利用激光在微流控芯片中實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分選的研究

仲小祥，冒衛(wèi)星，張華麗

（南通大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院，江蘇南通 226019）

1 引言

激光光鑷作為一種非接觸式的操縱方式，可實(shí)現(xiàn)對單個細(xì)胞的操縱和定向控制[1?3]。因其對細(xì)胞無損傷且可實(shí)現(xiàn)微尺度下的單細(xì)胞操縱甚至細(xì)胞內(nèi)的生物分子操縱，這項(xiàng)技術(shù)廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥、生物工程、化學(xué)分析等各個領(lǐng)域，同時隨著光鑷在細(xì)胞分析領(lǐng)域的發(fā)展，光鑷技術(shù)逐漸在疾病治療、診斷上發(fā)揮重大作用[4?7]。文獻(xiàn)[8?9]利用熔拉的方法制作了拋物線型光纖，在顯微鏡試驗(yàn)臺下實(shí)現(xiàn)了對酵母菌細(xì)胞的三維操縱，并利用兩根光纖實(shí)現(xiàn)了對細(xì)胞的轉(zhuǎn)移交接，對捕獲物實(shí)現(xiàn)空間狀態(tài)的調(diào)節(jié)，后又利用微結(jié)構(gòu)光纖制作表面等離子體共振傳感器，可極大地縮小表面等離子體共振系統(tǒng)的體積，更易于光學(xué)器件在微芯片中的集成。

文獻(xiàn)[10]使用對端面進(jìn)行微處理過的光纖束構(gòu)建的光纖光鑷實(shí)現(xiàn)了對微顆粒和生物細(xì)胞的穩(wěn)定非接觸捕獲，通過設(shè)計(jì)和開發(fā)微型化光學(xué)微處理器，使芯片操作和單細(xì)胞熒光顯微鏡具有可行性，該系統(tǒng)具有高通用性、低成本、易于制造和組裝等優(yōu)點(diǎn)，可作為分離稀有細(xì)胞或觀察局部環(huán)境變化對診斷或篩查的影響的通用方法。另外，文獻(xiàn)[11]首次使用光鑷控制神經(jīng)元的生長和伸展，同時利用光鑷解剖神經(jīng)元，研究神經(jīng)元對局部損傷的后續(xù)反應(yīng)，并且在高功率下完成了捕獲細(xì)胞的裂解。

文獻(xiàn)[12]利用CFD軟件進(jìn)行Y型芯片的流場分析，驗(yàn)證了Y型溝道的水力聚焦寬度與鞘流液流速/細(xì)胞液流速之間的關(guān)系，優(yōu)化設(shè)計(jì)出了便于利用激光以及其他操縱方式分離細(xì)胞的芯片結(jié)構(gòu)。另外，文獻(xiàn)[13]使用波長為650NM、功率為200mW的紅色半導(dǎo)體激光成功在短時間驅(qū)動酵母細(xì)胞，速度可達(dá)25μm/s。

隨著光鑷技術(shù)的不斷發(fā)展，光流控技術(shù)的研究主要有兩方面：（1）激光光鑷操縱細(xì)胞光纖技術(shù)的研究；（2）微流控芯片的功能化設(shè)計(jì)從而利用鞘流流動實(shí)現(xiàn)更精確的細(xì)胞分選[14]。

將激光操縱的無損傷與微流控芯片的微尺度、微通量特點(diǎn)相結(jié)合，能實(shí)現(xiàn)更精確、定向的細(xì)胞分選。這里結(jié)合微流控芯片鞘的微流場動力學(xué)以及光鑷的原理，利用COMSOL Multiphysics軟件進(jìn)行激光作用分選細(xì)胞的仿真模擬，研究激光功率大小以及細(xì)胞物理特征對捕獲結(jié)果的影響，并采用100mW激光器進(jìn)行分離（8～10）μm聚苯乙烯的對比試驗(yàn)，分析如何實(shí)現(xiàn)精確、高效的細(xì)胞分選。

2 模型與方法

2.1 微流體內(nèi)細(xì)胞受力的數(shù)學(xué)模型

光的電磁理論，證明了光作為電磁波，不但具有能量，而且具有動量。根據(jù)牛頓第二定律，作用在物體上的力就等于光引起的單位時間內(nèi)物體動量的變化，光與物體相互作用的過程中就伴隨有動量的交換。

單位時間里物體動量發(fā)生變化意味著光對被照物體施加一個力的作用[15]。兩束光以不同角度射入微粒小球，產(chǎn)生不同大小的力Fa、Fb，力的大小取決于激光的功率以及入射角度。微粒小球在兩束激光的作用下運(yùn)動推離，如圖1所示。

圖1 激光束推動細(xì)胞的力學(xué)示意圖Fig.1 Mechanical Diagram of Cells Pushed by Laser Beam

在微流體內(nèi)激光操縱細(xì)胞的仿真模型中，微流體中運(yùn)動的細(xì)胞或粒子受到的力有：微流體對細(xì)胞的曳力FD，激光力F，不考慮自身重力G、液體的浮力FB和其他外部力，建立微流體中細(xì)胞的運(yùn)動狀態(tài)仿真模型。

根據(jù)牛頓第二運(yùn)動定律可以得到：

根據(jù)斯托克斯公式，運(yùn)動狀態(tài)下的球形細(xì)胞所受阻力為：

式中：m—被導(dǎo)向細(xì)胞的質(zhì)量；Fd—單位質(zhì)量的被導(dǎo)向細(xì)胞受到的曳力；V—液體的流速；Vm—被導(dǎo)向細(xì)胞在微流體中的運(yùn)動速度。根據(jù)細(xì)胞質(zhì)量與直徑的關(guān)系，可以表示為：

式中：μ—液體的動力粘度系數(shù)；dm—被導(dǎo)向細(xì)胞的直徑；ρm—細(xì)胞的密度。

2.2 微流體內(nèi)激光操縱細(xì)胞的仿真模型

在COMSOL中建立仿真模型，幾何形狀，如圖2所示。左側(cè)通道設(shè)置進(jìn)口1，長度為500μm；上下兩側(cè)的鞘流通道長度為500μm，設(shè)置進(jìn)口2和進(jìn)口3；右側(cè)通道長度為1000μm，設(shè)置出口1。各通道寬度均為100μm。圖中藍(lán)色區(qū)域設(shè)置Y正方向設(shè)置側(cè)向力代替激光力。在層流模塊，流體材料為水，進(jìn)口1、進(jìn)口2、進(jìn)口3的法向流入速度為1e?4m/s，出口1為壓力輸出。

在粒子追蹤模塊，設(shè)定粒子為固體，指定其密度和直徑為10μm，以及粒子的進(jìn)口和速度。由層流狀態(tài)分析可得，形成的聚焦流寬度為22μm。層流流場的整體流線分布，如圖2所示。

圖2 層流流場的整體流線分布Fig.2 Overall Streamline Distribution of Laminar Flow Field

2.3 實(shí)驗(yàn)材料與方法

本實(shí)驗(yàn)以單拋硅片為基片，均勻涂覆SU?8負(fù)膠，通過光刻法制備硅片模版[16]。采用模塑法制備微流控芯片，選用聚二甲基硅氧烷（PDMS）為芯片基材，將液態(tài)PDMS 傾覆于硅片模版上，烘干，得到具有微結(jié)構(gòu)的PDMS基片。實(shí)驗(yàn)主要包括微流控芯片，進(jìn)液模塊，激光作用模塊和觀測模塊。實(shí)驗(yàn)儀器主要為LSP02?1B 注射泵，210?CE 注射泵，Leica DMI 3000B 熒光倒置顯微鏡，聚四氟乙烯導(dǎo)管，IDEX P20X 接頭，1ml 注射器，以及MIL?111?1064?100mV激光器和HCSIR光纖，原理，如圖3（a）所示。

圖3 芯片實(shí)驗(yàn)原理及鞘流寬度調(diào)節(jié)圖Fig.3 Chip Experimental Principle and Scabbard Flow Width Adjustment Diagram

主通道流入濃度為（1×105）個/ml的聚苯乙烯PS 溶液，鞘流流入雙蒸水。調(diào)節(jié)主通道與鞘流通道的流速比，使粒子成列通過。聚焦流的調(diào)節(jié)效果，如圖3（b）、圖3（c）所示。光纖用特殊切刀將端面切平整后嵌入光纖通道，調(diào)整光纖與主通道的距離，開激光器預(yù)熱。在激光器穩(wěn)定后，利用熒光倒置顯微鏡觀察粒子偏轉(zhuǎn)口的情況。

3 結(jié)果與分析

3.1 激光力大小對細(xì)胞運(yùn)動的影響

激光功率的大小決定了激光中每個光子的能量多少，當(dāng)激光傳輸?shù)郊?xì)胞表面時，產(chǎn)生的輻射壓力也不同。

設(shè)定細(xì)胞直徑為10μm，密度為1050kg/m3，以1e?4m/s的速度從進(jìn)口1進(jìn)入流場。激光力設(shè)為5pN、10pN、15pN、20pN、25pN、30pN。從圖4（a）中可以看出，當(dāng)激光力為5pN時，細(xì)胞在激光作用區(qū)域向上偏轉(zhuǎn)，Y方向偏轉(zhuǎn)距離dY為5μm。

層流狀態(tài)下三個進(jìn)口的流體互不干擾，形成的聚焦流寬度為22μm，即細(xì)胞在流體作用下分布為±11μm。當(dāng)激光力作用后，細(xì)胞的分布為（?6～16）μm，即部分細(xì)胞仍在聚焦流中，部分細(xì)胞進(jìn)入上層流體中。激光力為15pN、20 pN時的細(xì)胞運(yùn)動軌跡，如圖4（a）所示。

圖4 仿真結(jié)果分析Fig.4 Analysis of Simulation Results

無激光力作用時，聚焦流即為細(xì)胞在流體作用下的分布區(qū)域。激光力施加后，細(xì)胞發(fā)生偏轉(zhuǎn)。當(dāng)激光力逐漸變大，細(xì)胞偏轉(zhuǎn)越明顯。激光力小于15pN時，細(xì)胞偏轉(zhuǎn)位移較小時，分布在中間的聚焦流的部分細(xì)胞進(jìn)入上層流體。激光力為15pN時，細(xì)胞全部偏轉(zhuǎn)進(jìn)入上層流體，不在聚焦流中。激光力為20pN時，少量上外側(cè)細(xì)胞偏轉(zhuǎn)粘結(jié)通道內(nèi)壁；激光力為35pN時，細(xì)胞全部偏轉(zhuǎn)粘結(jié)在通道內(nèi)壁。分析不同激光力作用下，直徑10μm細(xì)胞的偏轉(zhuǎn)位移。得到的偏轉(zhuǎn)位移與激光力的關(guān)系圖，如圖4（b）所示。從圖中可看出，偏轉(zhuǎn)位移與激光力大小成線性關(guān)系。

3.2 激光作用力對不同直徑細(xì)胞運(yùn)動的影響

設(shè)定作用區(qū)域的激光力為15pN，細(xì)胞大小為5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm。其中直徑5μm、10μm、15μm的細(xì)胞運(yùn)動軌跡，如圖4（c）所示。

當(dāng)激光力為15pN時，不同直徑細(xì)胞的偏轉(zhuǎn)位移結(jié)果，如圖4（d）所示。從圖4（d）可發(fā)現(xiàn)，當(dāng)激光力一定時，細(xì)胞尺寸越大，其偏轉(zhuǎn)位移越小。

3.3 細(xì)胞分選模型與實(shí)驗(yàn)結(jié)果

前面的研究表明了不同激光力、不同細(xì)胞直徑條件下，細(xì)胞運(yùn)動偏轉(zhuǎn)的規(guī)律。本節(jié)改進(jìn)第二節(jié)中的模型，以實(shí)現(xiàn)激光操縱微流體內(nèi)細(xì)胞的分離，如圖5所示。沿激光傳輸方向，設(shè)置出口2接收偏轉(zhuǎn)后的細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)激光作用后進(jìn)入分選通道，根據(jù)目標(biāo)細(xì)胞尺寸的大小可以設(shè)置不同的激光功率達(dá)到分選的目的。

圖5 細(xì)胞分離模型及粒子軌跡Fig.5 Cell Separation Model and Particle Trajectory

利用PDMS制作的微流控芯片，通入聚苯乙烯粒子，在鞘流的作用下成列進(jìn)入主通道。光纖嵌入與主通道垂直并與分選通道處于同一水平線的輔道，在激光器穩(wěn)定輸出時看到的粒子偏轉(zhuǎn)情況，如圖6所示。目標(biāo)粒子在激光作用下偏轉(zhuǎn)入捕獲通道并且成列通過，緩慢的流速保證粒子有足夠的作用時間，少數(shù)粒子由于尺寸大小的不同以及流道本身存在的凹凸導(dǎo)致的速度突變沒有進(jìn)入分選通道。

圖6 光纖作用下的粒子軌跡Fig.6 Particle Trajectory Under the Action of Optical Fiber

在聚焦流側(cè)邊的芯片部位嵌入光纖，利用光纖傳輸激光，使細(xì)胞的運(yùn)動軌跡發(fā)生改變，最終達(dá)到操縱細(xì)胞分選的目的。在模擬條件下，通過控制進(jìn)液速度，激光力大小等條件，細(xì)胞由主通道偏轉(zhuǎn)進(jìn)入了分選通道，如圖5所示直徑10μm的細(xì)胞在35pN激光力作用下，偏轉(zhuǎn)進(jìn)入出口2所在通道。

這里研究建立的基于微流控芯片的激光分選細(xì)胞模型，有三個功能區(qū)域：聚焦區(qū)，檢測區(qū)以及分選區(qū)，如圖7所示。聚焦區(qū)用于形成單細(xì)胞聚焦流，使細(xì)胞依次排列。在激光作用區(qū)域前段設(shè)置檢測區(qū)域，用于檢測細(xì)胞流中細(xì)胞尺寸、熒光狀態(tài)等，經(jīng)圖形采集及相關(guān)算法處理得到細(xì)胞信息，傳輸至計(jì)算機(jī)。分選區(qū)為光纖激光的作用區(qū)域，計(jì)算機(jī)根據(jù)細(xì)胞信息，以及分選條件，控制激光是否開啟。最終，非目標(biāo)細(xì)胞從出口1輸出，目標(biāo)細(xì)胞從出口2輸出。

圖7 基于微流控芯片的激光分選細(xì)胞模型Fig.7 Laser Cell Sorting Model Based on Microfluidic Chip

4 結(jié)論

這里結(jié)合微通道流體流動的理論基礎(chǔ)以及利用激光進(jìn)行細(xì)胞操縱的光學(xué)和力學(xué)原理，使用COMSOL Multiphysics仿真軟件建立鞘流流動以及激光激光作用下捕獲細(xì)胞的仿真模型，分析激光光鑷實(shí)現(xiàn)高效捕獲分離細(xì)胞的機(jī)制，利用100mW功率激光器以及聚苯乙烯微球進(jìn)行分選實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果如下：

（1）隨著激光力的增大，粒子或細(xì)胞的偏移角度也隨之增大，偏移距離跟激光力大小成正比關(guān)系。（2）相同大小的激光力作用下，細(xì)胞直徑越大，其偏轉(zhuǎn)位移越小。（3）在100mW 功率的激光作用下，（8～10）μm的聚苯乙烯微球能夠從主通道偏轉(zhuǎn)進(jìn)入分選通道。

根據(jù)上述結(jié)論，對不同直徑大小的細(xì)胞或粒子進(jìn)行激光操縱，選擇適合的激光功率可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞粒子的捕獲或分離。根據(jù)建立的物理捕獲模型，計(jì)算機(jī)在混合細(xì)胞進(jìn)入檢測區(qū)時得到數(shù)據(jù)計(jì)算出細(xì)胞分選所需的激光功率大小，從而控制分選，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分選的自動化、集成化。