樹(shù)突細(xì)胞miR-17調(diào)節(jié)初始CD4+T淋巴細(xì)胞分化Treg/Th17失衡機(jī)制的研究

盛云峰 邱美華 陳園園 孫麗芳 甄利波

結(jié)核分枝桿菌感染后會(huì)啟動(dòng)依賴于細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答，通過(guò)抗原提呈細(xì)胞如樹(shù)突細(xì)胞(dendritic cells，DC)將細(xì)菌抗原提呈給初始T細(xì)胞，進(jìn)而分化為效應(yīng)性T細(xì)胞。當(dāng)再次接觸結(jié)核分枝桿菌抗原后，通過(guò)分泌多種炎癥介質(zhì)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞功能從而殺滅結(jié)核分枝桿菌。但有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌感染后機(jī)體的這種適應(yīng)性免疫應(yīng)答可發(fā)生失調(diào)，導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌不能被完全清除[1]。微小RNA(miRNA)是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼RNA分子，為表觀遺傳調(diào)控機(jī)制之一。研究表明，miRNA參與調(diào)節(jié)人體各種免疫過(guò)程，在人類(lèi)的腫瘤及自身免疫性疾病中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種miRNA的表達(dá)改變[2-3]?；赟olexa測(cè)序和qPCR方法的研究發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核患者的血清miRNA-17(簡(jiǎn)稱“miR-17”)的表達(dá)顯著增加[4]。筆者通過(guò)研究肺結(jié)核患者的DC內(nèi)miR-17的表達(dá)及肺結(jié)核患者的DC對(duì)初始CD4+T淋巴細(xì)胞分化的作用，探討miR-17參與調(diào)控結(jié)核分枝桿菌感染宿主的免疫失衡的相關(guān)機(jī)制。

對(duì)象和方法

一、 研究對(duì)象

選擇2022年2月1日至4月30日在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市胸科醫(yī)院收治的肺結(jié)核患者20例(肺結(jié)核組)，同時(shí)收集同期門(mén)診的健康體檢者20名(健康對(duì)照組)。研究經(jīng)浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市胸科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號(hào)：[2022]研審第(62)號(hào)。肺結(jié)核組：男性12例、女性8例，年齡為22～42歲；健康對(duì)照組：男性11例、女性9例，年齡為24～38歲。肺結(jié)核患者的診斷均符合《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》[5]的標(biāo)準(zhǔn)，并排除結(jié)核性胸膜炎和肺外結(jié)核。健康對(duì)照組入組標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)肺結(jié)核臨床表現(xiàn)，無(wú)胸部影像學(xué)檢查異常。兩組研究對(duì)象均為浙江省的漢族人群，無(wú)合并其他傳染病、慢性病、腫瘤和自身免疫性疾病。

二、研究方法

1.主要試劑和儀器：人淋巴細(xì)胞分離液 Ficoll-Paque(美國(guó) GE公司)；初始 CD4+T淋巴細(xì)胞分離試劑盒；人T細(xì)胞活化劑CD3/CD28購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；GM-CSF 購(gòu)自美國(guó)R&D System公司；抗人Foxp3抗體購(gòu)自英國(guó)AbCAM公司；Trizol液購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；miRNA提取試劑盒、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及mRNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司；miR 陰性對(duì)照物(miR NC)、miR-17模擬物(miR-17 mimic)和miR-17抑制劑(miR-17 inhibitor)均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱為T(mén)hermo Scientific(3111)；倒置顯微鏡為Olympus(CX23)；超凈工作臺(tái)為蘇信(YJ-840/YJ-1340)；低速離心機(jī)為Eppendorff(5810R)；分光光度計(jì)為Beckman(DU730)；流式細(xì)胞儀為BD(Accuri C6)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為Agilent(Stratagene MX3005p)。

2.健康對(duì)照組外周血初始CD4+T淋巴細(xì)胞的分離： 人濃縮白細(xì)胞加入磷酸鹽緩沖液(PBS)，稀釋 2～4倍; 稀釋過(guò)的濃縮白細(xì)胞加入到15 ml的Ficoll 上， 400×g離心35 min，取出外周血單個(gè)核細(xì)胞層(PBMC); 加入PBS 300×g離心10 min洗滌1～2次。取 1×108的細(xì)胞加入0.4 ml PBS+BSA重懸細(xì)胞，再加入100 μl初始CD4+T淋巴細(xì)胞生物素-抗體Ⅱ混勻，4 ℃放置10 min。加入10～20 ml緩沖液，300×g離心10 min后去上清。加入0.8 ml純化緩沖液和 200 μl抗生物素微珠混勻，4 ℃放置15 min；加入10～20 ml緩沖液，300×g離心10 min，去上清。加入0.5 ml緩沖液重懸細(xì)胞，以LS柱分選獲得初始CD4+T淋巴細(xì)胞。

3.肺結(jié)核組外周血DC的分離與分化：取肺結(jié)核患者外周抗凝血10 ml轉(zhuǎn)入離心管中，吸取10 ml PBS稀釋并混勻，置于離心管中，1500×g離心10 min，去上清，加入1 ml紅細(xì)胞裂解液，靜置3 min，再加9 ml PBS溶液，1500×g離心10 min，棄上清，重懸細(xì)胞，加入1640培養(yǎng)基；第3天，1500×g離心5 min，棄上清，加入新鮮1640培養(yǎng)基(含10 ng/ml GM-CSF)；第6天，1000×g離心5 min，棄上清，將細(xì)胞重新種植于150 mm直徑的培養(yǎng)皿中，加入新鮮1640培養(yǎng)基；第9天，1000×g離心5 min，棄上清，培養(yǎng)皿底部的松散貼壁細(xì)胞即為未成熟樹(shù)突細(xì)胞(imDC)。取部分上述細(xì)胞，加入PBS洗1次，1000×g離心3 min；調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105細(xì)胞懸液1 ml，加入10 μl 抗人Foxp3抗體，室溫下避光孵育45 min，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。將上述imDC按照5×106/ml密度，接種于100 mm 直徑的培養(yǎng)皿中，加入10 ml新鮮1640完全培養(yǎng)基，即可得到成熟DC。

4.成熟DC與初始CD4+T淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)分3組，miR陰性對(duì)照組、miR-17模擬物組和miR-17抑制劑組。將上述來(lái)源于肺結(jié)核組的成熟DC與來(lái)源于健康對(duì)照組的初始CD4+T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)于96孔板中，加入1640完全培養(yǎng)基(含人T淋巴細(xì)胞活化劑CD3/CD28)；同時(shí)分別加入miR 陰性對(duì)照物、miR-17 模擬物、miR-17 抑制劑，將5 μl miRNA稀釋到500 μl的血清培養(yǎng)基中。將10 μl脂質(zhì)體2000稀釋到500 μl的血清培養(yǎng)基中，輕輕混勻，靜置5 min。將miRNA溶液加入到脂質(zhì)體2000溶液中，輕輕混勻，靜置20 min；將細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液吸出，重新加入5 ml新鮮的培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的1640)。將兩種混合溶液加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。將上述細(xì)胞調(diào)整到密度為1×105/ml，各取1 ml。固定和破膜后再分別進(jìn)行抗Foxp3-488和抗IL-17A-PE標(biāo)記。流式細(xì)胞儀檢測(cè)含有此兩種特異性標(biāo)記的Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞的比例。

5．蛋白免疫印跡法檢測(cè)CD4+T淋巴細(xì)胞內(nèi)蛋白Eos：收集上述細(xì)胞，于冰上裂解30 min。裂解完后，于4 ℃下12 000×g離心5 min。上清液轉(zhuǎn)移至新的潔凈EP管內(nèi)進(jìn)行定量。制膠完成后取適量樣品上清加入樣品孔中，旁孔加入預(yù)染的蛋白標(biāo)記物。經(jīng)過(guò)電泳-轉(zhuǎn)膜封閉后，進(jìn)行一抗、二抗孵育。以三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)部對(duì)照。配制ECL發(fā)光液，加入化學(xué)反應(yīng)底物，利用成像系統(tǒng)進(jìn)行成像分析。

6. 檢測(cè)DC中miR-17及CD4+T淋巴細(xì)胞中Eos mRNA的基因表達(dá)水平：以江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司試劑盒對(duì)目標(biāo)基因的mRNA表達(dá)量進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，操作按照說(shuō)明書(shū)。對(duì)miR-17的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，以U6作為內(nèi)部對(duì)照；對(duì)Eos mRNA表達(dá)量進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，以GAPDH作為內(nèi)部對(duì)照。相應(yīng)引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。繪制熔解曲線。采用2-△△Ct方法進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、肺結(jié)核患者的DC中miR-17基因表達(dá)水平

利用miR-17及U6的特異性引物進(jìn)行qPCR檢測(cè)miR-17的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核組DC的miR-17基因表達(dá)水平(12.546±1.572)明顯高于健康對(duì)照組DC的表達(dá)水平(2.409±1.097)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=28.356，P<0.05)。

二、 轉(zhuǎn)染miR-17模擬物及抑制劑的DC對(duì)初始CD4+T淋巴細(xì)胞分化的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)標(biāo)記抗Foxp3-488和抗IL-17A-PE的初始CD4+T淋巴細(xì)胞。計(jì)算Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞的比例。miR-17模擬物組的Treg細(xì)胞比例[(4.740±0.901) %]明顯低于miR陰性對(duì)照組[(59.235±4.652) %]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=50.755，P<0.01)；miR-17模擬物組的Th17細(xì)胞比例[(67.610±3.495) %]明顯高于miR陰性對(duì)照組[(27.645±2.075) %]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=38.521，P<0.01)。miR-17抑制劑組的Treg細(xì)胞比例[(83.080±5.770) %]明顯高于miR陰性對(duì)照組[(59.235±4.652) %]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.988，P<0.01)；miR-17抑制劑組的Th17細(xì)胞比例[(11.405±1.777) %]明顯低于miR陰性對(duì)照組[(27.645±2.075) %]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=27.044，P<0.01)。

三、轉(zhuǎn)染miR-17模擬物及抑制劑的肺結(jié)核患者的DC對(duì)初始CD4+T淋巴細(xì)胞的Eos mRNA基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

miR-17模擬物組的初始CD4+T淋巴細(xì)胞內(nèi)EosmRNA基因轉(zhuǎn)錄水平(0.181±0.123)下調(diào)至38.4%，明顯低于miR陰性對(duì)照組(0.471±0.217)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.449,P<0.05)；miR-17抑制劑組的初始CD4+T淋巴細(xì)胞內(nèi)EosmRNA基因轉(zhuǎn)錄水平(0.889±0.295)上調(diào)至1.887倍，明顯高于miR陰性對(duì)照組(0.471±0.217)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.635，P<0.05)。

四、蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)初始CD4+T淋巴細(xì)胞內(nèi)蛋白Eos的表達(dá)

miR-17模擬物組的初始CD4+T淋巴細(xì)胞內(nèi)Eos相對(duì)表達(dá)量(3.626±1.319)減少至77.7%，明顯低于miR陰性對(duì)照組(4.664±1.456)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.528,P<0.05)；miR-17抑制劑組的初始CD4+T淋巴細(xì)胞內(nèi)Eos相對(duì)表達(dá)量(6.148±1.701)增加至1.318倍，明顯高于miR陰性對(duì)照組(4.664±1.456)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.035，P<0.05)(圖1)。

注 *P<0.05； **P<0.01；GAPDH：三磷酸甘油醛脫氫酶；miR NC：miR陰性對(duì)照組；miR-17 mimics：miR-17模擬物組；miR-17 inhibitor：miR-17 抑制劑組圖1 miR-17模擬物和miR-17抑制劑轉(zhuǎn)染樹(shù)突細(xì)胞對(duì)初始CD4+T淋巴細(xì)胞蛋白Eos表達(dá)水平的影響

討 論

Th17細(xì)胞通過(guò)分泌白細(xì)胞介素-17A(IL-17A)、IL-17F、IL-21等多種炎癥因子介導(dǎo)免疫反應(yīng)，可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞募集活化，參與機(jī)體對(duì)胞內(nèi)菌感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)。Treg細(xì)胞是高表達(dá)CD25、低表達(dá)CD127的一組CD4+T淋巴抑制細(xì)胞，具有阻斷T淋巴效應(yīng)細(xì)胞(Teff)的功能。Treg細(xì)胞能特異性表達(dá)具有穩(wěn)定細(xì)胞功能的蛋白Foxp3。此外，還有其他特征性編碼基因(如Il2ra、Ctla4、Tnfrsf18、Ikzf2、Ikzf4等)在發(fā)揮Treg細(xì)胞的功能上也起著重要的作用[6-9]。在機(jī)體健康狀態(tài)下，Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞保持動(dòng)態(tài)平衡。初始CD4+T淋巴細(xì)胞在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、IL-6等多種炎癥因子的作用下可以分化為T(mén)reg細(xì)胞和Th17細(xì)胞。DC作為重要的抗原遞呈細(xì)胞，在機(jī)體適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用[10]。有研究顯示，活動(dòng)性肺結(jié)核患者體內(nèi)Treg細(xì)胞數(shù)量明顯增多[11]，與本研究的結(jié)果相一致。本研究還發(fā)現(xiàn)與肺結(jié)核患者的DC共培養(yǎng)的初始CD4+T淋巴細(xì)胞在DC受到miR-17基因抑制時(shí)其分化發(fā)生了偏移。提示miR-17在Treg/Th17分化失衡中發(fā)揮了一定作用，也可能參與了結(jié)核分枝桿菌感染的過(guò)程。

miRNA為長(zhǎng)度約20～24個(gè)核甘酸的非編碼小分子，可與mRNA分子中的互補(bǔ)序列結(jié)合而切斷mRNA鏈，影響基因表達(dá)。miRNA還能通過(guò)縮短 poly(A)尾增加mRNA的不穩(wěn)定性，也可降低核糖體翻譯mRNA的效率，從而導(dǎo)致基因沉默[12]。miRNA廣泛參與細(xì)胞基因表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥反應(yīng)、腫瘤發(fā)生等多種細(xì)胞反應(yīng)。由于miRNA穩(wěn)定性高，且能被快速定量檢測(cè)，因此，可作為一種非侵襲性的生物標(biāo)志物監(jiān)測(cè)疾病的發(fā)生和發(fā)展[13]。當(dāng)機(jī)體與結(jié)核分枝桿菌相互作用后，細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)凋亡、自噬、極化和主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ(MHCⅡ)類(lèi)表達(dá)等反應(yīng)。而這些細(xì)胞反應(yīng)主要是由miRNA通過(guò)固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)[14]。體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，miRNA除了通過(guò)多種信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)結(jié)核分枝桿菌感染后的機(jī)體免疫過(guò)程，還可能通過(guò)調(diào)節(jié)DC的免疫反應(yīng)參與固有免疫和適應(yīng)性免疫的轉(zhuǎn)換[15]。Tu等[16]研究發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核患者血清中miR-17的表達(dá)明顯增加。本研究也發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核患者的DC內(nèi)miR-17的表達(dá)水平明顯升高，可作為結(jié)核分枝桿菌感染的生物標(biāo)志物。有研究顯示，miR-17通過(guò)直接靶向酪氨酸蛋白激酶(janus kinase 1，JAK1) 和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)抑制IL-6家族自分泌而發(fā)揮抗炎作用[17]；miR-17可以負(fù)性調(diào)節(jié)Toll樣受體4(TLR4)，從而抑制巨噬細(xì)胞中炎癥因子IL-1β和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的濃度，減輕膿毒癥的炎癥反應(yīng)[18]; miR-17 可以提高IL-18表達(dá)水平，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)[19]; miR-17通過(guò)降低ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 A1(ABCA1)水平促進(jìn)炎癥細(xì)胞聚集等[20]，提示miR-17可能參與結(jié)核分枝桿菌感染機(jī)體后的一系列適應(yīng)性免疫應(yīng)答。

Eos是由位于第12號(hào)染色體(12q13.2)上的Ikzf4基因編碼的長(zhǎng)約585aa的一種蛋白質(zhì)，屬于Ikaros家族鋅指蛋白2中的一種。同時(shí)也是一種主要在Treg細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在維持Treg細(xì)胞穩(wěn)定性和抑制性上起著關(guān)鍵性作用。有研究證實(shí)了卡介苗處理后在Treg細(xì)胞Eos基因中發(fā)現(xiàn)8個(gè)CpG高度去甲基化，從而更有利于促進(jìn)Treg細(xì)胞的發(fā)育成熟[21]。另有研究發(fā)現(xiàn)，Eos與Treg細(xì)胞Foxp3形成復(fù)合物有助于維持Treg細(xì)胞的表型，且Eos下調(diào)能夠誘導(dǎo)Treg細(xì)胞向Th輔助細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，CD4+T淋巴細(xì)胞與轉(zhuǎn)染了miR-17模擬物的DC共培養(yǎng)后，其Eos基因表達(dá)減少，而抑制DC的miR-17表達(dá)后，共培養(yǎng)的CD4+T淋巴細(xì)胞的Eos基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)均明顯增加，Treg細(xì)胞分化比例明顯升高，表明miR-17可能通過(guò)調(diào)節(jié)Eos的表達(dá)影響CD4+T淋巴細(xì)胞的分化，進(jìn)而調(diào)節(jié)Treg/Th17的平衡。這一結(jié)果提示Eos可能是miR-17控制Th17分化的靶點(diǎn)，通過(guò)抑制Eos增強(qiáng)Th17的分化。結(jié)核分枝桿菌感染后宿主復(fù)雜的適應(yīng)性免疫應(yīng)答過(guò)程中，miR-17究竟通過(guò)哪些信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，結(jié)核分枝桿菌感染后導(dǎo)致miR-17表達(dá)增加，Eos基因參與Th17/Treg的分化，進(jìn)而影響結(jié)核分枝桿菌引起的機(jī)體免疫反應(yīng)。而這一免疫反應(yīng)過(guò)程復(fù)雜多樣，其詳細(xì)的分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)盛云峰：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、分析數(shù)據(jù)和論文撰寫(xiě)；邱美華：指導(dǎo)、設(shè)計(jì)和修改；陳園園和孫麗芳：數(shù)據(jù)采集和統(tǒng)計(jì)分析；甄利波：審閱修改