碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌聯(lián)合藥敏試驗(yàn)及報(bào)告專家共識(shí)

丁 麗， 陳佰義， 李 敏， 倪語(yǔ)星， 單 斌， 蘇丹虹， 孫自鏞， 王明貴， 楊啟文，喻 華， 俞云松0， 張利俠， 張 嶸， 朱德妹， 卓 超， 胡付品

1 前言

碳青霉烯類抗菌藥物包括亞胺培南、美羅培南和厄他培南等，是治療多重耐藥革蘭陰性菌所致感染最有效的抗菌藥物之一。隨著該類藥物在臨床的廣泛使用，碳青霉烯類耐藥細(xì)菌（carbapenemresistant organisms， CRO）的檢出率呈逐年上升趨勢(shì)，其中以肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌為代表。CHINET中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)2021年監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，我國(guó)臨床分離肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)亞胺培南的耐藥率分別為23.1%、23%和71.5%[1-2]。由于CRO通常還攜帶對(duì)其他抗菌藥物耐藥的基因，呈廣泛耐藥甚至全耐藥的特征，使臨床的抗感染治療面臨無(wú)藥可用的困境，導(dǎo)致感染患者的高病死率。CRO感染治療面臨的困境急需實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展聯(lián)合藥敏試驗(yàn)[3-11]，多藥聯(lián)合治療可延長(zhǎng)抗菌藥物的使用壽命[12]，體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)證實(shí)兩藥呈協(xié)同或相加作用的聯(lián)合，能有效改善CRO感染患者的病死率。聯(lián)合藥敏試驗(yàn)可通過(guò)兩藥/多藥組合分析不同藥物之間的協(xié)同抗菌活性，在篩選針對(duì)CRO菌株所致感染的精準(zhǔn)抗感染治療方案中發(fā)揮重要作用。為規(guī)范碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌聯(lián)合藥敏試驗(yàn)及報(bào)告，上海市微生物學(xué)會(huì)微生物耐藥防控專委會(huì)、CHINET中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)和上海市細(xì)菌真菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)組織專家對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行了討論，撰寫(xiě)了專家共識(shí)并對(duì)聯(lián)合藥敏試驗(yàn)方法和結(jié)果報(bào)告進(jìn)行了推薦，以期對(duì)各醫(yī)療機(jī)構(gòu)開(kāi)展針對(duì)CRO菌株的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)及報(bào)告提供幫助。

2 CRO的定義及耐藥機(jī)制

碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細(xì)菌（carbapenemresistantEnterobacterales）定義為滿足以下任意一個(gè)條件[13]：①對(duì)亞胺培南、美羅培南、厄他培南或多利培南任何一種碳青霉烯類抗菌藥物耐藥者。對(duì)于天然對(duì)亞胺培南敏感性降低的細(xì)菌（如摩根菌屬、變形桿菌屬和普羅威登菌屬等），需參考除亞胺培南外的其他碳青霉烯類抗菌藥物的藥敏結(jié)果；②產(chǎn)生碳青霉烯酶。碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌（carbapenem-resistantPseudomonas aeruginosa， CRPA）和碳青霉烯類耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌（carbapenem-resistantAcinetobacter baumannii，CRAB）定義為對(duì)亞胺培南、美羅培南或多利培南任何一種碳青霉烯類抗菌藥物耐藥者[14]。產(chǎn)生碳青霉烯酶是腸桿菌目細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥最主要的機(jī)制[15]，包括A類絲氨酸碳青霉烯酶（以KPC酶為主）、B類金屬β內(nèi)酰胺酶（以NDM型金屬酶為主）和D類絲氨酸碳青霉烯酶（以O(shè)XA-48型酶為主）。銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類耐藥的主要機(jī)制包括AmpC酶高表達(dá)合并外膜滲透屏障、外排泵高表達(dá)以及產(chǎn)生碳青霉烯酶（包括KPC型碳青霉烯酶和金屬β內(nèi)酰胺酶）等。鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類耐藥的主要機(jī)制是天然產(chǎn)生OXA-23、OXA-24或OXA-51型酶。

3 開(kāi)展聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的時(shí)機(jī)

僅當(dāng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)菌對(duì)常規(guī)所有測(cè)試的抗菌藥物均耐藥，或臨床醫(yī)師有特殊治療需求時(shí)，開(kāi)展聯(lián)合藥敏試驗(yàn)篩選可能的多藥聯(lián)合治療方案。開(kāi)展聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的時(shí)機(jī)參考圖1。

圖1 聯(lián)合藥敏試驗(yàn)時(shí)機(jī)及結(jié)果報(bào)告流程

4 聯(lián)合藥敏的方法及其局限性

當(dāng)前臨床微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)采用的藥敏試驗(yàn)方法包括肉湯微量稀釋法、肉湯宏量稀釋法、瓊脂稀釋法、E試驗(yàn)法、自動(dòng)化藥敏儀器和紙片擴(kuò)散法。除紙片擴(kuò)散法為定性檢測(cè)方法外，其余均為定量檢測(cè)方法。聯(lián)合藥敏試驗(yàn)方法包括肉湯微量稀釋棋盤(pán)法、瓊脂稀釋棋盤(pán)法、紙條法（包括E試驗(yàn)條和MTS條）、紙片擴(kuò)散法和聯(lián)合殺菌曲線等[16-21]。肉湯微量稀釋棋盤(pán)法和瓊脂稀釋棋盤(pán)法是聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)參考方法，但該方法操作繁瑣且基本為手工操作，導(dǎo)致常規(guī)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展的可操作性差。因此，操作簡(jiǎn)單靈活的紙條法和紙片法不失為常規(guī)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合藥敏可選擇的方法。

專家共識(shí)一：聯(lián)合藥敏試驗(yàn)是臨床微生物室常規(guī)藥敏試驗(yàn)的補(bǔ)充，僅對(duì)多重耐藥菌如碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌或臨床醫(yī)師有特殊治療需求的耐藥菌株進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，其他菌株不建議常規(guī)開(kāi)展聯(lián)合藥敏試驗(yàn)。

專家共識(shí)二：聯(lián)合藥敏試驗(yàn)方法首選肉湯微量稀釋棋盤(pán)法，若實(shí)驗(yàn)室無(wú)法開(kāi)展肉湯微量稀釋棋盤(pán)法，可以紙條法或紙片擴(kuò)散法替代。但需注意的是，紙條法或紙片擴(kuò)散法結(jié)果僅供參考，如需確認(rèn)應(yīng)采用肉湯微量稀釋棋盤(pán)法。

5 聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果判讀

常用部分抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration index， FIC） 為 判 斷 依 據(jù)[18-19]， 即①FIC≤0.5：協(xié)同作用，提示兩種藥物聯(lián)合后的抗菌活性顯著大于各單藥；②FIC＞0.5～1：相加作用，提示兩種藥物聯(lián)合后的抗菌活性較各單藥稍有增加；③FIC＞1～2：無(wú)關(guān)作用，提示兩種抗菌藥物的活性均不受另一種藥物的影響；④FIC＞2：拮抗作用，提示一種抗菌藥物的活性被另一種抗菌藥物削弱。

FIC指數(shù)計(jì)算公式：

專家共識(shí)三：在進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn)前，應(yīng)先進(jìn)行單藥的藥敏試驗(yàn)，優(yōu)先選擇敏感的抗菌藥物進(jìn)行聯(lián)合，或以兩藥MIC值為中心，上下3～4個(gè)濃度進(jìn)行交叉聯(lián)合，開(kāi)展聯(lián)合藥敏試驗(yàn)。

6 聯(lián)合藥敏試驗(yàn)方案推薦

由于不同種類的抗菌藥物對(duì)產(chǎn)生不同碳青霉烯酶菌株的體外抗菌活性不同，不同耐藥菌由于耐藥機(jī)制的差異導(dǎo)致其對(duì)抗菌藥物的敏感性不同。因此，應(yīng)根據(jù)不同的CRO菌株制定不同的抗感染治療方案。如頭孢他啶-阿維巴坦對(duì)于產(chǎn)KPC酶或OXA-48型酶腸桿菌目細(xì)菌具有高度抗菌活性，但對(duì)于產(chǎn)金屬酶菌株需聯(lián)合氨曲南；替加環(huán)素對(duì)碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細(xì)菌和鮑曼不動(dòng)桿菌具有高度抗菌活性，但對(duì)銅綠假單胞菌無(wú)抗菌活性；而多黏菌素（包括多黏菌素B和黏菌素）對(duì)上述三種耐藥菌均具有高度抗菌活性（天然耐藥菌株除外）。除此之外，磷霉素對(duì)腸桿菌目細(xì)菌具有較強(qiáng)抗菌活性，但對(duì)銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌基本無(wú)抗菌活性；阿米卡星對(duì)CRO菌株具有一定抗菌活性，需根據(jù)藥敏試驗(yàn)情況而定；而頭孢哌酮-舒巴坦（尤其是舒巴坦加大劑量）對(duì)于CRAB仍具有一定抗菌活性[22-23]?；诖?，實(shí)驗(yàn)室在開(kāi)展針對(duì)CRO菌株的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)時(shí)，需根據(jù)不同耐藥菌的特征而設(shè)計(jì)針對(duì)性的多藥聯(lián)合藥敏試驗(yàn)方案。

專家共識(shí)四：各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)本院CRO菌株耐藥機(jī)制，制定不同聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的抗菌藥物組合。

專家共識(shí)五：對(duì)于新β內(nèi)酰胺類抗生素-β內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)方制劑，如頭孢他啶-阿維巴坦、美羅培南-韋博巴坦和亞胺培南-瑞來(lái)巴坦等，若藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)該類復(fù)方制劑敏感，可直接用于敏感菌所致感染的治療，無(wú)需開(kāi)展聯(lián)合藥敏試驗(yàn)。

專家共識(shí)六：對(duì)于不同CRO菌株聯(lián)合藥敏試驗(yàn)抗菌藥物的選擇，應(yīng)參考臨床抗感染治療指南或?qū)＜夜沧R(shí)確定，具體參考表1[22-30]。

表1 CRO聯(lián)合藥敏試驗(yàn)抗菌藥物組合推薦

7 聯(lián)合藥敏試驗(yàn)方法學(xué)簡(jiǎn)介、優(yōu)缺點(diǎn)和結(jié)果判讀（表2）

表2 不同聯(lián)合藥敏試驗(yàn)方法學(xué)簡(jiǎn)介、結(jié)果報(bào)告、抗菌作用、優(yōu)缺點(diǎn)、結(jié)果判讀和推薦級(jí)別

7.1 肉湯微量稀釋棋盤(pán)法

肉湯微量稀釋棋盤(pán)法[16-17]用于測(cè)定抗菌藥物抑制或殺滅微生物的最低濃度，通常以mg/L為單位。抗菌藥物A和抗菌藥物B經(jīng)倍比系列稀釋后，以不同濃度組合進(jìn)行混合，經(jīng)過(guò)孵育后閱讀單藥及兩藥聯(lián)合后的MIC。肉湯微量稀釋法使用的96孔微量板在最終接種完成后通常每孔中液體終體積為0.1 mL，細(xì)菌終濃度為5×105CFU/mL。作為參考方法，肉湯微量稀釋棋盤(pán)法可精確測(cè)定細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性，明確兩藥之間是否存在協(xié)同、相加、無(wú)關(guān)和拮抗作用（圖2和圖3）。但該方法比較耗時(shí)，工作量大且對(duì)方法學(xué)技術(shù)要求高，因此一般僅用于科學(xué)研究，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室通常較少開(kāi)展。

圖2 肉湯微量稀釋棋盤(pán)法協(xié)同、相加示意圖

圖3 肉湯微量稀釋棋盤(pán)法無(wú)關(guān)、拮抗示意圖

7.2 瓊脂稀釋棋盤(pán)法

瓊脂稀釋棋盤(pán)法[31]是將兩種抗菌藥物分別配制成單獨(dú)的不同濃度的溶液，之后以不同的兩藥藥物濃度組合加入到每一塊瓊脂平板中，配置成含抗菌藥物濃度成倍比系列稀釋的藥物平板。使用多點(diǎn)接種器將制備好的細(xì)菌菌懸液點(diǎn)種到瓊脂表面，經(jīng)35℃ 16～20 h培養(yǎng)后，肉眼觀察細(xì)菌生長(zhǎng)，以未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)平板的最低藥物濃度為MIC（圖4）。其優(yōu)點(diǎn)是每個(gè)平板可同時(shí)測(cè)定多株細(xì)菌，可直接觀察受試菌生長(zhǎng)是否良好或污染等。但該方法與肉湯微量稀釋棋盤(pán)法一樣比較耗時(shí)，工作量大且對(duì)方法學(xué)技術(shù)要求高，因此一般僅用于科學(xué)研究，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室通常較少開(kāi)展。

圖4 瓊脂稀釋棋盤(pán)法示意圖

7.3 紙條法

紙條法[17，21，32-34]亦稱梯度擴(kuò)散法，所用材料名稱為E試驗(yàn)條（Epsilometer， E-test）和MIC測(cè)試條（MIC test strip， MTS），是一種商品化的定量測(cè)定細(xì)菌對(duì)抗菌藥物敏感性的方法。它結(jié)合了稀釋法和擴(kuò)散法的原理和特點(diǎn)，操作同紙片擴(kuò)散法一樣簡(jiǎn)便易行，結(jié)果又如同稀釋法一樣，可獲得定量的MIC值，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好。紙條法包括兩種：①紙條優(yōu)加法，操作時(shí)在一塊已涂布菌液的MHA平板上貼上含抗菌藥物A和抗菌藥物B的紙條；在另一塊已涂布菌液的MHA平板上先貼上含抗菌藥物A的紙條，30 min后，待抗菌藥物A完全滲透入瓊脂中后移去紙條，再在相同的位置覆蓋貼上抗菌藥物B。過(guò)夜孵育后閱讀抗菌藥物A單藥、抗菌藥物B單藥以及抗菌藥物A和抗菌藥物B堆疊后的MIC（圖5）。②紙條交叉法：抗菌藥物A和抗菌藥物B紙條垂直交叉放置（單藥MIC處交叉，因此需提前測(cè)定單藥MIC），孵育后閱讀聯(lián)合后抗菌藥物A和抗菌藥物B的MIC，計(jì)算FIC指數(shù)，判斷兩藥是否存在協(xié)同、相加、無(wú)關(guān)和拮抗作用（圖6）。紙條法具有操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，且結(jié)果容易閱讀。

圖5 紙條優(yōu)加法聯(lián)合藥敏試驗(yàn)

圖6 紙條交叉法聯(lián)合藥敏試驗(yàn)

專家共識(shí)七：兩藥協(xié)同定義為該菌對(duì)抗菌藥物A和抗菌藥物B單藥均為耐藥，但抗菌藥物B在抗菌藥物A存在時(shí)表現(xiàn)為敏感或中介。

7.4 紙片擴(kuò)散法[16-17]

7.4.1 常規(guī)紙片擴(kuò)散法 將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測(cè)試菌的瓊脂表面上，紙片中的藥物吸收瓊脂中的水分后向紙片周?chē)鷶U(kuò)散，隨著擴(kuò)散距離的增加抗菌藥物的濃度呈對(duì)數(shù)減少，在紙片的周?chē)纬蛇f減濃度梯度。在紙片周?chē)志鷿舛确秶鷥?nèi)的測(cè)試菌不能生長(zhǎng)，而抑菌濃度范圍外的菌株則繼續(xù)生長(zhǎng)，從而在紙片的周?chē)纬梢志?。操作時(shí)將兩張不同抗菌藥物的藥敏紙片以一定的距離放置，參考距離為一張紙片的邊緣距離另外一張紙片的抑菌圈邊緣3～4 mm。經(jīng)過(guò)孵育后根據(jù)兩藥間的抑菌圈擴(kuò)大或縮小等現(xiàn)象，判斷兩藥是否存在協(xié)同、相加、無(wú)關(guān)或拮抗現(xiàn)象（圖7和圖8）。紙片擴(kuò)散法具有操作簡(jiǎn)單且價(jià)格低廉的特點(diǎn)，但缺點(diǎn)是結(jié)果不易閱讀。紙片擴(kuò)散法聯(lián)合藥敏試驗(yàn)兩藥敏紙片的距離可參考圖8。若常規(guī)紙片擴(kuò)散法聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果模糊，難以判斷，建議使用其他方法（如肉湯微量稀釋棋盤(pán)法、紙條法）進(jìn)行確認(rèn)。

圖7 紙片擴(kuò)散法聯(lián)合藥敏試驗(yàn)圖示

圖8 紙片擴(kuò)散法聯(lián)合藥敏試驗(yàn)兩藥敏紙片距離示意圖

優(yōu)先選擇敏感的抗菌藥物A作為關(guān)鍵藥物與其他抗菌藥物進(jìn)行聯(lián)合，如頭孢他啶-阿維巴坦、替加環(huán)素或多黏菌素。

7.4.2 紙片優(yōu)加法 紙片優(yōu)加法[32]為常規(guī)紙片擴(kuò)散法的改良方法。實(shí)驗(yàn)時(shí)按圖示先將2張含抗菌藥物A單藥和1張含抗菌藥物B單藥紙片貼在已接種菌液的MH瓊脂表面，3張紙片間的中心距離為25 mm。放置30 min后，待紙片中的抗菌藥物完全滲透入瓊脂中后，按圖示移去一張A紙片，再在相同的位置上覆蓋貼上抗菌藥物B單藥紙片。經(jīng)孵育后閱讀抑菌圈直徑，見(jiàn)圖9。

圖9 紙片優(yōu)加法聯(lián)合藥敏試驗(yàn)示意圖

專家共識(shí)八：兩藥協(xié)同定義為抗菌藥物A和抗菌藥物B單藥均為耐藥，但抗菌藥物B在抗菌藥物A存在時(shí)表現(xiàn)為敏感或中介（即兩藥聯(lián)合的抑菌圈直徑明顯大于任何單藥抑菌圈直徑）。

7.4.3 改良紙片優(yōu)加法 本方法與紙片優(yōu)加法原理相似，目的為增加有效抗菌藥物的含量，達(dá)到加大劑量實(shí)現(xiàn)抑菌或殺菌的目的，如?？捎么朔ㄔ黾宇^孢哌酮-舒巴坦對(duì)CRAB的抗菌活性。操作方法同常規(guī)紙片擴(kuò)散法，唯一的不同之處為多張同一抗菌藥物紙片緊鄰貼在一起，以實(shí)現(xiàn)該區(qū)域該抗菌藥物濃度加量的目的。由于舒巴坦對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌存在殺菌活性，增加舒巴坦劑量可明顯提高鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)頭孢哌酮-舒巴坦的敏感率[22]，可嘗試以頭孢哌酮-舒巴坦為基礎(chǔ)聯(lián)合舒巴坦的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)方案。見(jiàn)圖10。

圖10 改良紙片優(yōu)加法[適用于鮑曼不動(dòng)桿菌與頭孢哌酮-舒巴坦（2∶1） ]

7.4.4 肉湯紙片洗脫法 肉湯紙片洗脫法[32]為改良肉湯稀釋法，包括兩種方法。

①常規(guī)肉湯紙片洗脫法：此方法為兩種不同抗菌藥物的聯(lián)合。實(shí)驗(yàn)時(shí)在4根無(wú)菌試管中分別加入2 mL的CAMHB肉湯，分別標(biāo)記為C、A、B和A+B管，其中C管為生長(zhǎng)對(duì)照，A管放入1張抗菌藥物A藥敏紙片，B管放入1張抗菌藥物B藥敏紙片，A+B管同時(shí)放入抗菌藥物A和抗菌藥物B藥敏紙片，輕輕渦旋 30 s，室溫（23±2）℃孵育至少30 min使紙片中的抗菌藥物完全擴(kuò)散入肉湯中（不可超過(guò)60 min）（參考CLSI黏菌素肉湯紙片洗脫試驗(yàn)）[35]。然后準(zhǔn)備0.5麥?zhǔn)蠞岫却郎y(cè)菌菌懸液，用移液器分別在在C、A、B和A+B管中加入10 μL的0.5麥?zhǔn)蠞岫却郎y(cè)菌菌懸液，最終接種菌量為7.5×105CFU/mL，35℃孵育16～20 h后觀察各管中的細(xì)菌生長(zhǎng)情況（圖11）。注意：本方法每試管中肉湯的體積需按每片藥敏紙片中所含抗菌藥物的量和該菌對(duì)該抗菌藥物的耐藥判斷標(biāo)準(zhǔn)而定，溶液中抗菌藥物最終濃度應(yīng)≥中介標(biāo)準(zhǔn)。如該菌對(duì)抗菌藥物的耐藥標(biāo)準(zhǔn)為≥16 mg/L，藥敏紙片中所含抗菌藥物的量為30 μg/片，則每管中CAMHB肉湯的含量應(yīng)為2 mL。以紙片中抗菌藥物完全溶解入肉湯中計(jì)算，2 mL肉湯中該抗菌藥物的濃度為15 mg/L（近似于耐藥標(biāo)準(zhǔn)）。

圖11 常規(guī)肉湯紙片洗脫法示意圖

專家共識(shí)九：若C、A和B管中細(xì)菌均生長(zhǎng)，但A+B管無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，報(bào)告抗菌藥物A和抗菌藥物B聯(lián)合“存在協(xié)同作用”。

專家共識(shí)十：若C、A、B和A+B管中的細(xì)菌均生長(zhǎng)，報(bào)告抗菌藥物A和抗菌藥物B“不存在協(xié)同作用”。

舉例：如該菌為產(chǎn)金屬酶肺炎克雷伯菌，抗菌藥物A所含藥物為頭孢他啶-阿維巴坦，抗菌藥物B所含藥物為氨曲南。結(jié)果顯示單藥時(shí)細(xì)菌均生長(zhǎng)，但兩藥聯(lián)合后細(xì)菌生長(zhǎng)被抑制，呈現(xiàn)協(xié)同抑菌或殺菌作用。

②改良肉湯紙片洗脫法：此方法為單種抗菌藥物增加劑量的試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)在4根無(wú)菌試管中分別加入2 mL的CAMHB肉湯，分別標(biāo)記為C、A、A×2和A×3，其中C管為生長(zhǎng)對(duì)照，A管放入1張抗菌藥物A藥敏紙片，A×2管放入2張抗菌藥物A藥敏紙片，A×3管放入3張抗菌藥物A藥敏紙片，輕輕渦旋，室溫孵育至少30 min使紙片中的抗菌藥物完全擴(kuò)散入肉湯中（不可超過(guò)60 min）（參考CLSI黏菌素肉湯紙片洗脫試驗(yàn)）[35]。然后吸取10 μL 的0.5麥?zhǔn)蠞岫却郎y(cè)菌菌懸液分別加入C、A、A×2和A×3管中，最終接種菌量為7.5×105CFU/mL，35℃孵育16～20 h后觀察各管中的細(xì)菌生長(zhǎng)情況（圖12）。注意：本方法每試管中肉湯的體積需按每片藥敏紙片中所含抗菌藥物的量和該菌對(duì)該抗菌藥物的耐藥判斷標(biāo)準(zhǔn)而定，溶液中抗菌藥物最終濃度應(yīng)≥中介標(biāo)準(zhǔn)。如該菌對(duì)抗菌藥物的耐藥標(biāo)準(zhǔn)為≥16 mg/L，藥敏紙片中所含抗菌藥物的量為30 μg/片，則每管中CAMHB肉湯的含量應(yīng)為2 mL。以紙片中抗菌藥物完全溶解入肉湯中計(jì)算，2 mL肉湯中該抗菌藥物的濃度為15 mg/L（近似于耐藥標(biāo)準(zhǔn)）。

圖12 改良肉湯紙片洗脫法示意圖

專家共識(shí)十一：若C和A管細(xì)菌均生長(zhǎng)，但A×2和A×3管細(xì)菌均未生長(zhǎng)，報(bào)告抗菌藥物A增加劑量“存在協(xié)同作用”。

專家共識(shí)十二：若C、A、A×2和A×3管細(xì)菌均生長(zhǎng)，報(bào)告抗菌藥物A增加劑量“無(wú)協(xié)同作用”。

7.5 聯(lián)合殺菌曲線[16-17， 24， 36-37]

通過(guò)檢測(cè)暴露于單藥或聯(lián)合藥物不同時(shí)間段時(shí)的細(xì)菌存活數(shù)，評(píng)估不同藥物間的協(xié)同或拮抗作用（圖13）。協(xié)同通常定義為：與最具抗菌活性的單藥相比，聯(lián)合用藥后細(xì)菌數(shù)呈≥2 log10CFU/mL級(jí)別的下降；拮抗通常定義為：與最具抗菌活性的單藥相比，聯(lián)合用藥后細(xì)菌數(shù)呈≥2 log10CFU/mL級(jí)別的上升。

圖13 兩藥聯(lián)合殺菌曲線示意圖

8 聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告及相關(guān)注釋

不同聯(lián)合藥敏試驗(yàn)方法所得結(jié)果，報(bào)告格式略有差異。

以出現(xiàn)協(xié)同作用為例，當(dāng)采用金標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn)時(shí)，若抗菌藥物A和抗菌藥物B兩藥呈現(xiàn)協(xié)同作用，可報(bào)告：抗菌藥物A和抗菌藥物B聯(lián)合存在協(xié)同作用。當(dāng)采用非金標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn)時(shí)，若抗菌藥物A和抗菌藥物B兩藥呈現(xiàn)協(xié)同作用，可報(bào)告：抗菌藥物A和抗菌藥物B聯(lián)合可能存在協(xié)同作用。

專家共識(shí)十三：采用肉湯微量稀釋棋盤(pán)法及紙條交叉法聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，可根據(jù)FIC指數(shù)判斷兩藥協(xié)同、相加、無(wú)關(guān)和拮抗結(jié)果。若采用其他方法開(kāi)展聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，僅根據(jù)結(jié)果報(bào)告兩藥是否存在協(xié)同作用。見(jiàn)圖14、圖15。

圖14 聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告格式參考圖示（肉湯微量稀釋棋盤(pán)法）

圖15 聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告格式參考圖示（紙片洗脫法）

9 質(zhì)量控制

目前國(guó)際上無(wú)專用的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)質(zhì)量控制要求，建議可按照CLSI文件推薦的稀釋法（MIC測(cè)定）或紙片擴(kuò)散法的質(zhì)控要求[35]，規(guī)范聯(lián)合藥敏試驗(yàn)所涉及的稀釋法和紙片擴(kuò)散法等重要方法學(xué)的操作步驟、材料、試劑和質(zhì)控菌株的要求進(jìn)行質(zhì)控，各實(shí)驗(yàn)室宜根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)室的條件，針對(duì)所選擇的聯(lián)合藥敏方法進(jìn)行質(zhì)量控制或性能驗(yàn)證，僅在所有涉及的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)環(huán)節(jié)均在控的前提下，方可開(kāi)展聯(lián)合藥敏試驗(yàn)。