聲光動力非熱殺菌技術(shù)的作用機(jī)制及 應(yīng)用研究進(jìn)展

王德華，李 璟，周 鳳，林少玲,3，張 怡,*，胡嘉淼,*

（1.福建農(nóng)林大學(xué) 閩臺特色海洋食品加工與營養(yǎng)健康教育部工程中心，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；3.福建農(nóng)林大學(xué) 肉食品安全生產(chǎn)技術(shù)國家重點實驗室，福建 福州 350002）

食品在熱加工過程中往往伴隨著原有風(fēng)味和營養(yǎng)物質(zhì)的流失，因此，現(xiàn)代食品工業(yè)對非熱加工技術(shù)的創(chuàng)新與應(yīng)用提出了迫切的需求。常見的非熱加工技術(shù)有高壓CO2、脈沖強(qiáng)光、脈沖電腸及光動力等，然而，脈沖強(qiáng)光、 脈沖電場等技術(shù)需要昂貴的設(shè)備購置費用，制約了該技術(shù)在傳統(tǒng)食品加工企業(yè)的普及。此外，光動力技術(shù)雖然具有良好的靶向性和廣譜滅菌的特點，以及操作簡便和設(shè)備價格低廉的優(yōu)勢，在果蔬食品保鮮[1-3]及食源性致病菌[4-5]滅活等領(lǐng)域得到成功應(yīng)用，但較差的穿透性將光動力技術(shù)局限于食品表面殺菌，限制了在不同形態(tài)和形狀食品中的技術(shù)推廣。因此，在光動力技術(shù)的基礎(chǔ)上，引入低頻超聲波，協(xié)同光源共同激發(fā)光敏劑，構(gòu)建具有良好穿透性、廣譜滅菌性和靶向性的新型非熱殺菌技術(shù)，即聲光動力非熱殺菌技術(shù)[6-7]。該技術(shù)是指聲光敏劑在超聲波、光源和氧氣的共同作用下，生成一系列活性氧物質(zhì)，從而造成微生物細(xì)胞損傷的一種新型殺菌方法。目前已有研究表明，聲光動力非熱殺菌技術(shù)存在協(xié)同作用，其對微生物的損傷效果優(yōu)于聲動力或光動力單獨作用[8-9]。此外，研究人員成功地將該技術(shù)應(yīng)用于果汁、肉糜等食品的貯藏保鮮，使得該技術(shù)在食源性微生物控制和食品品質(zhì)保持領(lǐng)域表現(xiàn)出了巨大的潛力。

1 聲光動力非熱殺菌技術(shù)的作用機(jī)制

1.1 聲光動力非熱殺菌技術(shù)的基本原理

聲光動力非熱殺菌技術(shù)的作用機(jī)制如圖1所示。聲光敏劑與微生物細(xì)胞共同避光孵育過程中，前者以聚集、沉淀或分散的方式附著在微生物細(xì)胞壁表面，在超聲波和LED光源的作用下生成活性氧，進(jìn)而引起微生物細(xì)胞的類程序凋亡[10]、細(xì)胞膜損傷、蛋白質(zhì)降解、核酸降解和細(xì)胞內(nèi)容物的泄漏等。

圖 1 聲光動力非熱殺菌技術(shù)的滅菌機(jī)制Fig. 1 Sterilization mechanism of sono/photodynamaic non-thermal sterilization technology

活性氧的產(chǎn)生依賴于機(jī)械能、熱能和光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的反應(yīng)過程，即能量的吸收與釋放的電子躍遷過程。機(jī)械能和熱能主要來源于超聲波在液體傳播過程中的聲空化效應(yīng)和熱效應(yīng)。光能主要來源于LED燈光源的照射。聲空化效應(yīng)過程中，微米級氣泡會在塌陷破裂的瞬間完成極小區(qū)域內(nèi)的能量釋放[11]，與空化作用相伴隨的內(nèi)摩擦可以形成電荷，并在氣泡內(nèi)因放電而產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，即聲致發(fā)光。有研究表明，在超聲波作用下，聲空化溫度可以達(dá)到5 000 K左右，并產(chǎn)生約250 MPa 的壓力[12]。

聲光敏劑在特定波長的光源照射下，可以吸收光子能量，從而完成電子躍遷過程。聲光敏劑在吸收能量后，由基態(tài)（S0）轉(zhuǎn)變?yōu)閱沃丶ぐl(fā)態(tài)（S1），單重激發(fā)態(tài)（S1）由于強(qiáng)烈的不穩(wěn)定性，會并進(jìn)一步完成系間穿越，轉(zhuǎn)變?yōu)槿丶ぐl(fā)態(tài)（S3），或以產(chǎn)生熒光的方式釋放能量，返回至基態(tài)（S0）。三重激發(fā)態(tài)（S3）具有較長的壽命，可以通過產(chǎn)生磷光的方式釋放額外能量，或轉(zhuǎn)移至合適的受體分子。受體分子接收能量后主要通過Type Ⅰ和Type Ⅱ 2 個途徑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，其反應(yīng)式分別為3PS*＋3O2→1PS＋1O2*和3PS*＋R→PS－＋R＋（PS表示光敏劑，*表示激發(fā)態(tài)）。TypeⅠ途徑：當(dāng)受體為有機(jī)分子時，處于三重激發(fā)態(tài)的光敏劑將與之反應(yīng)，生成亞穩(wěn)態(tài)的物質(zhì)，再與氧發(fā)生反應(yīng)，生成過氧化物或超氧化物等氧化性物質(zhì)，用于破壞生物膜結(jié)構(gòu)完整性，使生物膜的離子通透性增強(qiáng)，從而達(dá)到殺菌目的；TypeⅡ途徑：三重激發(fā)態(tài)分子的能量與氧轉(zhuǎn)換，形成具有細(xì)胞毒性的單線態(tài)氧（1O2）[13]。單線態(tài)氧具有較強(qiáng)的親電子性，可以氧化細(xì)胞膜及胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)上的不飽和脂肪酸等，抑制蛋白質(zhì)合成，造成DNA損傷，從而高效滅活細(xì)胞和微生物[13]。一般來說，Type Ⅱ途徑化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生活性氧物質(zhì)的過程比TypeⅠ途徑產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)簡單得多，因此，單線態(tài)氧被認(rèn)為是大多數(shù)聲光敏劑的聲光光動力活性的關(guān)鍵[14]。

此外，超聲波的空化效應(yīng)還具有機(jī)械損傷作用，可以改變細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)聲光敏劑滲透到細(xì)胞內(nèi)部，甚至直接作用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)，引起細(xì)胞死亡。

1.2 聲光動力非熱殺菌技術(shù)的作用靶點

微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)和組成成分的差異是影響聲光動力非熱殺菌效果的限制性因素。研究發(fā)現(xiàn)，革蘭氏陽性菌較革蘭氏陰性菌更容易受到聲光動力非熱殺菌技術(shù)的影響[15]，一般來說，革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁中含有肽聚糖和磷壁酸，但不含脂多糖，細(xì)胞壁較厚，為20～80 nm，肽聚糖彼此交聯(lián)，使得細(xì)胞壁具有一定的孔隙度，從而為聲光敏劑在細(xì)胞壁上的附著創(chuàng)造了條件。革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁含有脂多糖及極少肽聚糖，其厚度較薄，約為10 nm，但結(jié)構(gòu)卻很復(fù)雜，包括外壁層和內(nèi)壁層，復(fù)雜的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不利于光敏劑的滲透。目前，相關(guān)研究者提出了3 個作用靶點的假設(shè)，即細(xì)胞膜磷脂、膜蛋白和核酸，其中，膜蛋白被認(rèn)為是聲光動力作用的首選靶點，這不僅是因為膜蛋白的重要生理功能，還因為細(xì)菌細(xì)胞壁表面分布著很多膜蛋白，并且與光敏劑結(jié)合后能夠快速發(fā)生氧化損傷[16]。聲光動力的作用靶點多是細(xì)菌的外部結(jié)構(gòu)，具有非侵入性的優(yōu)勢，因此可以避免細(xì)菌通過阻斷吸收和增加代謝解毒等途徑產(chǎn)生抗藥性的可能[17]。

聲光動力通過破壞上述靶點，誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞發(fā)生形態(tài)和功能上的變化。聲光動力處理后，細(xì)菌細(xì)胞壁的完整性受到損傷，內(nèi)容物泄漏，膜轉(zhuǎn)運體系失效。功能上的變化則是由膜電位紊亂、蛋白質(zhì)和酶的失活以及正常代謝受到抑制引起的[18]。在姜黃素和多黏菌素B介導(dǎo)的光動力對銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的研究中發(fā)現(xiàn)，光動力處理會使銅綠假單胞菌的細(xì)胞膜受到致命損傷，電導(dǎo)率顯著增加，蛋白質(zhì)和DNA被嚴(yán)重降解，出現(xiàn)凋亡信號[10]。

2 聲光動力的影響因素

2.1 聲光敏劑

聲光敏劑是指選擇性作用于目標(biāo)細(xì)胞的一類化學(xué)物質(zhì)，在一定的超聲波和光源作用下可以產(chǎn)生活性氧作用于細(xì)胞靶點。聲光敏劑既是聲敏劑，又是光敏劑。聲光敏劑的理化特性和結(jié)構(gòu)特性是決定聲光動力作用效果的核心要素。理想的聲光敏劑應(yīng)該具備以下優(yōu)點：1）安全、無毒，對非靶標(biāo)細(xì)胞不會產(chǎn)生聲光毒力作用；2）聲光作用高效，能夠產(chǎn)生大量活性氧；3）具有穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，僅在暴露于超聲波和光源時才具有理化活性[19]。

聲光敏劑發(fā)展至今，主要包括血卟啉及其衍生物[20]、 稠環(huán)醌類化合物、酞菁類化合物等。然而，上述傳統(tǒng)的聲光敏劑存在水溶性低、靶向性差、穩(wěn)定性差、利用率低等問題[21]，現(xiàn)在的研究熱點多集中于聲光敏劑的改造，這些改造方法有納米化、脂質(zhì)體和多聚體等，姜黃素作為食品級的聲光敏劑受到了廣泛關(guān)注。Li Tianmi等[22]研究姜黃素-殼聚糖介導(dǎo)的光動力對金黃色葡萄球菌及其在不銹鋼表面的生物膜的滅活作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，姜黃素-殼聚糖的濃度與滅活效果具有顯著相關(guān)性，25 μmol/L 姜黃素-殼聚糖對金黃色葡萄球菌的滅活率達(dá)99.9%以上，在涂有金黃色葡萄球菌生物膜的不銹鋼表面，噴灑姜黃素-殼聚糖和光照10 min處理后，活菌數(shù)減少 5.0（lg（CFU/cm2））（初始值為5.6（lg（CFU/cm2）））。 Yao Tiantian等[23]基于傳統(tǒng)光敏劑亞甲基藍(lán)與β-環(huán)糊精之間的主客體相互作用，研制了一種光動力抗菌涂層，該涂層的研制有效解決了光敏劑在涂層上聚集分布的問題，提高了單重態(tài)氧的產(chǎn)量，進(jìn)一步研究表明，盡管亞甲基藍(lán)的密度很低，但仍然具有良好的光動力抗菌能力，（0.53±0.06）μg/cm2的亞甲基藍(lán)密度便能夠抑制金黃色葡萄球菌的生長。近年來，納米技術(shù)的革命性發(fā)展對光動力領(lǐng)域產(chǎn)生了重大影響，與常規(guī)光敏劑相比較，納米光敏劑顆粒小、比表面積大、表面反應(yīng)活性高、活性中心多、催化效率高、吸附能力強(qiáng)，如金納米離子、介孔二氧化硅納米顆粒等。此外，碳納米管、石墨烯、富勒烯及二氧化鈦等已經(jīng)被應(yīng)用于聲光動力領(lǐng)域[24]。 Pourhaji bagher等[25]制備了姜黃素納米顆粒 （NM@CUR），并將其與姜黃素介導(dǎo)的聲動力進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，姜黃素介導(dǎo)的聲動力可以將變形鏈球菌的數(shù)量顯著減少90.8%（P＜0.05），而NM@CUR處理后，變形鏈球菌數(shù)量顯著減少99.9%（P＜0.05），同時發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平較對照組分別增加7.3、10.8 倍。

2.2 超聲波

超聲波是一種頻率大于20 kHz的聲波，是一種具有良好穿透性、方向性和反射性的振動能量形式。在食品工業(yè)中，超聲波通常由頻率為20 kHz～10 MHz的超聲波換能器產(chǎn)生，具有環(huán)保、高效、無毒、低成本的 優(yōu)勢[26]。前文關(guān)于聲動力的滅菌機(jī)理已經(jīng)提及，超聲波的頻率和強(qiáng)度是聲動力滅菌的限制性因素。一般來講，超聲波的頻率越高，強(qiáng)度越大，產(chǎn)生的能量越多，其聲動力滅菌作用效果也就越明顯，但在超聲波頻率增大的同時也會伴隨著超聲傳播的衰減[27]，故在進(jìn)行聲動力滅菌的同時要注意選擇合適的超聲強(qiáng)度和頻率，以提高滅菌效率與質(zhì)量，節(jié)約滅菌成本[12]。

2.3 光源

目前有研究表明，光源是光動力的3 個重要條件之一，光動力的抗菌效果取決于所使用的波長[28]。光源的選擇需要考慮如下因素：1）與光敏劑的吸收光譜相適應(yīng)；2）有適當(dāng)?shù)妮敵龉β剩?）具有一定的穿透性，光照區(qū)域邊界靈敏；4）光譜范圍界定明顯；5）工作性能穩(wěn)定。

必須強(qiáng)調(diào)的是，光的頻率與其波長成反比，與光子能量直接相關(guān)。短波長的光攜帶更高的光子能量，從而具有更大的生物效應(yīng)。de Carvalho等[29]研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)光照射和紅光照射均對生物膜具有明顯的抑制作用，且單種微生物的菌落總數(shù)明顯下降，此外，藍(lán)光照射對伴生放線菌、牙齦假單胞菌、口腔沙門氏菌的活性降低作用更為明顯，紅光對核假單胞菌的殺菌效果更好，藍(lán)光可將三氯乙烷光敏劑從基態(tài)激發(fā)到更高能級，從而產(chǎn)生更多單重態(tài)氧物質(zhì)。Shakhova等[30]研究指出，藍(lán)光對三氯乙烷有更高的表面沖擊力和更緊密的匹配，該結(jié)論進(jìn)一步解釋了de Carvalho等[29]的研究結(jié)果。

3 聲光動力非熱殺菌技術(shù)的應(yīng)用

3.1 食品級聲光敏劑

目前已經(jīng)有諸多食品級聲光敏劑的研究報道，包括姜黃素、葉黃素、核黃素、金絲桃素和葉綠素等，然而研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素相比其他食品級聲光敏劑能夠取得更好的滅菌效果。

姜黃素是從多年生草本植物姜黃根莖中提取的一種天然多酚類化合物，因其獨特的口感亦被廣泛用作天然食品調(diào)味劑[31]。姜黃素在我國已有1 000多年的使用歷史[32]， 同時在GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[33]中被列為允許添加在食品中的9 種天然色素之一。姜黃素具有多種藥理作用，如抗癌、抗菌、抗炎、抗氧化、止痛和預(yù)防帕金森等，其優(yōu)異的生物化學(xué)特性取決于姜黃素分子結(jié)構(gòu)中存在的3 個反應(yīng)官能團(tuán)[34]，其結(jié)構(gòu)式如圖2所示。

圖 2 姜黃素結(jié)構(gòu)式Fig. 2 Structural formula of curcumin

目前，基于姜黃素的光動力和聲動力技術(shù)已經(jīng)被廣泛報道。姜黃素和乳酸鏈球菌素制備的納米復(fù)合物介導(dǎo)的聲光動力技術(shù)可以有效抑制鮑曼不動桿菌的生物膜形成，并應(yīng)用到傷口感染的治療領(lǐng)域[35]?；诮S素納米膠束介導(dǎo)的聲光動力非熱殺菌技術(shù)可以抑制鮑曼不動桿菌致病能力相關(guān)基因的表達(dá)[36]。Pourhajibagher等[37]制備了姜黃素納米顆粒（Cur-NPhs），并將其介導(dǎo)的聲光動力應(yīng)用到放線菌的抑制中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，放線菌毒力因子的表達(dá)受到顯著抑制。Liu Hanpeng等[38]研究發(fā)現(xiàn)， Cur/Cus復(fù)合物在光照和超聲波的作用下可以產(chǎn)生大量活性氧物質(zhì)，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的殺滅率分別為99.56%和99.48%。

3.2 聲光動力非熱殺菌技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用

聲光動力非熱殺菌技術(shù)對微生物表現(xiàn)出的協(xié)同殺菌效果使其在食品工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用表現(xiàn)出巨大潛力，然而，聲光動力非熱殺菌技術(shù)在食品領(lǐng)域中的研究卻鮮有報道。Bhavya等[8]將姜黃素介導(dǎo)的聲光動力非熱殺菌技術(shù)應(yīng)用到橙汁的冷殺菌中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在最佳條件下，聲光聯(lián)合處理可使金黃色葡萄球菌數(shù)量減少（2.35±0.16）（lg（CFU/mL）），使大腸桿菌數(shù)量減少（4.26±0.32）（lg（CFU/mL）），處理后橙汁中的總酚含量、總黃酮含量和橙皮苷含量均無顯著變化，然而，橙汁抗壞血酸含量減少，抗氧化活性降低，對橙汁品質(zhì)產(chǎn)生了負(fù)面影響。此外，Wang Dehua等[39]報道了聲光動力非熱殺菌技術(shù)在生漿魚糜肉類制品中的應(yīng)用，以姜黃素為聲光敏劑，有效延緩了蝦滑制品的品質(zhì)劣變，并改變了蝦滑冷藏期間的微生物群落結(jié)構(gòu)。

4 結(jié) 語

目前，聲光動力非熱殺菌技術(shù)在食品加工領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大應(yīng)用潛力，然而針對其在食品工業(yè)中的推廣應(yīng)用仍需解決幾點問題：1）聲光動力對食品品質(zhì)的影響 規(guī)律尚待進(jìn)一步明確。聲光動力非熱殺菌技術(shù)體系復(fù)雜，影響因素較多，包括超聲波頻率、超聲波功率、介質(zhì)類型、介質(zhì)溫度波動、光照強(qiáng)度、食品的種類、體積及厚度等。因此，聲光動力技術(shù)的發(fā)展亟需建立簡化、完善、成熟的應(yīng)用設(shè)備，統(tǒng)計不同食品類型的工藝處理條件及品質(zhì)變化規(guī)律，建立聲光動力處理工藝的數(shù)據(jù)庫。2）聲光動力對微生物的滅活機(jī)制仍需進(jìn)一步闡述。聲光動力技術(shù)不是簡單的光動力技術(shù)和聲動力技術(shù)作用機(jī)制的復(fù)合，在超聲波和光源的共同作用下，聲/光敏劑獲取激發(fā)能量的途徑變得多樣化，包括聲的空化效應(yīng)、聲化學(xué)效應(yīng)、光的照射，甚至在某些條件下還包括聲的熱效應(yīng)。此外，超聲波存在聲穿孔效應(yīng)，可能會促進(jìn)聲/光敏劑進(jìn)入微生物細(xì)胞內(nèi)部，從而增強(qiáng)滅菌效果，該觀點有助于完善聲光動力對微生物細(xì)胞膜損傷的研究內(nèi)容。