流動相Ⅰ（0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液，Vol，下同）、Ⅱ（乙腈-0.1%甲酸水溶液）和Ⅲ（乙腈-水）中的響應值對比如圖3所示：以待測物在流動相Ⅰ中的響應強度為參照，柚皮素、刺槐苷、表兒茶素、兒茶素、水仙苷等5種化合物在流動相Ⅲ中的響應值高約29%～39%，但花旗松素、楊梅素、楊梅苷、沒食子兒茶素和表沒食子兒茶素沒食子酸酯在流動相Ⅲ中的響應值不足50%；待測物在流動相Ⅰ和Ⅱ中的響應差值在30%以內(nèi)，17種化合物中僅楊梅苷、山奈酚、柚皮素在流動相Ⅱ中的響應值高于Ⅰ，其余14種化合物在流動相Ⅱ中的響應值低于Ⅰ。因此，最終選用含0.1%甲酸的乙腈溶液和含0.1%甲酸的水溶液作為流動相。

圖3 不同流動相中的響應值對比Figure 3 Comparison of response value in different mobile phases

2.3 樣品處理方法的優(yōu)化

葡萄酒樣品不經(jīng)處理直接進樣時，樣品中的雜質(zhì)會對色譜柱和儀器造成污染。因此，選擇將酒樣稀釋適當倍數(shù)后過0.22 μm微孔濾膜處理較好。濾膜在去除雜質(zhì)的同時，也會吸附部分待測物。不同材質(zhì)的濾膜吸附能力不同。本文選用聚四氟乙烯（PTFE）、聚偏氟乙烯（PVDF）和尼龍（Nylon）三種型號的濾膜進行對比試驗。在模擬酒基中添加固定濃度的標準品溶液，經(jīng)濾膜過濾后，計算目標物的回收率，結(jié)果見圖4。由圖4可知，山奈酚在PTFE上的回收率最低，為70.9%，其余待測物在PTFE上的回收率均大于80%。除刺槐苷、沒食子兒茶素和水仙苷外，其它待測物在PTFE上的回收率均高于PVDF。Nylon對待測物的吸附效果最強，通過率最低。因此，本試驗選擇過0.22 μm PTFE濾膜作為樣品的前處理方式。

圖4 濾膜類型對回收率的影響Figure 4 Effect of membrane type on recovery rate

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性關(guān)系、檢出限與定量限

將混合標準儲備液用甲醇配制成系列濃度工作溶液后按1.2實驗條件上機檢測。以標準品的質(zhì)量濃度為橫坐標（X），儀器響應值為縱坐標（Y），繪制標準曲線，計算得出線性方程和相關(guān)系數(shù)，以3倍信噪比為檢出限（LOD），10倍信噪比為定量限（LOQ），結(jié)果見表3。由表3可知，待測物在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，標準曲線的線性相關(guān)系數(shù)R均大于0.99，LOD和LOQ分別為0.1～5 μg·L-1和0.3～12 μg·L-1。

表3 線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear regression equations, linear ranges, correlation coefficients, the limits of detection and quantification

2.4.2 精密度與重復性

取同一混合標準品溶液于同日不同時間點重復進樣7次以及連續(xù)7 d重復測定3次，按照本方法測定類黃酮化合物的峰面積，計算其相對標準偏差，分析待測物的日內(nèi)精密度及日間精密度，結(jié)果見表4。從表4中可以看出，各待測物峰面積的日內(nèi)和日間相對標準偏差（RSD）分別在0.92%～3.94%和1.75%～5.66%，表明該儀器具有良好的精密度。在1.3.1模擬酒基溶液中定量加入混合標準品溶液制備7份供試品，按1.3.2處理后進樣分析，計算各待測物的重復性RSD為1.42%～5.05%（表4），表明該方法的重復性良好。

表4 精密度與重復性實驗結(jié)果Table 4 Results of precision and repeatability

2.4.3 加標回收率

對實際樣品的分析表明，不同樣品中各組分濃度差異較大，因此在進行加標回收試驗時，依據(jù)各組分在實際樣品中的含量高低，在1.3.1模擬酒基溶液中加入混合標準品溶液分別制成不同質(zhì)量濃度水平的供試品溶液，每個水平做7個平行，按照1.3.2處理后進樣分析，計算各待測物的加標回收率和RSD，結(jié)果見表5。表5顯示，加標回收率在69.2%～99.8%之間，RSD在0.90%～4.58%之間，表明本方法的準確度良好。

表5 方法的回收試驗結(jié)果Table 5 Recovery test results of the method

2.5 樣品分析

從市場購買10個葡萄酒樣品，包括6個‘赤霞珠’干紅葡萄酒和4個‘霞多麗’干白葡萄酒。使用新建立的方法對樣品中的類黃酮物質(zhì)進行檢測，結(jié)果見表6。由表6可知，葡萄酒中檢出的化合物有花旗松素、槲皮素、楊梅素、楊梅苷和表兒茶素等13種組分。僅在干紅葡萄酒中檢出的化合物有槲皮素、楊梅素和山奈酚。所有樣品中均未檢出蘆丁、刺槐苷、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和水仙苷。由此可知，該方法適用于葡萄酒中類黃酮化合物的定性和定量分析。

表6 葡萄酒中類黃酮化合物的測定Table 6 Determination of flavonoid compounds in wine μg·L-1

3 結(jié)論

本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了葡萄酒中17項類黃酮化合物含量的測定方法，并對建立的方法進行了方法學驗證。結(jié)果表明，該方法簡便、快速、準確度高、靈敏度好，可以滿足葡萄酒中類黃酮物質(zhì)的準確定性和定量分析。實際樣品的分析結(jié)果表明，該方法適用于葡萄酒中類黃酮化合物的檢測。該方法的建立為進一步加強葡萄酒質(zhì)量及品質(zhì)控制提供了科學的方法參考。