貯藏年限對白三葉種子萌發(fā)、幼苗生長及生理特性的影響

呂艷敏，花 梅，張曉明，穆瀛通，李曉杰，郝 寧，奧 運，王俊杰

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學草原與資源環(huán)境學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的基本資料，其質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到后期飼草的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。種子也是植物種質(zhì)資源長期保存的理想材料，而種質(zhì)資源能夠長期保存是品種改良的前提[2]。即使在最佳條件下長期貯藏，種子活力也不可避免地會持續(xù)下降。種子老化是一個累積不可逆轉(zhuǎn)的過程。不同貯藏條件下，隨貯藏時間的增加，種子逐漸老化，使得種子發(fā)芽率[3]、發(fā)芽勢[4]、發(fā)芽指數(shù)[5]、活力指數(shù)[6]降低甚至喪失，幼苗的生長也會受到抑制[7]，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和種質(zhì)資源更新均有嚴重影響[8]。大量研究表明，膜完整性喪失、酶降解、呼吸減弱、遺傳物質(zhì)降解等是種子發(fā)生老化的主要生理表現(xiàn)[9-12]，其中，抗氧化酶作為細胞內(nèi)的自由基清除劑，能夠降低種子老化過程中自由基對種子細胞膜的攻擊，使得細胞膜脂質(zhì)的過氧化作用降低，從而降低種子老化速率[2]。近年來，已有學者對披堿草(ElymusdahuricusTurcz.)、煙草(NicotianatabacumL.)、菊苣(CichoriumintybusL.)、油松(PinustabuliformisCarr.)等種子老化進行較系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)種子老化會破壞其細胞膜的完整性，加深其脂質(zhì)過氧化損傷程度，抗氧化酶及呼吸關(guān)鍵酶的活性下降，進而導致種子活力降低[13-16]。目前，關(guān)于貯藏時間對白三葉種子活力及生理生化特性變化規(guī)律的研究鮮有報道。白三葉(TrifoliumrepensL.)是一種營養(yǎng)價值高、草質(zhì)細嫩、產(chǎn)量高的優(yōu)質(zhì)豆科牧草[17-18]，且植株低矮、再生能力強，在國內(nèi)外城市綠化、水土保持、生態(tài)環(huán)境保護中具有重要地位[19]。本研究中的白三葉新品系是內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學王俊杰教授團隊以野生白三葉為原始材料，通過人工栽培馴化選育而成的，具有較強的抗寒性，可在內(nèi)蒙古地區(qū)大面積推廣種植，解決白三葉在內(nèi)蒙古地區(qū)無法越冬的問題。本試驗以貯藏0～5年的白三葉新品系種子為試驗材料，通過測定種子萌發(fā)指標、幼苗生長及生理指標，探討白三葉種子老化規(guī)律，以期為白三葉種質(zhì)資源的安全保存和在實際生產(chǎn)中提高種子質(zhì)量提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

白三葉新品系是內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學王俊杰教授團隊以內(nèi)蒙古大興安嶺山區(qū)野生白三葉為原始材料，經(jīng)多年多代人工栽培、馴化、系統(tǒng)選育而成的耐寒型白三葉。供試材料種子產(chǎn)自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學試驗田，分別于2021，2020，2019，2018，2017，2016年收獲，置于種子儲藏柜中避光貯藏(恒溫4℃、濕度30%)。分別在貯藏0，1，2，3，4，5年后進行發(fā)芽試驗和生理指標的測定。

1.2 種子萌發(fā)及幼苗生長指標的測定

使用5%的NaClO溶液對種子消毒10 min，蒸餾水反復(fù)進行沖洗，濾紙吸干水分備用。將100粒種子均勻放入鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿(d=12 cm)中，再將培養(yǎng)皿置于20℃人工智能培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，4次重復(fù)。以胚根突破種皮視為發(fā)芽種子，每日統(tǒng)計發(fā)芽的種子數(shù)量，第4 d計算發(fā)芽勢(Germination potential，GP)。于第10 d統(tǒng)計發(fā)芽率(Germination rate，GR)、發(fā)芽指數(shù)(Germination index，GI)和活力指數(shù)(Vigour index，VI)，測定幼苗的芽長(Bud length，BL)、根長(Root length，RL)以及鮮重(Fresh weight，F(xiàn)W)。

活力指數(shù)(VI)=GI×FW[1]

其中，式中，Gt為t日的發(fā)芽種子數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

1.3 種子相對電導率、抗氧化酶及呼吸關(guān)鍵酶活性的測定

相對電導率的測定：參照郝楠等[21]的方法，分別從不同貯藏年限中選取種皮完整的種子100粒，稱重后放入燒杯中，加入250 mL去離子水，用電導儀測定初始電導率；用保鮮膜將燒杯封口，室溫下靜置24 h,測量種子浸出液電導率，3次重復(fù)取平均值。

抗氧化酶活性的測定：超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性采用氮藍四唑法[22]測定,過氧化物酶(Peroxidase，POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法[22]測定,過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性采用高錳酸鉀滴定法[22]測定，3次重復(fù)取平均值。

呼吸關(guān)鍵酶活性的測定：細胞色素C氧化酶(Cytochrome coxidase，COX)和異檸檬酸脫氫酶(Isocitrate dehydrogenase，ICDH)活性采用分光光度法[22]測定；酸性磷酸酶(Acid phosphatase，APA)活性采用比色法[23]測定；蘋果酸脫氫酶(Malate dehydrogenase，MDH)活性采用紫外吸光光度法[24]測定，3次重復(fù)取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2019進行數(shù)據(jù)整理，SPSS 27.0對數(shù)據(jù)進行方差分析，OriginPro 2021軟件制圖。

利用模糊數(shù)學隸屬函數(shù)法[25]對不同貯藏年限下的白三葉種子質(zhì)量進行綜合評價，首先分別計算出各指標的隸屬函數(shù)值，然后按照隸屬函數(shù)值的平均值進行排名。

如果某個指標與種子質(zhì)量正相關(guān)，計算公式如下：

如果某個指標與之負相關(guān)，則用反隸屬函數(shù)進行計算，計算公式如下：

式中：U(Xi)為隸屬函數(shù)值，Xi為某個指標的測定值，Xmax和Xmin為所有處理中某個指標的最大值和最小值。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏年限對白三葉種子萌發(fā)的影響

貯藏1年的種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)顯著高于貯藏3～5年的種子(P<0.05)(圖1)。其中，白三葉種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢隨貯藏時間的增加呈先上升后下降的趨勢，0～2年貯藏期內(nèi)，白三葉種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢無顯著差異，貯藏3年的種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢開始顯著下降，到貯藏5年時，白三葉種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢均顯著低于其他各貯藏年限(P<0.05)(圖1A,圖1B)。隨貯藏年限增加，白三葉種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)變化趨勢一致，其中，貯藏1年的的種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)顯著高于其他貯藏年限(P<0.05)；貯藏2～3年的種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)顯著高于貯藏4～5年的種子(P<0.05)，貯藏4年的種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)顯著高于貯藏5年的(P<0.05)，貯藏5年的種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)顯著低于其他各貯藏年限(P<0.05)(圖1B,圖1C)。

圖1 不同貯藏年限白三葉種子萌發(fā)指標的變化

2.2 貯藏年限對白三葉幼苗生長的影響

隨貯藏年限的增加，白三葉幼苗芽長、根長及鮮重呈先上升后下降的趨勢，且各指標均在貯藏1年表現(xiàn)最佳(表1)。其中1～5年貯藏期內(nèi)，白三葉幼苗芽長和根長逐漸下降，表現(xiàn)為各貯藏年限間差異顯著(P<0.05)。白三葉幼苗鮮重在貯藏1年時達到最大值為0.56 g，顯著高于其他各貯藏年限(P<0.05)；貯藏2年的白三葉幼苗鮮重顯著高于貯藏4，5年的(P<0.05)；貯藏4年的白三葉幼苗鮮重顯著高于貯藏5年的(P<0.05)；貯藏5年的白三葉幼苗鮮重顯著低于其他各貯藏年限(P<0.05)。

表1 貯藏年限對白三葉幼苗生長的影響

2.3 貯藏年限對白三葉種子相對電導率及抗氧化酶活性的影響

白三葉種子相對電導率隨貯藏年限的增加呈上升趨勢，其中，貯藏0年的種子相對電導率最低，為6.69%，顯著低于貯藏2～5年的種子(P<0.05)，貯藏2～3年的種子相對電導率顯著低于貯藏4～5年的(P<0.05)，貯藏4年的種子相對電導率顯著低于貯藏5年的(P<0.05)(圖2A)。白三葉種子POD活性在0～4年貯藏期內(nèi)無顯著差異，平均值為7.02 U·g-1；貯藏5年的種子POD活性顯著低于貯藏0，1年的(P<0.05)，僅為5.40 U·g-1(圖2B)。隨貯藏時間的增加，白三葉種子SOD和CAT活性逐漸下降，其中，0～2年貯藏期內(nèi)，SOD和CAT活性無顯著差異；貯藏4年后，其活性開始顯著下降，到貯藏5年時，SOD和CAT活性顯著低于其他各貯藏年限(P<0.05)(圖2C,圖2D)。

圖2 不同貯藏年限白三葉種子相對電導率及抗氧化酶活性的變化

2.4 貯藏年限對白三葉種子呼吸關(guān)鍵酶活性的影響

隨貯藏年限的增加，白三葉種子COX，MDH，ICDH活性呈下降趨勢(圖3)。其中，貯藏0年的種子COX，MDH，ICDH活性顯著高于貯藏2～5年的(P<0.05)，貯藏1年的種子COX，MDH，ICDH活性顯著高于貯藏4～5年的(P<0.05)，貯藏2～3年的種子COX，MDH，ICDH活性無顯著差異，貯藏5年的種子COX，MDH，ICDH活性顯著低于其他各貯藏年限(P<0.05)(圖3A,圖3B,圖3C)。白三葉種子APA活性隨貯藏年限的增加呈先上升后下降的趨勢，在貯藏1年時達到最大值，之后逐漸下降，其中1～5年貯藏期內(nèi)，白三葉種子APA活性表現(xiàn)為各貯藏年限差異顯著(P<0.05)(圖3D)。

圖3 不同貯藏年限白三葉種子呼吸關(guān)鍵酶活性的變化

2.5 綜合分析

本試驗采用隸屬函數(shù)法，以發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、芽長等15項指標作為評價指標，綜合評價不同貯藏年限白三葉種子的質(zhì)量。貯藏6年下白三葉種子的平均隸屬函數(shù)值在0.00～0.96(表2)。根據(jù)平均隸屬函數(shù)值進行排序，得出貯藏6年下的白三葉種子質(zhì)量由高到低依次為：貯藏1年>貯藏0年>貯藏2年>貯藏3年>貯藏4年>貯藏5年。

表2 不同貯藏年限下白三葉種子各指標隸屬函數(shù)值及綜合評價

3 討論

3.1 貯藏年限對白三葉種子萌發(fā)的影響

種子老化是貯藏過程中影響種子質(zhì)量和活力的主要原因之一，在種子貯藏過程中，保持較高水平的種子質(zhì)量和活力至關(guān)重要[12]。發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)代表種子活力的高低，同時也是衡量種子質(zhì)量的重要指標[26]。隨著貯藏時間的延長，種子逐漸老化，表現(xiàn)為種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢等相關(guān)萌發(fā)指標逐漸下降[27-28]。本試驗結(jié)果顯示，白三葉種子貯藏0～2年發(fā)芽率和發(fā)芽勢無顯著差異，白三葉種子貯藏1～5年發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)隨貯藏時間的延長呈下降趨勢。這表明白三葉種子在自然環(huán)境和自身生理生化指標等因素的共同作用下，老化程度加深，種子活力逐漸降低，這與許美玲等[29]研究結(jié)果一致。

3.2 貯藏年限對白三葉幼苗生長的影響

植物的生長指標可以較直觀地表現(xiàn)出其受影響程度。貯藏多年的種子在室內(nèi)做發(fā)芽試驗時可以萌發(fā)，而在田間條件下很難出苗，或出苗不正常，這類種子雖然有生命力，但其活力較低，逆境條件下不能成為正常苗，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上失去了種用價值[30]。本研究以貯藏0～5年的白三葉種子為試驗材料，研究結(jié)果表明貯藏年限對白三葉幼苗的生長產(chǎn)生抑制作用，其原因可能與因貯藏年限增加導致種子活力下降有關(guān)，這與張熙穎[31]的研究結(jié)論基本一致。辛慧慧等[32]也發(fā)現(xiàn)了貯藏年限的延長會降低紫羊茅和葦狀羊茅幼苗長度和胚根長度，進一步證明了貯藏年限越長，幼苗長勢越弱。

3.3 貯藏年限對白三葉種子相對電導率及抗氧化酶活性的影響

長期貯存會使種子老化，使細胞膜的完整性降低，酶促抗氧化系統(tǒng)遭受損傷，從而引起膜脂過氧化，加劇種子劣變程度，造成種子活力下降[33]。種子浸提液的相對電導率可反映種子內(nèi)溶性物質(zhì)的滲透程度，而滲透程度又可間接地反映出細胞膜的完整性[34]。SOD，POD和CAT共同構(gòu)成了酶促抗氧化系統(tǒng)，SOD能將超氧陰離子歧化并將其轉(zhuǎn)化為過氧化氫和氧氣，有效減少活性氧的危害，從而建立起植物的抗氧化屏障。然后，在POD的協(xié)助下，CAT將過氧化氫分解為氧氣和水，從而將活性氧的傷害降到最低[35]。本研究結(jié)果表明，隨貯藏年限的增加，白三葉種子的相對電導率逐漸升高，SOD，POD和CAT活性逐漸下降，即白三葉種子老化后，種子內(nèi)部可溶性物質(zhì)的滲出量不斷增加，使其細胞膜的完整性降低，從而破壞了酶促抗氧化系統(tǒng)，引發(fā)細胞膜脂過氧化，加劇種子退化，進而影響種子的活力，這與前人研究結(jié)果一致[36]。

3.4 貯藏年限對白三葉種子呼吸關(guān)鍵酶活性的影響

呼吸是所有生活細胞共同存在的一種生物行為，是植物新陳代謝過程中必不可少的一部分，為所有生物的生命活動提供了必要的的能量，對植物有著十分重要的意義[1]。在貯藏期間，種子的呼吸功能會逐步減弱，發(fā)芽率也相應(yīng)地降低，并且在萌發(fā)能力完全喪失之前，表現(xiàn)出一種較為復(fù)雜的呼吸模式[12]。已有研究表明，經(jīng)老化處理的種子，與呼吸有關(guān)的信號酶COX、MDH活性降低，線粒體的電子傳遞鏈還原性提高、呼吸控制比降低，氧化磷酸化進程受到抑制，使ATP合成基質(zhì)供應(yīng)減少，從而導降低種子的活力，最終失去萌發(fā)能力[37-39]。本研究結(jié)果顯示，COX,ACP,IDH,MDH活性整體上隨貯藏年限的增加而降低，即種子呼吸作用逐漸減弱，導致種子活力下降，與Xin等[37]研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

白三葉種子的萌發(fā)指標和幼苗生長指標隨貯藏年限的增加呈先上升后下降的趨勢，均在貯藏1年時達到最大值；隨貯藏年限的增加，種子相對電導率逐漸上升，抗氧化酶和呼吸關(guān)鍵酶活性逐漸下降。采用隸屬函數(shù)法對不同貯藏年限下的種子進行綜合評價，得出貯藏0或1年的白三葉種子種用價值較高，最適合農(nóng)業(yè)實際生產(chǎn)使用。