巨菌草根際高效解磷菌的篩選

周童暉, 卜建超, 張皓珊, 蘇德偉, 林 輝, 羅海凌, 林冬梅, 林占熺

(1.福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心；2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

巨菌草(CenchrusfungigraminusZ. X. Lin & D. M. Lin & S. R. Lan sp. nov.)，隸屬于蒺藜草屬(CenchrusL.)[1]，因其生長速度快、分蘗能力強、根系發(fā)達、產(chǎn)量高、適應(yīng)性強可在不同環(huán)境條件下種植，具有較高的經(jīng)濟價值[2-3].

磷是巨菌草生長發(fā)育過程中不可或缺的重要礦質(zhì)元素，我國土壤總磷含量豐富，但固態(tài)磷含量高達95%，植物可以直接利用的可溶性磷含量低于5%[4].土壤中的磷素主要分為有機磷和無機磷，有機磷含量約占總磷的20%～50%[5].土壤中的有機磷主要來源于動物糞便、動植物殘體以及人類活動產(chǎn)出物[6].磷化肥的施用在一定程度上緩解了“磷貧瘠”現(xiàn)象，但同時會出現(xiàn)許多生態(tài)破壞問題，近年來國家農(nóng)藥化肥兩減政策出臺，如何釋放出土壤中的固態(tài)磷成為了研究熱點.研究表明，解磷菌可以釋放被土壤固定的磷元素，提高土壤中磷素的利用率，從而減少磷肥的使用量[7].以微生物菌肥部分或全部代替化學(xué)肥料對環(huán)境更友好，對于實現(xiàn)生態(tài)可持續(xù)發(fā)展具有重要價值[8-10].解磷微生物主要分為兩類，分別溶解固態(tài)無機磷和固態(tài)有機磷.兩類解磷微生物在土壤中廣泛分布，能減少磷肥被土壤固定，提高施入磷肥的利用率，溶解土壤中的不溶性磷，并通過產(chǎn)胞外酶和有機酸來刺激植物生長[11-12].

目前已從各類生態(tài)環(huán)境中分離培養(yǎng)出多種解磷微生物.如：高威等[13]篩選出一株唐菖蒲伯克霍爾德氏菌，將該菌株制作成菌肥對辣椒幼苗有明顯的促生長作用；孫健等[14]將紫變異鏈霉菌制成液體菌劑可顯著提高油菜株高和鮮質(zhì)量，且低肥力土壤的促生長效果優(yōu)于高肥力土壤；王君等[15]從黃河三角洲地區(qū)鹽堿化耕地的農(nóng)作物根際土壤中分離篩選出杓蘭泛菌株B19，將其接種在鹽堿化土壤中可使有效磷含量提高36.2%，并且可顯著提高小麥株高、根長、株鮮質(zhì)量和根鮮質(zhì)量.

本試驗立足于篩選具備優(yōu)良解磷能力的菌株，對其固氮能力、生長素的產(chǎn)生等多種促生性能展開研究，并用小麥盆栽試驗驗證其促生性能，旨在豐富微生物菌肥種質(zhì)資源庫，為該菌株的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 土壤取樣

樣品采集地信息如表1所示，在6個地區(qū)的菌草試驗基地采用5點取樣法采集成熟期巨菌草根際土壤.將采集的土壤樣品放入滅菌玻璃瓶中于4 ℃保存，并迅速帶回實驗室處理.

表1 樣品采集地點信息Table 1 Sampling site information

1.2 培養(yǎng)基配制

1.2.1 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 含3 g牛肉膏、10 g蛋白胨、18 g瓊脂、5 g NaCl，加蒸餾水至1 L.

1.2.2 有機磷固體培養(yǎng)基 含1 L牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，滅菌后加入蛋黃液(含30 mL 0.9%生理鹽水、30 mL蛋黃)[16].

1.2.3 有機磷液體培養(yǎng)基 含10 g葡萄糖、0.5 g (NH4)2SO4、0.3 g NaCl、0.3 g MgSO4、0.03 g FeSO4、0.03 g MnSO4、5.0 g CaCO3、0.3 g KCl、2 g卵磷脂、0.5 g酵母膏，加蒸餾水至1 L，pH為7.2～7.4.

1.2.4 LB液體培養(yǎng)基 含5 g酵母浸粉、10 g胰蛋白胨、10 g NaCl，加蒸餾水至1 L[17].

1.3 解磷菌的分離和篩選

1.3.1 分離 在滅菌的三角瓶中加入10 g新鮮土樣、100 mL無菌水，于37 ℃、180 r·min-1振蕩40 min，靜置10 min.以無菌水為溶質(zhì)設(shè)置10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀釋土壤原液.將梯度稀釋液分別涂布在有機磷固體平板培養(yǎng)基上，分離細菌的平板倒扣在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d.將能產(chǎn)生溶磷圈的菌株挑出，反復(fù)劃線，直到得到純菌株.

1.3.2 篩選 將代表菌株接種在有機磷固體培養(yǎng)基上，每個菌株重復(fù)接種到3個相同的培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落周圍有無透明溶磷圈.采用十字交叉法測量溶磷圈直徑(D)和菌落直徑(d)，計算菌株解磷能力.溶磷指數(shù)(α)=D/d[18].α越大表示菌株解磷能力越強，當α為1時則表示菌株無解磷能力[19].

采用鉬銻抗比色法[20]測定離心后上清液中的可溶性磷含量，設(shè)置3次平行試驗.

選取溶磷指數(shù)和產(chǎn)磷量均表現(xiàn)最佳的解磷菌PJS-18進行進一步研究.

1.4 解磷菌磷酸酶活性的測定

堿性、酸性磷酸酶活性分別采用堿性、酸性磷酸酶活性測定試劑盒(蘇州格銳思生物科技有限公司)測定，設(shè)置3次平行試驗.

1.5 PJS-18菌株的鑒定

1.5.1 菌落形態(tài)特征 參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[21]的方法鑒定.

1.5.2 革蘭氏染色 采用革蘭氏染色液試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)鑒定.

1.5.3 生理生化特征 采用細菌生化鑒定管(青島海博生物技術(shù)有限公司)進行甲基紅、乙酰甲基甲醇(V-P)、硝酸鹽還原、淀粉水解、明膠液化、產(chǎn)氨、硫化氫、脲酶等試驗，均設(shè)置3次平行試驗.

1.5.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 采用快速無毒DNA提取試劑盒提取菌株DNA，以細菌通用引物27F和1492R對代表菌株進行PCR擴增.PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參見2×TaqPlus Master MixII試劑說明書(南京諾唯贊生物科技股份有限公司).將產(chǎn)物送至上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行序列鑒定，所得測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中通過Blast搜索同源序列，采用Mega X軟件進行序列同源性比對分析，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.6 PJS-18菌株促生特性的測定

1.6.1 PJS-18菌株產(chǎn)IAA、ACC脫氨酶、固氮酶的能力 細菌固氮酶活性和生長素IAA濃度均采用ELISA試劑盒(上海羽朵生物科技有限公司)測定；ACC脫氨酶活性采用Penrose et al[22]的方法測定.以上測定均設(shè)置3次平行試驗.

1.6.2 盆栽驗證試驗 將PJS-18菌株接種至LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)12 h，待菌液在600 nm波長下的光密度(D)為1時將菌液離心，收集菌體，用無菌蒸餾水稀釋.設(shè)置10倍稀釋液為高濃度菌液，20倍稀釋液為低濃度菌液，以無菌水為對照.

小麥盆栽試驗設(shè)計如表2所示.選取長勢均一、高為(2±0.3) cm的小麥苗種植于營養(yǎng)缽中，澆透水后置于人工氣候室(溫度25 ℃、光照∶黑暗=12 h∶12 h)培養(yǎng)，每天觀察并記錄麥苗生長情況.緩苗3 d后，第1次澆灌處理液；待麥苗生長1周后，第2次澆灌處理液；待麥苗生長15 d時測量麥苗的葉長、主根長、株高、地上部干質(zhì)量和鮮質(zhì)量、地下部干質(zhì)量和鮮質(zhì)量，用根系掃描儀檢測根系長度、根表面積、根直徑.

表2 盆栽試驗設(shè)計Table 2 Pot experiment design

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，采用Microsoft Excel 2016軟件處理，采用SPSS 23軟件中的單因素方差分析法進行多重比較.

2 結(jié)果與分析

2.1 解磷菌的分離和篩選

因解磷菌存在根際效應(yīng)[23]，故從6個樣品采集地分離純化出73株解磷菌，采用透明溶磷圈法初步篩選出8株代表菌株(表3).表3顯示，8株代表菌株的溶磷指數(shù)為1.46～2.19，均大于1.其中，N-7菌株的溶磷指數(shù)為1.46，解磷能力最弱；PJS-18菌株的溶磷指數(shù)為2.19，解磷能力最強.只憑借溶磷指數(shù)斷定菌株解磷能力太過片面，需要結(jié)合液體培養(yǎng)基中的可溶性磷含量綜合判定[24].表3還顯示，8株代表菌株產(chǎn)生的可溶性磷含量為34.72～82.87 mg·L-1.其中，PJS-18菌株產(chǎn)磷量最高，產(chǎn)生的可溶性磷含量達82.87 mg·L-1；HN-12菌株產(chǎn)磷量最低，產(chǎn)生的可溶性磷含量為34.72 mg·L-1.PJS-18菌株在溶磷指數(shù)和產(chǎn)磷量兩項篩選指標中均表現(xiàn)最佳，故選取綜合能力排名第一的PJS-18菌株進行進一步研究.

表3 8株代表菌株的溶磷指數(shù)和產(chǎn)磷量 Table 3 Phosphate solubilization index and soluble phosphorous yield of 8 representative strains

2.2 解磷菌磷酸酶活性

由圖1可知，8株代表菌株的堿性磷酸酶活性為25.77～87.17 μmol·min-1·L-1，酸性磷酸酶活性為6.24～23.94 μmol·min-1·L-1.堿性磷酸酶在活性上占絕對優(yōu)勢，判斷菌株以分泌堿性磷酸酶為主，推斷堿性磷酸酶在菌株解磷功能上發(fā)揮著重要作用.

圖1 8株代表菌株的堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性Fig.1 Alkaline phosphatase and acid phosphatase activities of 8 representative strains

2.3 PJS-18菌株鑒定結(jié)果

2.3.1 菌落形態(tài)特征 PJS-18菌株在LB固體培養(yǎng)基上呈現(xiàn)不規(guī)則、邊緣不整齊、淡黃不透明、干燥扁平、皺皮的菌落形態(tài)特征(圖2).

2.3.2 革蘭氏染色結(jié)果 革蘭氏染色后鏡檢顯示，PJS-18菌株呈陽性反應(yīng)，染色均勻呈紫色，桿狀不成鏈(圖3).

圖2 PJS-18菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of strain PJS-18

2.3.3 生理生化特征 PJS-18菌株在乙酰甲基甲醇、硝酸鹽還原、淀粉水解、脲酶、產(chǎn)氨、明膠液化試驗中呈陽性反應(yīng)，在甲基紅、硫化氫試驗中呈陰性反應(yīng).

2.3.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 PJS-18菌株經(jīng)16S rDNA擴增得到1 600 bp左右的條帶，擴增產(chǎn)物經(jīng)測序后所獲得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫采用Mega X軟件進行序列同源性比對分析，利用鄰連法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.結(jié)果(圖4)顯示，PJS-18菌株與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)位于同一系統(tǒng)發(fā)育分支上.綜合PJS-18菌株的生理生化特征、形態(tài)特征和16S rDNA序列結(jié)果，初步確定PJS-18菌株為枯草芽孢桿菌.

圖4 PJS-18菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain PJS-18

2.4 PJS-18菌株的促生特性

2.4.1 PJS-18菌株產(chǎn)IAA、ACC脫氨酶、固氮酶的能力 PJS-18菌株產(chǎn)生的IAA濃度為8.65 nmol·L-1，ACC脫氨酶活性為27.43 μmol·min-1·mg-1，固氮酶活性為180.3 U·L-1.表明PJS-18菌株可產(chǎn)生一定量的IAA、ACC脫氨酶及大量的固氮酶.固氮酶可以在自然環(huán)境下固氮成氨，是固氮微生物的主要催化劑，它能將氮從生物體無法直接利用的分子氮轉(zhuǎn)化為可直接利用的氨態(tài)氮[25].

2.4.2 盆栽驗證結(jié)果 表4～5顯示：有機肥+低濃度菌液組小麥的葉長、株高、主根長較有機肥對照組分別提高了11.26%、12.01%、14.93%；小麥地上部干質(zhì)量、鮮質(zhì)量，地下部干質(zhì)量、鮮質(zhì)量較有機肥對照組分別提高了12.07%、38.46%、21.70%、30.90%；小麥的根系長度、根表面積、根直徑、根體積較有機肥對照組分別提高了53.30%、56.79%、3.13%、60.00%.各組小麥生長情況的優(yōu)劣表現(xiàn)為：有機肥+低濃度菌液組>有機肥對照組>有機肥+高濃度菌液組>空白對照組.

表4 不同處理小麥的促生效果1)Table 4 Growth-promoting effect of different treatments on wheat

表5 不同處理小麥根系的生長情況1)Table 5 Root growth of hydroponic wheat under different treatments

可見，在施用的有機肥中添加低濃度PJS-18菌液可顯著促進小麥生長，但在施用的有機肥中添加高濃度菌液則會抑制植株對有機肥的吸收.

3 討論與結(jié)論

目前為止已有許多學(xué)者對解磷微生物有較多研究，如從達烏里胡枝子[26]、磷高效轉(zhuǎn)基因水稻[27]等植物根系和根際土壤獲得解磷菌株，菌株包含芽孢桿菌屬Bacillius、根瘤菌屬Rhizobium、青霉屬Penicillium等[28].本研究從巨菌草根際土壤中篩選出一株優(yōu)質(zhì)解磷菌PJS-18，初步鑒定為枯草芽孢桿菌；該菌株在有機磷固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d時的溶磷指數(shù)為2.19，在有機磷液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d時產(chǎn)生的可溶性磷含量達82.87 mg·L-1；該菌株堿性磷酸酶活性為87.17 μmol·min-1·L-1，酸性磷酸酶活性為11.94 μmol·min-1·L-1；該菌株產(chǎn)生的IAA濃度為8.65 nmol·L-1，固氮酶活性為180.3 U·L-1，ACC脫氨酶活性為27.43 μmol·min-1·mg-1.

已有眾多學(xué)者對微生物菌劑的促生作用展開了研究.如：林志偉等[29]研究表明，解磷菌DQ-N發(fā)酵液可以有效促進大豆根的抗逆能力；劉賽男等[30]研究表明，生物炭與解磷菌配合施用對磷脅迫下水稻苗生長具有顯著的促生效應(yīng)；劉廣超等[31]從煙草根際土壤分離得到高效解磷菌——皮特不動桿菌(Acinetobacterpittii)3P29，并對其進行促生試驗發(fā)現(xiàn)其可顯著促進煙草根系生長.本研究結(jié)果顯示，與空白對照組相比，PJS-18低濃度菌液與有機肥配施可顯著提高小麥苗的株高、根長等各項生長指標.

已有研究表明，磷是參與植物葉綠體光合作用的重要元素，與產(chǎn)量呈顯著相關(guān)性[32]，且一定量的磷可以促進植物根系生長[33].本研究中，PJS-18菌株可將土壤中的難溶性有機磷轉(zhuǎn)化為植物可以直接利用的可溶性磷；試驗設(shè)計中采用與巨菌草同科不同屬的小麥作為對象進行盆栽驗證試驗，發(fā)現(xiàn)施用低濃度PJS-18菌液可促進小麥根系生長同時提高產(chǎn)量，表明PJS-18菌液可成為巨菌草、小麥等禾本科作物增產(chǎn)的優(yōu)良菌肥.PJS-18菌株具有分泌固氮酶、磷酸酶、ACC脫氨酶等多種有利于植物生長發(fā)育的促生物質(zhì)，對提高植物抗旱、抗寒、耐重金屬、耐鹽等抗逆性有一定的促進作用.但本研究中的小麥盆栽驗證試驗局限于實驗室條件，微生物真正應(yīng)用于自然環(huán)境中往往受諸多因素交互影響，如鹽堿脅迫、干旱脅迫、重金屬離子脅迫等，故脫離了實驗室理想試驗條件對于該菌株的擴大化應(yīng)用存在挑戰(zhàn)，因此探究交錯環(huán)境因子對解磷能力的影響與實際適用條件，對于PJS-18菌株的應(yīng)用具有重大意義.

由于表型和系統(tǒng)發(fā)育特征相似的枯草芽孢桿菌組、解淀粉芽孢桿菌組與地衣芽孢桿菌所屬菌種的親緣關(guān)系相近，被統(tǒng)稱為“枯草芽孢桿菌復(fù)合群”(包括貝萊斯芽孢桿菌)[34-35]，僅通過16S rDNA分子鑒定難以有效區(qū)分.由于解淀粉芽孢桿菌的乙酰甲基甲醇試驗和硝酸鹽還原試驗呈陰性，枯草芽孢桿菌的乙酰甲基甲醇試驗和硝酸鹽還原試驗呈陽性[36]，故排除PJS-18菌株是解淀粉芽孢桿菌的可能性.由于貝萊斯芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌的生理生化特征較為相似難以區(qū)分，本研究對PJS-18菌株進行16S rDNA分子鑒定，發(fā)現(xiàn)該菌株在16S rDNA水平上與Bacillussubtilisstrain NR_027552.1的同源一致性達到99.86%，結(jié)合表型和生理生化特征初步鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis).RpoB、gyrA和cheA作為看家基因具有高度保守性，能顯示出更高的遺傳差異，在芽孢桿菌的鑒定上具有更強的分辨力[35].因此可通過這3個保守基因?qū)JS-18菌株進行進一步鑒定以確定其更為準確的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位.