血清軟骨寡聚基質(zhì)蛋白水平與膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的關(guān)系研究

劉昌海，王占朝，張豪杰，李蓉

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院骨科，上海 202150)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨的局灶性病變，并伴有軟骨下骨硬化和關(guān)節(jié)邊緣的新骨形成(骨贅)以及輕度、慢性非特異性炎癥性滑膜炎[1-2]。中國(guó)癥狀性膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)患病率約為8.1%，KOA的嚴(yán)重程度通常從放射學(xué)檢查的無(wú)癥狀、偶然發(fā)現(xiàn)到晚期失能障礙不等。嚴(yán)重的軟骨缺失導(dǎo)致KOA患者關(guān)節(jié)疼痛，僵直畸形和功能障礙，生活質(zhì)量惡化，甚至死亡[3]。能夠反映疾病進(jìn)展動(dòng)態(tài)和定量變化的生物標(biāo)志物對(duì)于減少KOA的不利影響具有相當(dāng)重要的意義。軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(cartilage oligomeric matrix protein，COMP)屬于血栓反應(yīng)蛋白家族，是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的一種重要蛋白[4]。既往研究發(fā)現(xiàn)COMP的表達(dá)與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的軟骨分化、軟骨外基質(zhì)形成及維持軟骨細(xì)胞表型均有相關(guān)性，因此可能與KOA的疾病進(jìn)展有關(guān)[5]，然而目前尚缺乏足夠的臨床證據(jù)。因此，本研究旨在通過觀察性研究分析血清COMP與膝關(guān)節(jié)癥狀、關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)改變以及KOA患者軟骨或骨生物標(biāo)志物之間的關(guān)系，從而為血清COMP的臨床應(yīng)用提供有力的支持。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2012年4月至2019年3月期間在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院骨科收治的雙側(cè)KOA患者255例(KOA組)作為研究對(duì)象，其中男168例，女87例；年齡28～85歲，平均年齡(59.77±11.01)歲。KOA患者根據(jù)《骨關(guān)節(jié)炎診治指南(2007年版)》[6]的癥狀標(biāo)準(zhǔn)和Kellgren-Lawrence(K/L)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。此外，研究對(duì)象還應(yīng)符合以下納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)K/L分級(jí)≥2級(jí)；(2)臨床和生化資料完整，且依從性良好，均知情同意本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并膝關(guān)節(jié)手術(shù)史、創(chuàng)傷史、關(guān)節(jié)周圍骨折；(2)合并椎管狹窄病史、神經(jīng)系統(tǒng)疾病或繼發(fā)性(炎癥或代謝)關(guān)節(jié)炎病史者；(3)合并惡性腫瘤，嚴(yán)重心、肝、腎功能障礙，痛風(fēng)病史，感染或自身免疫性疾病者。對(duì)照組100例非KOA受試者從正在接受體檢的健康志愿者中選擇，其中男67例，女33例；年齡20～86歲，平均年齡(58.96±12.42)歲。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)豐富的骨科醫(yī)生對(duì)膝關(guān)節(jié)進(jìn)行臨床檢查，排除任何癥狀性或影像學(xué)OA證據(jù)。與KOA組比較，對(duì)照組年齡、性別構(gòu)成具有可比性(P>0.05)。本研究為觀察性橫斷面研究，在獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并遵循《赫爾辛基宣言》的前提下進(jìn)行。

1.2 血清COMP水平檢測(cè) 受試者休息30 min后抽取5 mL外周靜脈血置于普通樣品瓶，然后于室溫下以3 000 rpm的速度離心15 min，取上層清液血清于普通樣品瓶中，儲(chǔ)存于-20 ℃條件下直至檢測(cè)。使用COMP酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA)試劑盒(BioVendor Laboratory Medicine，德國(guó))，檢出限為0.4 ng/mL，批內(nèi)及批間變異系數(shù)分別為4%、3.1%。將儲(chǔ)存的血清分成每孔0.1 mL等分，每孔預(yù)先包被生物素化的單克隆抗體。依次加入稀釋緩沖液、工作液、顯色劑，分別孵育90 min、60 min、20 min，共用洗滌液洗滌4次以去除未結(jié)合的抗體。使用設(shè)置為450 nm(Bio-Rad Laboratories，加拿大)的微孔板讀數(shù)器測(cè)定每個(gè)孔的吸光度。采用四參數(shù)算法，將標(biāo)準(zhǔn)品的平均吸光度(Y)與已知標(biāo)準(zhǔn)品濃度(X)以對(duì)數(shù)標(biāo)尺繪制標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的吸光度值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以各自的稀釋倍數(shù)，得到樣品中血清COMP的實(shí)際濃度(ng/mL)。

1.3 影像學(xué)評(píng)估 采用1957年K/L分級(jí)[7]量表對(duì)所有患者進(jìn)行放射學(xué)評(píng)估，K/L分級(jí)為0級(jí)(正常表現(xiàn))：無(wú)骨贅及正常關(guān)節(jié)間隙；K/L分級(jí)為1級(jí)(可疑)：微小骨贅，病理意義可疑；K/L分級(jí)為2級(jí)(輕度)：無(wú)關(guān)節(jié)間隙狹窄的骨贅；K/L分級(jí)為3級(jí)(中度)：關(guān)節(jié)間隙中度狹窄；K/L分級(jí)為4級(jí)(嚴(yán)重)：嚴(yán)重關(guān)節(jié)間隙狹窄伴軟骨下骨硬化。K/L分級(jí)1級(jí)、2級(jí)分為輕度組，3級(jí)、4級(jí)分為中重度組。

1.4 關(guān)節(jié)癥狀評(píng)估 所有受試者均完成了西安大略和麥克馬斯特大學(xué)(the Western Ontario and McMaster Universities，WOMAC)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)[8]問卷調(diào)查(包括疼痛、關(guān)節(jié)僵硬及日?；顒?dòng)，共有24個(gè)題目，每個(gè)題目均采用5級(jí)評(píng)分法進(jìn)行評(píng)分)及Lequesne指數(shù)[9]問卷調(diào)查(包括疼痛或不適、最大步行距離和日?；顒?dòng))，WOMAC疼痛評(píng)估分為負(fù)重性疼痛(平地行走、上下樓梯及直立行走時(shí))、非負(fù)重性疼痛(夜間臥床或坐臥時(shí))。

2 結(jié) 果

2.1 兩組受試者血清COMP水平比較 KOA組血清COMP水平為(2 492.40±1 071.80) ng/mL，對(duì)照組血清COMP水平為(1 426.05±932.93) ng/mL，KOA組顯著高于對(duì)照組(P<0.001)。經(jīng)ROC曲線分析，血清COMP水平診斷KOA的AUC為0.789(0.733～0.845)，在最佳截?cái)嚅撝?1 785.65 ng/mL)下，靈敏度和特異性分別為68.91%和78.50%(見圖1)。

圖1 血清COMP水平診斷KOA的ROC曲線分析

2.2 KOA患者血清COMP水平與其他臨床特征的關(guān)系 根據(jù)KOA患者的血清COMP水平中位值，將KOA患者分為低水平組(<2 210.59 ng/mL)及高水平組(≥2 210.59 ng/mL)。經(jīng)分析，高水平組患者合并吸煙史概率、疼痛持續(xù)時(shí)間、Ⅲ型前膠原氨基末端肽(PⅢNP)均高于低水平組，同時(shí)站起-走計(jì)時(shí)測(cè)試(TUG)時(shí)間低于低水平組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.3 KOA患者血清COMP水平與WOMAC、Lequesne指數(shù)的關(guān)系 經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析，KOA患者血清COMP水平與WOMAC及Lequesne指數(shù)均呈正相關(guān)(r=0.195，0.393，P<0.05，見圖2)。校正年齡、性別、病程等混雜因素后，經(jīng)多元線性回歸分析，KOA患者血清COMP水平與WOMAC-疼痛評(píng)分(β=2.85，95%CI=1.31～5.39，P=0.028)、WOMAC-關(guān)節(jié)功能評(píng)分(β=9.85，95%CI=4.33～17.29，P=0.034)及Lequesne指數(shù)(β=1.65，95%CI=1.24～2.99，P=0.015)仍存在正相關(guān)性。

圖2 KOA患者血清COMP水平與WOMAC、 Lequesne指數(shù)的Spearman相關(guān)性

2.4 KOA患者血清COMP水平與K/L分級(jí)的相關(guān)性 經(jīng)Spearman秩相關(guān)系數(shù)分析，KOA患者血清COMP水平與K/L分級(jí)呈正相關(guān)(r=0.481，P<0.05)。輕度組共有151例患者，中重度組共有104例患者。根據(jù)KOA患者的血清COMP水平四分位數(shù)，分為Q1(<1 635.41 ng/mL)、Q2(1 635.41～2 210.59 ng/mL)、Q3(2 210.59～3 143.87 ng/mL)、Q4(>3 143.87 ng/mL)。經(jīng)單變量回歸分析表明，所有研究對(duì)象中血清COMP水平分別在Q3和Q4區(qū)間時(shí)，K/L分級(jí)≥3級(jí)的風(fēng)險(xiǎn)分別增加4.333倍和11.980倍。在進(jìn)一步校正年齡、性別等客觀干擾因素后，血清COMP水平分別在Q3和Q4區(qū)間時(shí)，KOA患者進(jìn)展至K/L分級(jí)≥3級(jí)的風(fēng)險(xiǎn)分別增加2.091倍和5.682倍(P<0.001，見表2)。

3 討 論

本研究團(tuán)隊(duì)人員前期調(diào)研查閱國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)后，發(fā)現(xiàn)本研究是目前國(guó)內(nèi)最大樣本量的一項(xiàng)關(guān)于血清COMP作為KOA生物標(biāo)志物的適用性研究。本研究結(jié)果表明，KOA患者血清COMP水平顯著高于對(duì)照組，并且血清COMP水平也隨著KOA的嚴(yán)重程度而增加。研究結(jié)果表明，血清COMP水平有可能成為KOA診斷、監(jiān)測(cè)嚴(yán)重程度和評(píng)估疾病進(jìn)展的候選分子。此外KOA患者血清COMP水平與WOMAC及Lequesne指數(shù)均呈正相關(guān)，說明血清COMP水平可以積極預(yù)測(cè)KOA的臨床和影像學(xué)水平，也進(jìn)一步證實(shí)血清COMP可作為輔助影像學(xué)評(píng)估KOA患者病情進(jìn)展程度的一種有效方法。

目前OA的發(fā)病率不斷上升，但其早期變化在影像學(xué)上表現(xiàn)不明顯，通常是在關(guān)節(jié)受損后才被確診。因此，靈敏的診斷方法用于早期診斷，可以延遲患者不可逆的關(guān)節(jié)損傷。各種潛在的OA疾病修正治療，如生物再生治療、軟骨成形

表1 不同血清COMP水平KOA患者一般臨床資料分析

表2 單變量和多變量模型分析KOA患者血清COMP水平與K/L分級(jí)進(jìn)展的關(guān)系

術(shù)和自體軟骨細(xì)胞移植，有助于在患者出現(xiàn)不可逆骨和軟組織并發(fā)癥前，提高OA早期診斷和進(jìn)展評(píng)估的準(zhǔn)確率[10-11]。COMP是軟骨降解的非膠原生物標(biāo)志物，也稱血栓反應(yīng)蛋白5，最初從軟骨中分離，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)在軟骨和許多其他組織/細(xì)胞中也有表達(dá)[12]。已知COMP可參與膠原分泌和纖維生成，并與ECM的各種其他成分相互作用，如I、II、IX型膠原、基質(zhì)蛋白3。雖然COMP基因突變與骨骼發(fā)育不良、假性軟骨發(fā)育不全和多發(fā)性骨骺發(fā)育不良有關(guān)，但野生型COMP表達(dá)改變和/或全身性釋放已在一些主要的年齡依賴性和退行性疾病中得到描述[13-15]。如Sandstedt等[13]發(fā)現(xiàn)COMP的降解與動(dòng)脈粥樣硬化疾病進(jìn)展中的炎癥反應(yīng)有關(guān)，會(huì)產(chǎn)生特定的COMP片段；在肝纖維化相關(guān)研究中[14]，也發(fā)現(xiàn)循環(huán)COMP水平與膽道閉鎖患者的肝纖維化程度及生存率相關(guān)；在Saghafi等[15]的研究中，COMP與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎早期及晚期的疾病嚴(yán)重程度均呈正相關(guān)?？傮w來(lái)講，COMP被認(rèn)為是軟骨ECM周轉(zhuǎn)的一個(gè)非常具體的指標(biāo)，在骨關(guān)節(jié)炎或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)退行性變期間，以及在過度體力活動(dòng)或關(guān)節(jié)創(chuàng)傷導(dǎo)致的高負(fù)荷后COMP周轉(zhuǎn)率會(huì)升高[16-17]。

既往研究表明[18]，受損關(guān)節(jié)軟骨中的細(xì)胞有可能遷移到受損部位，導(dǎo)致這些區(qū)域的重新增殖。而COMP主要表達(dá)于軟骨結(jié)構(gòu)損傷最嚴(yán)重的上軟骨區(qū)，COMP過表達(dá)可能是一種試圖吸引周圍軟骨細(xì)胞來(lái)重建缺損部位的信號(hào)，并且通過COMP和血小板反應(yīng)蛋白-4的相互作用進(jìn)一步誘導(dǎo)ECM維持、保護(hù)和軟骨修復(fù)機(jī)制。事實(shí)上，COMP被證明能夠吸引軟骨細(xì)胞并有助于其錨定[19]。這些研究都從分子機(jī)制方面解釋了血清COMP在OA病變中的作用。在本研究中，與對(duì)照組相比，KOA患者(KL分級(jí)≥2級(jí))血清COMP水平顯著升高，表明血清COMP可作為KOA的診斷標(biāo)志物；此外與輕度KOA組相比，中重度KOA組血清COMP水平進(jìn)一步升高。與既往一些研究[16-17]不同的是KOA患者血清COMP升高與臨床疼痛癥狀及放射學(xué)改變均有關(guān)，這也突出了其作為預(yù)后生物標(biāo)志物以及監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展的生物標(biāo)志物的潛力。

綜上所述，本研究表明KOA患者血清COMP水平顯著高于健康受試者，且隨著KOA疾病嚴(yán)重程度的增加，血清COMP水平逐漸升高。血清COMP可能在KOA的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，有望成為臨床診斷或疾病進(jìn)展評(píng)估的潛在生物標(biāo)志物。本研究的局限性在于缺少早期KOA患者數(shù)據(jù)，所有確診的KOA患者KL分級(jí)均≥2級(jí)，無(wú)法確定血清COMP水平是否在放射學(xué)軟骨損傷證據(jù)出現(xiàn)前已經(jīng)表達(dá)上調(diào)。還應(yīng)注意的是，大多數(shù)確診(晚期)KOA患者都患有雙側(cè)KOA，因此本研究納入的患者都為雙側(cè)KOA患者，進(jìn)一步擴(kuò)充單側(cè)KOA患者數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析也是下一步工作的重點(diǎn)。