沙蔥螢葉甲GdHsp70-2，GdHsp70-3的克隆鑒定與表達(dá)譜分析

張宏玲, 任 浩, 田 羽, 單艷敏，王 瑩, 李 玲, 李艷艷, 龐保平, 譚 瑤*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原昆蟲研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019；2.鑲黃旗草原工作站，內(nèi)蒙古 鑲黃旗 013250；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)林業(yè)和草原有害生物防治檢疫總站，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010051；4.鄂爾多斯市自然資源局康巴什區(qū)分局，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017010)

沙蔥螢葉甲(Galerucadaurica)屬鞘翅目葉甲科，近十年來在內(nèi)蒙古草原暴發(fā)成災(zāi)，主要危害百合科植物如野韭(Alliumramosum)、多根蔥(Alliumpolyrhizum)、沙蔥(Alliummongolium)等[1]。據(jù)調(diào)查，該蟲分布于西伯利亞、蒙古高原、朝鮮半島及中國北方多地，其一年發(fā)生1代，以卵在石塊、牛糞底部越冬，于4月初開始孵化，幼蟲共3齡，6月中旬開始羽化為成蟲并蟄伏越夏，9月上旬解除滯育，開始取食、交配并產(chǎn)卵[2]。沙蔥螢葉甲通過成蟲滯育越夏、卵滯育越冬，以適應(yīng)草原夏季極端高溫、嚴(yán)冬極端低溫的生境[2]。沙蔥螢葉甲幼蟲大量取食野生沙蔥，致使草場(chǎng)植被遭到嚴(yán)重破壞，生產(chǎn)力顯著下降，對(duì)當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境和畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[3-4]。目前，研究者們已對(duì)沙蔥螢葉甲的生長(zhǎng)發(fā)育與遺傳多樣性[5-7]，滯育機(jī)制及調(diào)控機(jī)理[8-11]，化學(xué)生態(tài)系統(tǒng)[12-13]，殺蟲劑篩選與應(yīng)用[14-15]，抗寒適應(yīng)性及其分子機(jī)理[16-22]等多方面開展了系統(tǒng)研究，為沙蔥螢葉甲的綠色綜合防控研究奠定了基礎(chǔ)。

熱激蛋白(Heat shock proteins，HSPs)普遍存在于所有生物體中，是一類在進(jìn)化上高度保守的蛋白[23]，負(fù)責(zé)在機(jī)體受逆境脅迫后保護(hù)蛋白、多肽，促進(jìn)變性蛋白質(zhì)修復(fù)以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[24]。當(dāng)昆蟲受到極端溫度、重金屬污染、干燥、缺氧、紫外線輻射等外界刺激后，其體內(nèi)HSPs可迅速合成或表達(dá)量升高[25-26]。根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量和同源性，HSPs被分為HSP100家族、HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族、HSP40家族和小分子HSPs(sHSPs)六個(gè)家族[27]。HSP70作為生物體內(nèi)最保守的熱激蛋白家族，主要存在于細(xì)胞質(zhì)、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)基質(zhì)中[28-29]，依據(jù)其誘導(dǎo)表達(dá)特性，可分為組成型HSC70(Heat shock cognate protein 70)和誘導(dǎo)型HSP70(Heat shock protein 70)[30]。其中HSC70的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，而HSP70在各種應(yīng)激條件下能迅速表達(dá)，但需要HSP40 作為協(xié)同伴侶形成“HSP70/HSP40復(fù)合物系統(tǒng)”共同發(fā)揮作用[31]。在生物體中不同HSP70家族成員既有相似的功能，也有各自特定功能，HSP70家族在家蠶(Bombyxmori)全基因組中被鑒定后，F(xiàn)ang等對(duì)其進(jìn)行分類及系統(tǒng)發(fā)育分析，并測(cè)得在熱(37℃和42℃)和冷(2℃)脅迫下，Hsp70-1，Hsp70-2和Hsp70-3的表達(dá)均上調(diào)[32]；而煙粉虱(Bemisiatabaci)經(jīng)40℃熱處理4 h后BtHsp70-4，BtHsp70-5，BtHsp70-6，BtHsp70-11，BtHsp70-12，BtHsp70-13基因表達(dá)量上調(diào)，但在4℃的低溫處理下，除BtHsp70-10外其余Hsp70基因都被強(qiáng)烈誘導(dǎo)[33]；同樣，白背飛虱(SogatellaFurcifera)在UV-A脅迫下，除Hsp70-2的表達(dá)顯著下調(diào)外，Hsp70-3，Hsp70-4，Hsp70-5和Hsp70-6的表達(dá)顯著上調(diào)[34]。這均表明昆蟲Hsp70基因在參與應(yīng)對(duì)不同環(huán)境脅迫的反應(yīng)中涉及的功能不同。

前期研究已證明沙蔥螢葉甲在越冬蟲態(tài)及低溫馴化下，編碼HSP60蛋白(GdHsp60)和誘導(dǎo)型HSP70蛋白(GdHsp70)的基因顯著高表達(dá)[18-19]，且通過RNAi沉默GdHsp60和GdHsp70基因表達(dá)顯著降低了沙蔥螢葉甲幼蟲的抗寒能力[20]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在克隆沙蔥螢葉甲GdHsp70-1時(shí)，其5'端部分序列與已注冊(cè)序列無法匹配，通過比對(duì)序列信息，推測(cè)該基因可能存在可變剪接。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)，對(duì)假定為GdHsp70-1的剪接異構(gòu)體GdHsp70-2進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，以明確該基因的序列信息，并進(jìn)行表達(dá)譜分析；同時(shí)，對(duì)沙蔥螢葉甲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中另一條注釋為Hsp70的基因GdHsp70-3進(jìn)行全長(zhǎng)克隆及表達(dá)譜分析；還以沙蔥螢葉甲DNA為模板對(duì)GdHsp70-2，GdHsp70-3基因組序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。研究結(jié)果將為深入開展HSP70在沙蔥螢葉甲生長(zhǎng)發(fā)育及抗寒性中的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx的飼養(yǎng)

2020年9月在內(nèi)蒙古錫林郭勒鑲黃旗草原(44°62′ N，115°80′ E)采集沙蔥螢葉甲越冬卵，待滯育期結(jié)束后轉(zhuǎn)移至溫度(25±1)℃、相對(duì)濕度70%±5%、光周期14L∶10D的人工氣候箱(PRX-350C，寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠)中培養(yǎng)使其孵化，并以室外種植的新鮮韭菜葉片為食料進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.2 研究方法

1.2.1沙蔥螢葉甲總RNA的提取和cDNA的合成 取沙蔥螢葉甲各齡期樣品20 mg，混合后按照RNAiso Plus(9108Q,TaKaRa)試劑盒說明書提取總RNA，并通過超微量分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的濃度及質(zhì)量；使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(6210A,TaKaRa)將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2沙蔥螢葉甲GdHsp70-2,GdHsp70-3基因的克隆 根據(jù)擴(kuò)增GdHsp70(Genbank登錄號(hào)：KY460462)得到的測(cè)序結(jié)果和轉(zhuǎn)錄組中注釋為Hsp70的序列信息，使用Primer 5.0軟件分別設(shè)計(jì)GdHsp70-2、GdHsp70-3中間片段的上、下游引物(表1)，以1.2.1節(jié)中合成的沙蔥螢葉甲cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系參照說明書。PCR反應(yīng)條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 60 s，72℃ 2 min，循環(huán)30 次；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分離出目的條帶，將其連接至pMD19-T(6013,TaKaRa)載體上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α(CB101,TIANGEN)中培養(yǎng)，篩選出陽性克隆送往生工生物公司(北京)進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果輸入在線網(wǎng)站BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源性分析。根據(jù)測(cè)序結(jié)果按SMARTer RACE 5′/3′ Kit(634858,634859,TaKaRa)說明書要求設(shè)計(jì)3′與5′的特異性引物(表1)，并采用降落PCR和巢式PCR方法進(jìn)行5′和3′末端克隆，得到沙蔥螢葉甲GdHsp70-2,GdHsp70-3的cDNA全長(zhǎng)序列。

表1 GdHsp70-2和GdHsp70-3基因全長(zhǎng)克隆和熒光定量PCR引物

1.2.3序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 對(duì)沙蔥螢葉甲GdHsp70-2，GdHsp70-3的全長(zhǎng)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，所用軟件名稱及網(wǎng)址如表2所示[35-36]。

表2 基因生物信息學(xué)分析所用軟件

1.2.4沙蔥螢葉甲基因組DNA提取及GdHsp70-2，GdHsp70-3的內(nèi)含子克隆與分析 收集沙蔥螢葉甲羽化第3天的成蟲100 mg，采用通用型基因組DNA提取試劑盒(DP304,TIANGEN)，提取沙蔥螢葉甲基因組總DNA。根據(jù)1.2.2克隆得到GdHsp70-2，GdHsp70-3的cDNA序列設(shè)計(jì)引物(表1)，以沙蔥螢葉甲總DNA為模板進(jìn)行基因組分段克隆，PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件同1.2.2。運(yùn)用軟件DNAstar(Version 11.0)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，并通過在線網(wǎng)站GSDS(http://gsds.gao-lab.org/)將拼接后的序列與來自全基因組序列比對(duì)，分析內(nèi)含子序列信息。

1.2.5GdHsp70-2,GdHsp70-3的表達(dá)譜分析 對(duì)沙蔥螢葉甲各發(fā)育時(shí)期及不同組織中GdHsp70-2,GdHsp70-3的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行研究。不同生育期選取各齡期蛻皮3日齡的沙蔥螢葉甲蟲體，每個(gè)時(shí)期取蟲20頭；不同組織選取3日齡沙蔥螢葉甲成蟲的頭(含觸角)、胸、腹、足(前、中、后足)、翅(前、后翅)，雌雄蟲各30頭。根據(jù)沙蔥螢葉甲GdHsp70-2,GdHsp70-3的全長(zhǎng)序列，采用在線軟件Primer 3.0(https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物(表1)，選擇沙蔥螢葉甲琥珀酸脫氫酶(Succinate dehydrogenase，SDHA)基因作為內(nèi)參基因[37]。q-PCR反應(yīng)體系按照GoTaq?qPCR Master Mix(A6001,Promega)說明書進(jìn)行配置。使用q-PCR儀(FTC-3000，F(xiàn)unglyn Biotech，加拿大)進(jìn)行測(cè)定，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火1 min，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析[38]，利用SPSS 26.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙蔥螢葉甲GdHsp70-2和GdHsp70-3的克隆與序列分析

以沙蔥螢葉甲的GdHsp70-1基因作為模板，通過中心片段克隆及cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)，擴(kuò)增獲得130 bp的5′端序列和一段683 bp未知序列，通過測(cè)序及同源性鑒定，認(rèn)為該序列屬于GdHsp70-1的剪接異構(gòu)體，命名為GdHsp70-2(Genbank登錄號(hào)為MZ853083)。GdHsp70-2基因全長(zhǎng)2 410 bp，開放閱讀框(Open reading frame，ORF)長(zhǎng)1 974 bp，5′非翻譯區(qū)為130 bp，3′非翻譯區(qū)為306 bp，包含PolyA尾巴；編碼657個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為72.90 kD，等電點(diǎn)(Isoelectric point,pI)為5.07；無跨膜區(qū)，5′端含有信號(hào)肽區(qū)域，位于第1～54位殘基(ATGAGGTTATATC TAAGTT TTGGTTGTGCTGCTGCTCTTAGCCAGCGTC CTGGCT)，蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)GdHsp70-2主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；具有3個(gè)HSP70家族特征序列，分別位于第9～16位殘基(IDLGTTYS)，第197～209位殘基(IFDLGGGTFDVSLL)，第334～348位殘基(IVLVGGSTRIPKVQQ)，含有一個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特征元件，位于第629～632位殘基(RDEL)(圖1)。

圖1 沙蔥螢葉甲GdHsp70-2的堿基序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列

以沙蔥螢葉甲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中一條注釋為Hsp70的基因作為模板，通過中心片段克隆及cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)，克隆獲得沙蔥螢葉甲GdHsp70-3(Genbank登錄號(hào)為：OK585088)，其基因全長(zhǎng)為2 242 bp，包含131 bp的5′端序列和一段170 bp的3’端序列，開放閱讀框(ORF)長(zhǎng)1 941 bp，編碼646個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為71.11 kD，等電點(diǎn)(pI)為5.59；未預(yù)測(cè)到跨膜區(qū)與信號(hào)肽，蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)GdHsp70-3主要位于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)；具有3個(gè)HSP70家族特征序列，分別位于第9～16位殘基(IDLGTTYS)，第197～210位殘基(IFDLGGGTFDVSLL)，第335～349位殘基(IVLVGGSTRIPKVQQ)(圖2)。

圖2 沙蔥螢葉甲GdHsp70-3的堿基序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列

2.2 沙蔥螢葉甲GdHSP70-2和GdHSP70-3的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

利用在線分析網(wǎng)站SOPMA預(yù)測(cè)沙蔥螢葉甲GdHsp70-2與GdHsp70-3的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，GdHSP70-2中α-螺旋(Alpha helix)占43.23%，β-折疊(Beta turn)占7.61%，無規(guī)則卷曲(Random coil)占30.59%，延伸鏈(Extended strand)占18.57%；GdHSP70-3中α-螺旋占41.18%，β-折疊占6.97%，無規(guī)則卷曲占33.28%，延伸鏈占18.58%。應(yīng)用SWISS-MODEL工具建模，預(yù)測(cè)了沙蔥螢葉甲GdHSP70-2與GdHSP70-3的蛋白三維結(jié)構(gòu)。GdHSP70-2以牛熱激同源蛋白HSC70(aa1-554)E213A/D214A突變體的晶體結(jié)構(gòu)(SMTL ID：7o6r.1.A)為模板建模，相似性為66.48%(圖3A)；GdHSP70-3以牛熱激同源蛋白hsc70(aa1-554)E213A/D214A的晶體結(jié)構(gòu)為模板建模(SMTL ID：4fl9.1.A)，相似性為78.16%。并且GdHSP70-2與GdHSP70-3的三維結(jié)構(gòu)高度一致(圖3B)，均由N端ATPase功能域和C端底物結(jié)合功能域所組成。

圖3 沙蔥螢葉甲GdHSP70-2(A)與GdHSP70-3(B)的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型

2.3 沙蔥螢葉甲GdHSP70-2,GdHSP70-3同源比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

為檢測(cè)不同昆蟲種間HSP70的親緣關(guān)系，將推導(dǎo)出的沙蔥螢葉甲GdHSP70-2和GdHSP70-3氨基酸序列，與NCBI數(shù)據(jù)庫中不同目昆蟲的HSP70 氨基酸序列共同構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹。如圖4所示，GdHSP70-2和GdHSP70-1位于同一分支，GdHSP70-2與同為鞘翅目的松墨天牛MonochamusalternatusMaltHSC70-1(GenBank登錄號(hào)：QTA73204.1)親緣關(guān)系最近，氨基酸序列相似性為91.58%；而GdHSP70-3屬于另一分支，與玉米根螢葉甲DiabroticavirgiferavirgiferaDvirHSP70-2(GenBank登錄號(hào)：XP_028129506.1)親緣關(guān)系最近，氨基酸序列相似性為88.77%。已測(cè)得的3條沙蔥螢葉甲Hsp70的氨基酸序列一致性為79.21%，且HSP70家族標(biāo)簽序列在不同昆蟲種中高度一致(圖5)。

圖4 基于昆蟲HSP70與沙蔥螢葉甲HSP70的氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖5 基于昆蟲HSP70與沙蔥螢葉甲HSP70的氨基酸序列比對(duì)分析

2.4 沙蔥螢葉甲GdHsp70-2，GdHsp70-3基因組DNA的結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)已經(jīng)獲得的GdHsp70-2，GdHsp70-3基因cDNA序列，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行基因組全長(zhǎng)擴(kuò)增，獲得了GdHsp70-2，GdHsp70-3的DNA序列，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)GdHsp70-2基因含有兩段內(nèi)含子插入(圖6)，分別位于開放閱讀框996～1 060位堿基(GTTAGTTCACAAG AAACTTTAATATTTTAAA CTCGTTATTTACGATTTTATTAATTTATTT TAG)與1 337～1 397位堿基(GTAAGTTATTAC AATAAAAAAGTTTTTGTACAA AAAA-ACTAATTTAATTCTTAATTTCAG)，A+T含量分別為81%與83%。而GdHsp70-3基因不含內(nèi)含子，如圖6所示，其中大多數(shù)Hsp70基因同樣不含有內(nèi)含子序列。

為了進(jìn)一步了解昆蟲Hsp70基因家族成員之間的進(jìn)化關(guān)系，在基因組系統(tǒng)發(fā)育分析的基礎(chǔ)上對(duì)其基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較。圖6顯示了Hsp70可以分為四組，均具有較高的自展值，已測(cè)得的3條沙蔥螢葉甲Hsp70序列均屬于同一分支，其中GdHsp70-2與GdHsp70-1親緣關(guān)系最近，而GdHsp70-3與玉米根螢葉甲DvHsp70-2(GenBank登錄號(hào)：XM_028273705.1)親緣關(guān)系最近。

圖6 沙蔥螢葉甲等昆蟲Hsp70基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及基因結(jié)構(gòu)分析

2.5 沙蔥螢葉甲GdHsp70-2，GdHsp70-3在不同發(fā)育階段的表達(dá)量

沙蔥螢葉甲GdHsp70-2在不同發(fā)育階段的表達(dá)水平差異顯著(F=231.59，P<0.05)(圖7A)。以卵期的表達(dá)量作為對(duì)照，2齡幼蟲和蛹期的表達(dá)量顯著高于其它發(fā)育階段(P<0.05)，分別是卵期表達(dá)量的7.48倍和7.75倍，而其他各齡期的表達(dá)量不存在顯著差異。GdHsp70-3在不同發(fā)育階段的表達(dá)水平差異極顯著(F=657.09，P<0.001)(圖7B)。以卵期的表達(dá)量作為對(duì)照，蛹期和雌性成蟲中的表達(dá)量顯著高于其它發(fā)育階段(P<0.001)，分別是卵期表達(dá)量的115.32倍和8.35倍，而1，2，3齡幼蟲階段表達(dá)量極低(P<0.001)，僅為卵期表達(dá)量的4.09%，10.45%，5.80%。

圖7 沙蔥螢葉甲GdHsp70-2(A)和GdHsp70-3(B)在不同發(fā)育階段的表達(dá)譜

2.6 沙蔥螢葉甲GdHsp70-2，GdHsp70-3在成蟲不同組織中的表達(dá)量

沙蔥螢葉甲GdHsp70-2在成蟲不同部位的表達(dá)量存在極顯著差異(F=66.49，P<0.001)(圖8A)，翅部的表達(dá)量明顯高于其它部位，其次為胸部與腹部，分別為頭部表達(dá)量的2.03倍、1.54倍與1.53倍；各部位GdHsp70-3的表達(dá)量也有極顯著性差異(F=288.26，P<0.001)(圖8B)，其中足部的表達(dá)量最高，為頭部表達(dá)量的2.28倍，腹部表達(dá)量最低，僅為頭部表達(dá)量的52.91%，其他部位表達(dá)量差異不顯著(圖8B)。

圖8 沙蔥螢葉甲GdHsp70-2(A)和GdHsp70-3(B)組織表達(dá)分析

3 討論

本研究通過RT-PCR和RACE技術(shù)克隆獲得了兩條沙蔥螢葉甲Hsp70基因，分別命名為GdHsp70-2(Genbank登錄號(hào)為MZ853083)與GdHsp70-3(Genbank登錄號(hào)為OK585088)。使用DNAMAN(Version 8.0)對(duì)GdHsp70-2與GdHsp70-1進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)GdHsp70-2除5′端非翻譯區(qū)及開放閱讀框前端683 bp外，其余堿基與GdHsp70-1的序列相似度為99.8%，二者同源性極高，根據(jù)可變剪切的定義及剪接模式的分類[39]，推測(cè)該基因可能屬于GdHsp70-1的剪接異構(gòu)體。GdHsp70-1與GdHsp70-2可能是由同一mRNA前體(Pre-mRNA)通過不同的剪接方式，而產(chǎn)生的不同剪接異構(gòu)體。這種方式使得一個(gè)基因可編碼多個(gè)不同轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和蛋白產(chǎn)物，是真核生物中增加蛋白質(zhì)多樣性和調(diào)控基因表達(dá)的一種常見方式，是由多種因素誘導(dǎo)產(chǎn)生的高效動(dòng)態(tài)過程[40]。在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中GdHSP70-2與GdHSP70-3均由N-端的ATPase功能域及C-端的底物結(jié)合功能域構(gòu)成，這與喬恒等對(duì)美國白蛾HyphantriacuneaHcHSP70蛋白預(yù)測(cè)的三維結(jié)構(gòu)高度相似，HcHSP70的N-端ATPase功能域呈螺旋狀結(jié)構(gòu)，與肌動(dòng)蛋白和己酮酶有類似的折疊，C-端底物結(jié)合功能域是扁平的磚狀結(jié)構(gòu)，具有結(jié)合延伸的多肽鏈通道[41]。同源比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示昆蟲HSP70系統(tǒng)發(fā)育樹被分成3支，不同目昆蟲的HSP70家族基因具有較高的保守性，其中GdHSP70-2與松墨天牛MaltHSC70-1同源性相似度最高，這與早期譚瑤等的研究結(jié)果相似[19]，表明沙蔥螢葉甲與松墨天牛在進(jìn)化中有相近的起源關(guān)系；而GdHSO70-3與玉米根螢葉甲DvirHsp70-2同源性相似度高，說明沙蔥螢葉甲不同Hsp70基因在進(jìn)化上存在差異性，HSP70家族不同基因功能具有多樣性[42]。

內(nèi)含子(Intron)是真核生物細(xì)胞DNA中的間插序列，基因在轉(zhuǎn)錄后保留編碼部分，間插序列經(jīng)過剪接被除去，最終不存在于成熟的mRNA分子序列中[43]。隨著研究的深入，內(nèi)含子的功能逐漸被發(fā)掘，例如增加轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的多樣性、在細(xì)胞中進(jìn)行調(diào)控活動(dòng)、影響基因表達(dá)、mRNA的加工、降解和翻譯效率等[44]。但并非所有基因組序列中都包含內(nèi)含子(圖6)，吳春鳳以弓形蟲Toxoplasmagondii的DNA為模板，通過T-A克隆測(cè)序發(fā)現(xiàn)其GRA1基因?yàn)閿嗔鸦?，在原基因序列?60～861 bp間存在一段135 bp的內(nèi)含子序列[45]；劉昭華根據(jù)已經(jīng)獲得的中華蜜蜂ApisceranaAccHsp27.6 cDNA序列進(jìn)行基因組全長(zhǎng)的擴(kuò)增時(shí)，則發(fā)現(xiàn)該基因不含內(nèi)含子[46]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)兩個(gè)Hsp70基因進(jìn)行基因組DNA克隆，將其與從NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索來自其他目昆蟲的Hsp70基因組序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹，并分析其基因結(jié)構(gòu)，但未發(fā)現(xiàn)Hsp70基因的編碼結(jié)構(gòu)與其表達(dá)形式存在必然聯(lián)系，這可能是物種差異所致[47-48]。明確GdHsp70的基因結(jié)構(gòu)將為應(yīng)用CRISPR-Cas9基因敲除策略開展HSP70在沙蔥螢葉甲生長(zhǎng)發(fā)育[49-50]、抗寒性及相關(guān)的生物學(xué)功能研究奠定基礎(chǔ)。

因?yàn)榛虮磉_(dá)具有階段特異性與組織特異性，不同時(shí)期細(xì)胞的分化和發(fā)育過程中，基因的表達(dá)會(huì)有很大差異[51]。研究報(bào)道顯示Hsp70基因不僅在對(duì)抗外界壓力中起主要作用，在調(diào)控昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育及分化過程中也發(fā)揮著重要作用[52-53]。不同發(fā)育階段表達(dá)譜顯示：GdHsp70-2在2齡幼蟲期和蛹期表達(dá)量較高，而GdHsp70-3只在蛹期的表達(dá)量顯著高于其它各時(shí)期，表明這兩個(gè)Hsp70基因可能參與了沙蔥螢葉甲的生長(zhǎng)發(fā)育過程。類似的結(jié)果在白背飛虱各發(fā)育階段表達(dá)譜分析中也被報(bào)道，其Hsp70-2在1齡若蟲中表達(dá)最高，Hsp70-3在雌蟲羽化第3天達(dá)到最高表達(dá)水平，Hsp70-4，Hsp70-5和Hsp70-6在5齡第2天若蟲中表達(dá)水平最高[34]。在不同組織表達(dá)量分析中，GdHsp70-2與GdHsp70-3分別在沙蔥螢葉甲成蟲翅和足的表達(dá)量最高，推測(cè)這兩個(gè)基因可能與昆蟲的運(yùn)動(dòng)行為相關(guān)，有助于其躲避天敵并擴(kuò)大分布范圍[54]，同時(shí)也反應(yīng)了沙蔥螢葉甲對(duì)外環(huán)境的一種適應(yīng)機(jī)制。在早期譚瑤等的研究中發(fā)現(xiàn)，GdHsp70-1在卵期表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他發(fā)育階段，且不同組織中以胸部表達(dá)量最高[19]，這也表明不同的Hsp70基因在沙蔥螢葉甲不同生長(zhǎng)發(fā)育階段中發(fā)揮著不同的作用。

4 結(jié)論

本研究通過克隆技術(shù)獲得了兩條沙蔥螢葉甲Hsp70基因，明確其編碼序列及基因結(jié)構(gòu)，并對(duì)其表達(dá)譜進(jìn)行分析。之后將進(jìn)一步對(duì)沙蔥螢葉甲Hsp70家族基因的同源性、功能與進(jìn)化分析等開展深入研究，探索熱激蛋白70家族不同基因在沙蔥螢葉甲適應(yīng)性進(jìn)化方面承載的生物學(xué)功能。