實(shí)時(shí)熒光RNA恒溫檢測(cè)在氣管支氣管結(jié)核療效監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值

徐銀娟 趙國(guó)連 崔曉利 黨麗云 康磊 周永

近年來，隨著內(nèi)鏡技術(shù)的日益進(jìn)步與不斷推廣，氣管支氣管結(jié)核有增多趨勢(shì)，并與10%～40%的活動(dòng)性肺結(jié)核患者有合并感染[1]。但由于氣管支氣管結(jié)核抗結(jié)核治療時(shí)間長(zhǎng)、藥物不良反應(yīng)重[2]、缺乏靈敏且有效的療效監(jiān)測(cè)方法，難以實(shí)時(shí)掌握結(jié)核病患者病情和療效變化，不利于及時(shí)調(diào)整治療方案和降低傳播風(fēng)險(xiǎn)，使得相當(dāng)一部分患者的服藥依從性較差，導(dǎo)致治療失敗或產(chǎn)生耐藥。

隨著支氣管內(nèi)鏡治療被廣泛應(yīng)用于氣管支氣管結(jié)核，支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本的結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)也得以被廣泛使用。這其中有多種分子診斷方法被用于結(jié)核分枝桿菌的直接檢測(cè)，為結(jié)核病的診斷，特別是菌陰肺結(jié)核，提供了極大幫助。比如實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)、實(shí)時(shí)熒光RNA恒溫檢測(cè)技術(shù)(SAT-TB)，以及GeneXpert MTB/RIF，但這些方法在療效監(jiān)測(cè)方面的作用還有待探索。臨床中，結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)(如qRT-PCR)不能區(qū)分死菌和活菌，而結(jié)核分枝桿菌RNA檢測(cè)(如SAT-TB)則可有效區(qū)分[3]，表現(xiàn)出較高的診斷價(jià)值[4-5]，但對(duì)兩種方法應(yīng)用于支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本檢測(cè)的對(duì)比研究并不多，故筆者通過分析SAT-TB和qRT-PCR對(duì)氣管支氣管結(jié)核支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的檢出能力，為SAT-TB用于監(jiān)測(cè)抗結(jié)核藥物治療氣管支氣管結(jié)核效果提供依據(jù)。

資料和方法

一、研究對(duì)象

采用回顧性研究方法，選取西安市胸科醫(yī)院2021年1—12月確診[2]且符合入組標(biāo)準(zhǔn)的168例初治氣管支氣管結(jié)核患者。所有患者均為病原學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性，完成治療，且有MGIT 960培養(yǎng)、SAT-TB和qRT-PCR檢查結(jié)果；均為排除合并糖尿病、腫瘤、其他免疫系統(tǒng)疾病者及相關(guān)檢查不全者。168例患者中，男性66例(39.29%)，女性102例(60.71%)；年齡中位數(shù)(四分位數(shù))為32.5(26.2，53.8)歲。

二、 研究方法

所有患者均于入院1周內(nèi)及開始抗結(jié)核藥物治療前(基線期)進(jìn)行首次支氣管鏡檢查并送檢MGIT 960培養(yǎng)、SAT-TB和qRT-PCR檢查，此后至少每4周進(jìn)行1次支氣管鏡檢查及送檢以上3種方法檢測(cè)。

1.標(biāo)本收集及前處理：所有患者均經(jīng)纖維支氣管鏡檢查收集支氣管肺泡灌洗液10～15 ml，再將標(biāo)本混勻后分為3份，分別送檢MGIT 960培養(yǎng)、SAT-TB和qRT-PCR檢查。所有操作均按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[6]進(jìn)行。因本研究有94例患者每2周做1次支氣管鏡，74例患者每4周做1次支氣管鏡，故本研究選擇每2周做1次支氣管鏡的94例患者進(jìn)行3種檢測(cè)方法陽(yáng)性率和檢測(cè)效能評(píng)價(jià)的分析，選擇全部患者進(jìn)行陰轉(zhuǎn)時(shí)間評(píng)價(jià)的分析。

2.MGIT 960培養(yǎng)及菌種鑒定：取2 ml混勻的支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本按照1∶1體積加入4%NaOH溶液中處理15 min，3000×g離心20 min，棄上清后經(jīng)0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌后取0.5 ml上清至配置好的MGIT培養(yǎng)管中，置于BACTEC MGIT 960培養(yǎng)儀中，由儀器自動(dòng)監(jiān)測(cè)并報(bào)告結(jié)果(儀器培養(yǎng)時(shí)間最長(zhǎng)為42 d報(bào)告結(jié)果)。若BACTEC MGIT 960系統(tǒng)報(bào)告陽(yáng)性，則取出培養(yǎng)管進(jìn)行涂片抗酸染色以確認(rèn)是否為抗酸桿菌，若抗酸桿菌陽(yáng)性則進(jìn)行MPB64蛋白免疫膠體金法(杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司)檢測(cè)以進(jìn)一步鑒定菌種，MPB64蛋白陽(yáng)性為結(jié)核分枝桿菌，陰性則為非結(jié)核分枝桿菌。若 BACTEC MGIT 960系統(tǒng)報(bào)告陰性，則視為分枝桿菌培養(yǎng)陰性。

3.SAT-TB：取1 ml支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本液化離心洗滌后，加50 μl RNA裂解緩沖液，超聲15 min(功率300 W)，15 000×g離心5 min，上清即為擴(kuò)增模板。采用結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒(RNA 恒溫?cái)U(kuò)增；購(gòu)自上海仁度生物科技股份公司)，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。擴(kuò)增儀器為ABI 7500熒光定量PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。儀器每分鐘捕獲1次熒光，實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)實(shí)時(shí)熒光信號(hào)的出現(xiàn)時(shí)間和強(qiáng)度判斷。儀器捕獲熒光產(chǎn)生的樣本曲線與閾值線(閾值線設(shè)置為超過正常陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn))交點(diǎn)橫坐標(biāo)讀數(shù)即為dt值(探測(cè)時(shí)間，detection time，1dt=1 min)。dt值<40為陽(yáng)性，dt值≥40為陰性。

4.qRT-PCR：取1 ml支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本液化離心洗滌后，向沉淀中加入50 μl核酸提取液并轉(zhuǎn)入帶磁珠的核酸提取管中，提取儀快速振蕩10 min，然后95 ℃水浴5 min，取2 μl提取好的核酸溶液加入18 μl PCR擴(kuò)增試劑中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增試劑為分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針法；北京博奧晶典生物科技有限公司)，擴(kuò)增儀器為ABI 7500熒光定量PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。按照說明書操作。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以“中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q1，Q3)]”描述，兩組間差異的比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以“百分率(%)”描述，兩組間差異的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。一致性檢驗(yàn)Kappa值介于0.00～0.20為極低一致性，0.21～0.40為一般一致性，0.41～0.60為中等一致性，0.61～0.80為高度一致性，0.81～1.00為幾乎完全一致。當(dāng)一致性檢驗(yàn)受結(jié)果分布影響較大時(shí)，采用符合率和受試者工作特征(ROC)曲線分析，計(jì)算曲線下面積(AUC)，AUC越接近于1，說明診斷效果越好；AUC介于0.7～0.9表明診斷具有一定準(zhǔn)確性，介于0.5～0.7為準(zhǔn)確性較低，<0.5為無診斷價(jià)值。

結(jié) 果

一、三種方法在氣管支氣管結(jié)核患者治療期間檢測(cè)陽(yáng)性率下降情況

對(duì)每2周做1次支氣管灌洗的94例患者標(biāo)本進(jìn)行MGIT 960培養(yǎng)、qRT-PCR和SAT-TB檢測(cè)結(jié)果的分析，發(fā)現(xiàn)三者從基線至治療12周的陽(yáng)性率均呈下降趨勢(shì)，其中，qRT-PCR和SAT-TB從基線至12周陽(yáng)性例數(shù)下降幅度分別為67.81%(59/87)和82.95%(73/88)，均低于MGIT 960培養(yǎng)的98.78%(81/82)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為28.472和12.469，P值均<0.001)，即qRT-PCR和SAT-TB陽(yáng)性率下降慢于MGIT 960培養(yǎng)法。另外，qRT-PCR和SAT-TB在基線期與MGIT 960培養(yǎng)陽(yáng)性率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)，但治療2、4、6、8、10及12周時(shí)的陽(yáng)性率均明顯高于MGIT 960培養(yǎng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。具體見表1和圖1。

表1 以MGIT 960培養(yǎng)為參照標(biāo)準(zhǔn)qRT-PCR和SAT-TB檢測(cè)94例氣管支氣管結(jié)核患者標(biāo)本的陽(yáng)性情況

圖1 治療期間三種方法檢測(cè)陽(yáng)性率下降情況

二、qRT-PCR和SAT-TB以MGIT 960培養(yǎng)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)效能

以MGIT 960培養(yǎng)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，qRT-PCR對(duì)上述94例患者在不同檢測(cè)點(diǎn)(基線，治療2、4、6、8、10及12周)檢測(cè)的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、Kappa值、符合率和ROC曲線下面積(AUC)均明顯低于SAT-TB，具體見表2。

表2 qRT-PCR和SAT-TB以MGIT 960培養(yǎng)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)對(duì)94例氣管支氣管結(jié)核患者的檢測(cè)效能

續(xù)表2

三、MGIT 960培養(yǎng)不同陰轉(zhuǎn)時(shí)間與SAT-TB檢測(cè)肺泡灌洗液標(biāo)本dt值的關(guān)系

根據(jù)MGIT 960培養(yǎng)陰轉(zhuǎn)時(shí)間將168例氣管支氣管結(jié)核患者分為3組，即1～4周組(74例)、5～8周組(68例)和9周及以上組(26例)。分析不同MGIT 960陰轉(zhuǎn)時(shí)間組首次肺泡灌洗液標(biāo)本SAT-TB檢測(cè)dt值的差異。結(jié)果顯示，1～4周組的dt值[7.264(4.891，10.990)]與5～8周組[5.113(3.520，6.390)]和9周及以上組[5.222(4.068，6.886)]的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-4.318，P<0.001；Z=-2.017，P=0.044)，但5～8周組與9周及以上組的dt值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.219，P=0.223)。

討 論

SAT-TB是建立在實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)和RNA恒溫技術(shù)基礎(chǔ)上的新一代核酸檢測(cè)技術(shù)，其原理是以結(jié)核分枝桿菌特異的16S rRNA為檢測(cè)靶標(biāo)，在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA多聚酶的共同作用下實(shí)現(xiàn)核酸恒溫?cái)U(kuò)增RNA，熒光標(biāo)記的探針與靶標(biāo)片段的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交后釋放出熒光信號(hào)，并用儀器進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)，從而判斷樣本中是否存在結(jié)核分枝桿菌。SAT-TB技術(shù)30 min左右可將模板擴(kuò)增109倍[7]，大大減少了檢測(cè)時(shí)間，具有反應(yīng)速度快和擴(kuò)增效率高的特點(diǎn)。又因RNA在結(jié)核分枝桿菌死亡后會(huì)很快降解，故其僅存在于活菌中，因此，以RNA作為檢測(cè)靶標(biāo)不僅可以區(qū)分結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌，還可以監(jiān)測(cè)抗結(jié)核治療效果[8]。

有研究發(fā)現(xiàn)，女性是肺結(jié)核患者合并支氣管結(jié)核的危險(xiǎn)因素[9]。本組氣管支氣管結(jié)核患者多為中青年，且女性多于男性，約為2∶1，與以往報(bào)道基本接近[10-11]，進(jìn)一步提示應(yīng)關(guān)注女性肺結(jié)核患者合并支氣管結(jié)核狀況。對(duì)94例2周進(jìn)行1次支氣管鏡灌洗檢查的患者治療期間的MGIT 960培養(yǎng)、qRT-PCR 和SAT-TB檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)qRT-PCR和SAT-TB在基線期的檢測(cè)陽(yáng)性率(92.55%和93.62%)與MGIT 960培養(yǎng)(87.23%)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明3種方法對(duì)于患者初診時(shí)的檢測(cè)能力相近。但3種方法在治療監(jiān)測(cè)期間，從治療第2周至第12周的陽(yáng)性檢出率均呈下降趨勢(shì)，且qRT-PCR和SAT-TB的下降幅度均明顯低于MGIT 960培養(yǎng)，即MGIT 960培養(yǎng)的陽(yáng)性率下降最快，qRT-PCR下降最慢。筆者分析原因可能為：首先，MGIT 960培養(yǎng)檢測(cè)的敏感度通常低于分子生物學(xué)方法[12]，且隨著治療過程中排菌量的減少及細(xì)菌活性降低，部分患者會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)陰性早于分子生物學(xué)檢測(cè)的情況，這可能是在治療過程中有很多患者已沒有活菌排出，但其排出的死菌或者殘留的結(jié)核分枝桿菌DNA片段卻可以造成qRT-PCR檢測(cè)“陽(yáng)性”。其次，SAT-TB是以RNA作為檢測(cè)的靶標(biāo)，假陽(yáng)性的檢測(cè)概率較低，較qRT-PCR能更迅速地反映當(dāng)前治療效果，可作為療效監(jiān)測(cè)的重要檢測(cè)方法。但本研究顯示SAT-TB檢測(cè)陽(yáng)性率較MGIT 960培養(yǎng)仍有一定滯后性，這一結(jié)果與胡永領(lǐng)等[13]研究結(jié)果有所差異，該研究在長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月的動(dòng)態(tài)觀察中發(fā)現(xiàn)SAT-TB與MGIT 960培養(yǎng)陽(yáng)性率始終不相上下，這可能是由于試劑、實(shí)驗(yàn)室操作及研究人群差異導(dǎo)致。

以MGIT 960培養(yǎng)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)對(duì)qRT-PCR與SAT-TB進(jìn)行檢測(cè)效能分析，發(fā)現(xiàn)在治療開始至12周各檢測(cè)點(diǎn)SAT-TB的檢測(cè)效能指標(biāo)均高于qRT-PCR，與MGIT 960培養(yǎng)的一致性均高于qRT-PCR，但在不同檢測(cè)點(diǎn)的檢測(cè)一致性程度差異較大，Kappa值介于0.107～0.620之間，考慮到一致性檢驗(yàn)受結(jié)果分布影響較大，故筆者又采用符合率和ROC曲線分析qRT-PCR和SAT-TB與MGIT 960培養(yǎng)的一致性程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從基線至治療第12周檢測(cè)，SAT-TB與MGIT 960培養(yǎng)的符合率(63.83%～89.36%)和AUC(0.642～0.814)也均明顯高于qRT-PCR(48.94%～84.04%；0.553～0.715)，這與吳聯(lián)朋[14]的研究結(jié)果基本一致。說明SAT-TB與MGIT 960培養(yǎng)的一致程度更高，總體檢測(cè)效能更好，同時(shí)也意味著療效監(jiān)測(cè)效果更好。

SAT-TB檢測(cè)產(chǎn)生的實(shí)時(shí)放大信號(hào)dt值可用于結(jié)核分枝桿菌的相對(duì)定量，有助于結(jié)核病治療的臨床管理。筆者探討了在不同MGIT 960培養(yǎng)陰轉(zhuǎn)時(shí)間首次SAT-TB檢測(cè)dt值的差異，結(jié)果顯示，1～4周內(nèi)陰轉(zhuǎn)患者的dt值明顯高于4周以上陰轉(zhuǎn)患者的dt值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而5～8周陰轉(zhuǎn)患者的dt值與9周及以上陰轉(zhuǎn)患者的dt值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能是抗結(jié)核治療后第1個(gè)月的菌載量下降得最快，而1個(gè)月后的下降趨于緩慢，且下降幅度基本平穩(wěn)的原因。這一結(jié)果也被胡永領(lǐng)等[13]研究所證實(shí)，提示如果抗結(jié)核治療4周內(nèi)細(xì)菌載量下降明顯，則可預(yù)示患者陰轉(zhuǎn)時(shí)間快，治療效果良好。

綜上所述，SAT-TB用于病原學(xué)陽(yáng)性氣管支氣管結(jié)核患者的療效監(jiān)測(cè)時(shí)，監(jiān)測(cè)效果與MGIT 960培養(yǎng)的一致性高。但是相對(duì)于MGIT 960培養(yǎng)周期長(zhǎng)的嚴(yán)重不足，SAT-TB更能滿足臨床快速診斷的要求。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)徐銀娟和趙國(guó)連：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)施具體研究、收集分析數(shù)據(jù)、撰寫文章及審閱修改；崔曉利和黨麗云：參與設(shè)計(jì)、完善實(shí)驗(yàn)步驟、幫助實(shí)施研究、分析解釋部分?jǐn)?shù)據(jù)；康磊和周永：指導(dǎo)部分研究、幫助采集分析數(shù)據(jù)