未足月胎膜早破孕婦胎盤中Toll樣受體4/髓樣分化因子/核因子-κB通路表達(dá)及臨床意義

劉莎莎， 趙 云， 李曉旭， 張 仙， 陳菲菲

未足月胎膜早破（preterm prelabor rupture of membranes，PPROM）是指未滿37周臨產(chǎn)前發(fā)生的胎膜破裂，發(fā)病率較低，僅為3%左右[1]，但臨床危害性極大，對產(chǎn)婦及胎兒的生命健康均造成極大威脅。PPROM不僅使胎膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，還會對產(chǎn)婦的免疫功能造成直接影響[2]。宮內(nèi)感染是PPROM的常見并發(fā)癥，同樣也是PPROM發(fā)病的主要原因[3]，當(dāng)孕產(chǎn)婦受到感染時(shí)，機(jī)體的炎癥反應(yīng)被激活，穩(wěn)態(tài)平衡被打破，病原菌由產(chǎn)道上行引發(fā)宮內(nèi)感染、早產(chǎn)、新生兒感染甚至死亡等嚴(yán)重后果[4]。Toll樣受體4（Tolllike receptor 4，TLR4）是免疫應(yīng)答和病原菌識別的重要受體[5]，可調(diào)控下游分子髓樣分化因子（myeloiddifferentiationfactor88，MyD88） 和 核 因子 -κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）參與介導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)、抗炎、抗病毒感染等過程[6]。隨著對PPROM孕婦宮內(nèi)感染的不斷探索，有研究指出，TLR4、NF-κB等分子在PPROM孕婦宮內(nèi)感染的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，并可一定程度上預(yù)測宮內(nèi)感染的發(fā)生[7-8]。然而，目前尚不清楚，TLR4/MyD88/NF-κB通路在PPROM孕婦胎盤中的表達(dá)水平是否發(fā)生變化，且該通路的表達(dá)是否與宮內(nèi)感染的發(fā)生有關(guān)。基于此，本次研究對PPROM并發(fā)宮內(nèi)感染孕婦胎盤中TLR4/MyD88/NF-κB通路的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，對比其與未感染患者的差異，試圖揭示PPROM并發(fā)宮內(nèi)感染新的分子通路和機(jī)制，為臨床預(yù)防和診斷PPROM并發(fā)宮內(nèi)感染提供更多理論支持。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2017年6月—2020年6月湖北省婦幼保健院收治的PPROM患者90例，按照是否合并宮內(nèi)感染將患者分為感染組（32例）和非感染組（58例），另選同期正常分娩孕婦50名作為對照組。對比各組人群年齡、孕次、產(chǎn)次等一般資料，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 入選各組人員的一般資料Table 1 Clinical data of patients compared in terms of infection

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：所有入組對象均為單胎妊娠；PPROM患者孕周均低于37周；經(jīng)臨床檢查結(jié)合患者癥狀確診為胎膜早破；感染組患者符合宮內(nèi)感染相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；均為22～35歲適齡產(chǎn)婦。

排除標(biāo)準(zhǔn)：前置胎盤產(chǎn)婦；多囊卵巢綜合癥；合并妊娠期高血壓、高血壓史者；合并泌尿系統(tǒng)感染及其他感染性疾病者；35歲以上高齡產(chǎn)婦；對照組孕婦排除胎膜早破和宮內(nèi)感染等臨床癥狀，且未發(fā)現(xiàn)體溫升高情況。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 分娩前，對感染組患者外陰進(jìn)行消毒處理，以陰道窺器暴露宮頸，采用棉簽刮取宮頸管內(nèi)分泌物及黏液，將棉簽置于無菌試管內(nèi)，由檢驗(yàn)科醫(yī)師對病原微生物進(jìn)行培養(yǎng)和鑒定。此外，于PPROM患者分娩后，取距離胎膜破口處最近的胎盤組織，另取對照組產(chǎn)婦正常胎盤組織，均保存于-80℃條件下，以進(jìn)行TLR4/MyD88/NF-κB通路的檢測。

1.3.2 病原菌鑒定分析 將收集到的感染組患者的宮頸分泌物和黏液接種于血平板（廠家：上海滬崢生物科技有限公司；貨號：HZZ105）中，置于含CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱（廠家：南京貝登醫(yī)療股份有限公司；型號：BPN-80CRH）內(nèi)進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，當(dāng)警報(bào)為陽性時(shí)，采用全自動細(xì)菌分析儀（廠家：濟(jì)南童鑫生物科技有限公司；型號：MA120）對感染組標(biāo)本中病原菌進(jìn)行鑒定和分析。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）法檢測TLR4/MyD88/NF-κB通路的mRNA表達(dá)水平 取先前收集到的臨近胎膜破口處的胎盤組織和正常胎盤組織，采用Trizol總RNA提取試劑（廠家：上海邦景實(shí)業(yè)有限公司；貨號：BJS964333；規(guī)格：100 mL）對組織內(nèi)的總RNA進(jìn)行抽提，然后將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，TLR4、MyD88、NF-κB引物序列設(shè)計(jì)見表2，設(shè)置反應(yīng)條件為94℃5 min，94℃30 s，72℃30 s，循環(huán)40次，72℃5 min，使用qRT-PCR儀（廠家：濟(jì)南來寶醫(yī)療器械有限公司；型號：MA-6000）檢測以GAPDH作為標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參時(shí)胎膜中TLR4/MyD88/NF-κB通路的相對mRNA表達(dá)水平。

表2 TLR4/MyD88/NF-κB通路引物設(shè)計(jì)Table 2 Primers used in this study for amplifying TLR4/MyD88/NF-κB pathways

1.3.4 Western bolt法檢測 TLR4/MyD88/NF-κB 通路的蛋白表達(dá)水平 取先前收集到的臨近胎膜破口處的胎盤組織和正常胎盤組織，采用全蛋白試劑盒（廠家：上海博湖生物科技有限公司；貨號：BH-S63616）提取各組織中的總蛋白，采用BCA法測定蛋白水平后將緩沖液加入目標(biāo)蛋白中，凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，以濃度為5%的脫脂奶粉室溫下封閉2 h后，分別滴加TLR4、MyD88、NF-κB p65和 β-actin一抗，稀釋比均為1∶1 000，4℃下孵育一夜，次日滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)羊抗兔二抗，室溫下孵育2 h后以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，以上所有試劑盒均購自上海Abcam公司，均嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求操作，采集圖像后對比各組條帶灰度值。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以表示，多組比較采用方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。受試者工作特征（ROC）曲線評估TLR4/MyD88/NF-κB通路對于PPROM并發(fā)宮內(nèi)感染的診斷效能，計(jì)數(shù)資料率用n（%）表示，單因素分析以χ2檢驗(yàn)，多因素分析采用logistic回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病原菌分析

32例感染患者陰道分泌物中檢出78株病原菌，其中革蘭陽性菌36株，占46.2%，革蘭陰性菌33株，占42.3%，真菌9株，占11.5%，見表3。

表3 感染患者陰道分泌物病原菌種類及株數(shù)Table 3 Species of pathogens isolated from vaginal secretions of patients with intrauterine infection

2.2 胎盤中TLR4/MyD88/NF-κB通路的表達(dá)

與對照組相比，非感染組和感染組患者胎盤 組 織 中 TLR4、MyD88、NF-κB 的 mRNA 和蛋白水平均顯著升高（P＜0.05），且感染組患者TLR4、MyD88、NF-κB的 mRNA 和蛋白水平顯著高于非感染組（P＜0.05），見表4、圖1、圖2。

圖2 各組胎盤中TLR4/MyD88/NF-κB通路的蛋白表達(dá)Figure 2 Protein expression levels of TLR4/MyD88/NF-κB pathways in placenta compared between patients and controls

表4 各組胎盤中TLR4/MyD88/NF-κB通路的表達(dá)Table 4 Expression levels of TLR4/MyD88/NF-κB pathways in placenta compared between patients and controls

圖1 各組胎盤中TLR4/MyD88/NF-κB通路的mRNA表達(dá)Figure 1 The mRNA expression levels of TLR4/MyD88/NF-κB pathways in placenta compared between patients and controls

2.3ROC曲線評估TLR4/MyD88/NF-κB通路對PPROM并發(fā)宮內(nèi)感染的診斷價(jià)值

ROC 曲 線 評 估 TLR4、MyD88和 NF-κB 的mRNA表達(dá)水平對PPROM并發(fā)宮內(nèi)感染的診斷價(jià)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)TLR4表達(dá)高于13.8、MyD88表達(dá)高于24.0、NF-κB表達(dá)高于26.6時(shí)，診斷PPROM并發(fā)宮內(nèi)感染有較高的效能（P＜0.05），見表5、圖3。

圖3 ROC曲線評估TLR4/MyD88/NF-κB通路對PPROM并發(fā)宮內(nèi)感染的診斷價(jià)值Figure 3 ROC curves for evaluating the performance of TLR4/MyD88/NF-κB pathways in diagnosing preterm premature rupture of membranes-associatd intrauterineinfection

表5 ROC曲線評估TLR4/MyD88/NF-κB通路對PPROM并發(fā)宮內(nèi)感染的診斷價(jià)值Table 5 ROC curves illustrating the value of TLR4/MyD88/NF-κB pathways in diagnosing preterm premature rupture of membranes-associated intrauterine infection

2.4 PPROM并發(fā)宮內(nèi)感染單因素分析

收集PPROM患者臨床資料，分析導(dǎo)致PPROM并發(fā)宮內(nèi)感染的危險(xiǎn)因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PPROM并發(fā)宮內(nèi)感染與患者的破膜孕周和陰道檢查次數(shù)有關(guān)（P＜0.05），而與破膜后待產(chǎn)時(shí)間、流產(chǎn)史和引產(chǎn)史無關(guān)（P＞0.05），見表6。

表6 PPROM并發(fā)宮內(nèi)感染單因素分析Table 6 Univariate analysis of the risk factors for preterm premature rupture of membranes-associated intrauterine infection

2.5 PPROM并發(fā)宮內(nèi)感染多因素分析

將上述影響PPROM并發(fā)宮內(nèi)感染的危險(xiǎn)因素納入logistic多因素回歸分析，以是否并發(fā)宮內(nèi)感染（是=1，否=0）作為因變量，TLR4 mRNA水平（＞13.8=1，≤13.8=0）、MyD88 mRNA水平（＞24.0=1，≤24.0=0）、NF-κB mRNA 水 平（＞26.6=1，≤26.6=0）、破膜孕周（≤33周=1，＞33周=0）和陰道檢查次數(shù)（＞5次=1，≤5次=0）作為自變量，分析引起宮內(nèi)感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TLR4/MyD88/NF-κB通路異常高表達(dá)、破膜孕周越小、陰道檢查次數(shù)越多，并發(fā)宮內(nèi)感染的風(fēng)險(xiǎn)越高（P＜0.05），見表7。

表7 PPROM并發(fā)宮內(nèi)感染多因素分析Table 7 Multivariate analysis of risk factors for intrauterine infection associated with preterm premature rupture of membranes

3 討論

目前學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為，PPROM和宮內(nèi)感染具有相互影響、互為因果的關(guān)系，宮內(nèi)感染既是PPROM的病因，又是其重要并發(fā)癥之一[10]。孕婦懷孕期間，通過羊水和胎盤與胎兒進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)交換，若胎兒在母體內(nèi)未發(fā)育成熟，胎膜即出現(xiàn)破裂情況，極易導(dǎo)致病原菌侵入，激活機(jī)體炎癥反應(yīng)[11]，中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞聚集于絨毛膜和羊膜，逆行感染引起子宮腔內(nèi)感染，進(jìn)而導(dǎo)致早產(chǎn)、死胎、新生兒感染、腦損傷等嚴(yán)重后果[12]。因此，如何在早期對PPROM孕婦并發(fā)宮內(nèi)感染進(jìn)行監(jiān)測和診斷對提高母嬰預(yù)后至關(guān)重要?；诖?，本研究檢測PPROM并發(fā)及未并發(fā)宮內(nèi)感染孕婦的胎盤內(nèi)TLR4/MyD88/NF-κB通路的表達(dá)，分析導(dǎo)致宮內(nèi)感染的影響因素，旨在為PPROM并發(fā)宮內(nèi)感染患者的早期預(yù)防、監(jiān)測和治療提供更多方向。

本研究從32例感染患者陰道分泌物中檢出78株病原菌，革蘭陽性菌占46.2%，以金黃色葡萄球菌為主；革蘭陰性菌占42.3%，以大腸埃希菌為主；真菌11.5%，均為白念珠菌。過往研究指出，細(xì)菌、病毒、衣原體、支原體等病原微生物均可通過血源性等方式入侵宮腔，引發(fā)絨毛膜羊膜炎[13]。當(dāng)孕婦出現(xiàn)PPROM時(shí)，陰道流液和漿性分泌物增多，陰道pH值由弱酸性變?yōu)閴A性[14]，而金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌等病原菌最適宜在37℃、堿性環(huán)境下繁殖，胎膜破裂導(dǎo)致的陰道環(huán)境改變加速了病原菌增生，使其更易上行感染至宮腔[15]。因此，在對PPROM并發(fā)宮內(nèi)感染患者進(jìn)行治療時(shí)，應(yīng)選擇對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌抗菌活性更強(qiáng)的抗生素，防止產(chǎn)褥期感染、新生兒感染等疾病的發(fā)生發(fā)展。

PPROM并發(fā)宮內(nèi)感染的致病因素較為復(fù)雜，宮腔內(nèi)壓力過大、羊膜囊受力不均、孕期缺乏必需的微量元素均會導(dǎo)致感染風(fēng)險(xiǎn)加劇[16]。相關(guān)資料顯示，妊娠期高血壓、高血糖、胎盤前置等因素均是引發(fā)宮內(nèi)感染的危險(xiǎn)因素[17]。本研究在排除基礎(chǔ)疾病和前置胎盤等因素的干擾后，發(fā)現(xiàn)PPROM并發(fā)宮內(nèi)感染與患者的破膜孕周和陰道檢查次數(shù)有關(guān)（P＜0.05），而與破膜后待產(chǎn)時(shí)間、流產(chǎn)史和引產(chǎn)史無關(guān)（P＞0.05），這也與曹怡等[18]的研究結(jié)果較為一致。推測原因可能為，破膜孕周越小，胎兒發(fā)育尚不成熟，此時(shí)分娩可能會影響胎兒的存活率，且極易對胎兒心、腦、肝臟、肺部等功能造成永久不可逆損傷[19]，因此臨床多采用醫(yī)學(xué)手段延長胎兒在母體中的發(fā)育時(shí)間，并通過多次陰道檢查確定胎兒發(fā)育狀況，而長時(shí)間的胎膜破裂和多次陰道檢查等人工干預(yù)手段顯著增加了病原菌逆行感染的風(fēng)險(xiǎn)[20]。

最近的研究證實(shí)TLR4在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、絨毛膜和羊膜細(xì)胞中廣泛表達(dá)，參與影響機(jī)體抗病毒感染和免疫反應(yīng)的過程[21]。MyD88是一種胞質(zhì)可溶性蛋白，可受TLR4調(diào)控，參與上下游信息傳遞過程[22]，影響疾病進(jìn)展。NF-κB是細(xì)胞內(nèi)調(diào)控先天性免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在多種惡性腫瘤、急慢性炎癥性疾病和神經(jīng)退行性疾病中異常高表達(dá)[23]。TLR4/MyD88/NF-κB信號通路作為機(jī)體識別病原體、發(fā)揮防御功能的重要通路之一，與過敏性疾病、自身免疫性疾病和感染性疾病的發(fā)病有關(guān)[24]。本研究結(jié)果顯示，TLR4/MyD88/NF-κB通路在PPROM并發(fā)宮內(nèi)感染孕婦胎盤組織中高表達(dá)，且當(dāng)TLR4 mRNA表達(dá)高于13.8、MyD88 mRNA表達(dá)高于24.0、NF-κB mRNA表達(dá)高于26.6時(shí)，診斷PPROM并發(fā)宮內(nèi)感染有較高的效能（P＜0.05）。TLR4可與大腸埃希菌等革蘭陰性菌結(jié)合產(chǎn)生脂多糖，并識別白念珠菌等真菌細(xì)胞壁內(nèi)的甘露聚糖等蛋白質(zhì)復(fù)合物，激活MyD88信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[25]，細(xì)胞因子水平增加，進(jìn)而上調(diào)NF-κB的表達(dá)，促進(jìn)炎性介質(zhì)等細(xì)胞因子的合成、分泌和釋放，激活巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，影響機(jī)體天然免疫反應(yīng)和對病原菌的易感性。因此，TLR4/MyD88/NF-κB通路的表達(dá)水平可作為反映機(jī)體免疫反應(yīng)和抗病毒反應(yīng)的有效標(biāo)志物。

綜上所述，TLR4/MyD88/NF-κB信號通路在PPROM并發(fā)宮內(nèi)感染的孕婦胎盤組織中的表達(dá)顯著升高，破膜孕周低于33周、陰道檢查次數(shù)多于5次及TLR4/MyD88/NF-κB通路異?；罨cPPROM并發(fā)宮內(nèi)感染的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)，可作為臨床篩查和診斷PROM并發(fā)宮內(nèi)感染新指標(biāo)。