飼料添加三丁酸甘油酯對黃顙魚幼魚生長性能、血清生化指標、免疫功能和抗氧化能力的影響

侯冬強 李培佳* 趙紅霞 陳曉瑛 鄭春田 曹俊明

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣州 510640；2.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江 524088)

有機酸或有機酸鹽作為飼料添加劑，能夠促進動物的生長性能、增強免疫功能和改善消化性能[1-2]。甲酸、乙酸、丁酸等有機酸化劑常溫下容易蒸發(fā)產(chǎn)生異味，從而影響動物攝食。三丁酸甘油酯(tributyrin，TB)是一種非揮發(fā)性的自然穩(wěn)定物質(zhì)，由甘油及附著在甘油主鏈上的3個丁酸分子組成，其分子式為C15H26O6[3]。三丁酸甘油酯能夠在腸道中的脂肪酶作用下水解生成甘油和丁酸，甘油和丁酸可進入細胞參與營養(yǎng)代謝并為小腸上皮細胞提供能量[4-5]。研究表明，飼料中添加0.1%三丁酸甘油酯可提高黃姑魚(Nibeaalbiflora)生長性能[6]；鯉魚(Cyprinuscarpio)飼料中添加2.0～4.0 g/kg三丁酸甘油酯顯著改變腸道形態(tài)、微生物群分布的能力，從而提高鯉魚的生長性能[7]；添加443.5 mg/kg三丁酸甘油酯可改善草魚(Ctenopharyngodonidella)腸道健康，從而提高草魚的生長性能[8]；飼料中添加0.06%三丁酸甘油酯可顯著增加團頭魴(Megalobramaamblycephala)免疫、抗氧化能力、增重率和飼料利用率，顯著提高團頭魴的生長性能[5]。以上研究結(jié)果證明，飼料添加三丁酸甘油酯能夠顯著促進水產(chǎn)動物的生長性能、免疫功能和腸道健康。

黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)，鯰形目、鲿科、黃顙魚屬，是我國重要的經(jīng)濟雜食性淡水魚，肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)價值高。隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)?；讲粩嗵岣?，黃顙魚的健康狀況和病害防治也逐漸引起人們的重視。本實驗室前期研究表明，飼料中添加丁酸鈉能夠顯著提高黃顙魚生長性能、營養(yǎng)物質(zhì)的沉積和抗氨氮應(yīng)激能力[9-10]。然而，目前在黃顙魚中尚未見到三丁酸甘油酯的相關(guān)報道。因此，本試驗通過在飼料中分別添加不同水平的三丁酸甘油酯，研究其對黃顙魚生長性能、血清生化指標、免疫功能及抗氧化能力的影響，評估三丁酸甘油酯在實用飼料中的適宜添加水平，旨在為三丁酸甘油酯在黃顙魚的配合飼料中應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。在基礎(chǔ)飼料中分別補充0、500、1 000、2 000 mg/kg的三丁酸甘油酯(純度>90%)配制成4種等氮(42%)等脂(9%)試驗飼料，分別記作G0、G1、G2、G3。按配方準確稱取飼料原料，并將飼料原料經(jīng)粉碎通過60目篩并逐級混勻，然后加入魚油、豆油，加水攪拌均勻，使用雙螺桿擠壓機(SLX-80型，華南理工大學(xué)科技實業(yè)總廠生產(chǎn))將原料擠壓成條，擠壓機工作運轉(zhuǎn)部位軸承溫度保持45～50 ℃，亦可通過注入機器流水，擠壓機工作時度則可控制在45 ℃以下。通過制粒機(G-500，華南理工大學(xué)科技實業(yè)總廠生產(chǎn))破碎條狀飼料，制成1.5 mm的顆粒飼料，在55 ℃下烘干，自然冷卻后放入密封袋中，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

1.2 試驗設(shè)計及飼養(yǎng)管理

黃顙魚苗購自廣州市某水產(chǎn)養(yǎng)殖場，在室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，用基礎(chǔ)飼料馴化2周。選取480尾黃顙魚幼魚[(5.53±0.02) g]，分別置于12個350 L的玻璃纖維圓柱形水箱中開展正式試驗，每箱放魚40尾。將4種試驗飼料隨機分配到4個組，每組3個重復(fù)。試驗期間，每天分別于08:30和18:30投喂飼料，采取表觀飽食投喂。養(yǎng)殖試驗條件：水溫27～32 ℃，pH 7.5～7.9，溶氧含量>6.0 mg/L，亞硝酸鹽含量<0.01 mg/L，氨氮含量<0.20 mg/L，自然光照。試驗期為56 d，每天觀察黃顙魚的攝食情況、健康狀態(tài)，并記錄。

1.3 采集樣品

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，禁食24 h，分別對各水箱的魚進行稱重和計數(shù)。取樣前先用MS-222溶液(120 mg/L)麻醉處理。每箱隨機取6尾魚進行解剖，測量其體重、體長、肝臟重和內(nèi)臟重。每箱取6尾麻醉魚尾靜脈采血，在4 ℃下以4 000 r/min離心15 min，收集血清保存于-80 ℃冰箱。

1.4 指標測定

1.4.1 生長性能和形態(tài)指標計算

式中：G0表示魚體初始體質(zhì)量(g)；Gt表示魚體終末體質(zhì)量(g)；N0表示初始魚尾數(shù)；Nt表示終末魚尾數(shù)；t表示試驗天數(shù)(d)；Gf表示飼料攝入量(g)；Lt表示試驗魚終末體長(cm)；Gg表示肝臟重(g)；Gn表示內(nèi)臟重(g)；Gq表示全魚重(g)。

1.4.2 營養(yǎng)成分測定

采用AOAC(2019)[11]方法測定飼料的水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量。在105 ℃下將樣品干燥至恒重后測定水分含量；采用凱氏定氮法測定粗蛋白質(zhì)含量；采用索氏抽提法測定粗脂肪含量；在600 ℃的馬弗爐中燃燒6 h后檢測粗灰分含量。

1.4.3 血清生化指標測定

血清總蛋白、白蛋白、球蛋白、甘油三酯、尿素氮、葡萄糖含量及谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性采用全自動化學(xué)分析儀(日立7600-110，日本)測定。

1.4.4 血清免疫和抗氧化指標測定

采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定血清溶菌酶(LZM)、堿性磷酸酶(AKP)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性，總抗氧化能力(T-AOC)及谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MAD)含量。根據(jù)說明書(R&D Systems,Minneapolis，美國)，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定血清補體3 (C3)、免疫球蛋白M(IgM)含量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，采用one-way ANOVA程序進行單因素方差分析，采用Duncan氏法進行組間的多重比較。P<0.05表示差異顯著。試驗數(shù)據(jù)使用平均值±標準誤(n=3)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長性能和形體指標

由表2可知，G2組增重率和飼料效率顯著高于其他各組(P<0.05)。G1組肥滿度顯著低于G0和G3組(P<0.05)。各組間的攝食量、肝體比和臟體比無顯著差異(P>0.05)。

表2 飼料中三丁酸甘油酯水平對黃顙魚生長性能和形態(tài)指標的影響Table 2 Effects of dietary tributyrin levels on growth performance and physical indexes of yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco)

2.2 血清生化指標

由表3可知，G3組血清葡萄糖含量顯著高于G1和G2組(P<0.05)。各組間的血清總蛋白、白蛋白、球蛋白、甘油三酯、尿素氮含量及谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性無顯著差異(P>0.05)。

表3 飼料中三丁酸甘油酯水平對黃顙魚血清生化指標的影響Table 3 Effects of dietary tributyrin levels on serum metabolite indices of yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco)

2.3 血清免疫指標

由表4可知，與G0組相比，G1、G2和G3組的血清LZM活性顯著升高(P<0.05)，G1和G2組血清AKP活性顯著升高(P<0.05)。G2組的血清IgM含量顯著高于G3組(P<0.05)。各組間的血清C3含量無顯著差異(P>0.05)。

表4 飼料中三丁酸甘油酯水平對黃顙魚血清免疫指標的影響Table 4 Effects of dietary tributyrin levels on serum immune indices of yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco)

2.4 血清抗氧化指標

由表5可知，與G0組相比，G1組血清T-AOC升高(P<0.05)，G1、G2和G3組的血清SOD活性顯著升高(P<0.05)。G3組血清CAT活性顯著高于G0、G1和G2組(P<0.05)。各組間的血清GSH-Px活性及GSH和MDA含量無顯著差異(P>0.05)。

表5 飼料中三丁酸甘油酯水平對黃顙魚血清抗氧化指標的影響Table 5 Effects of dietary tributyrin levels on serum antioxidant indices of yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco)

3 討 論

3.1 三丁酸甘油酯對黃顙魚生長性能和形體指標的影響

3.2 三丁酸甘油酯對黃顙魚血清生化指標的影響

動物機體中物質(zhì)代謝、健康狀況等可通過血清生化指標判斷，血液中的葡萄糖是機體的重要能量來源，本研究中，隨著三丁酸甘油酯添加水平的增加，血清中葡萄糖含量逐漸升高，2 000 mg/kg組達到最高值，在金頭鯛[22-23](Sparusaurata)、斑魚[16](Channaargus)得到相同的結(jié)果。血清總蛋白含量反映了機體蛋白質(zhì)吸收代謝程度，也是維持血液滲透壓重要成分。本試驗條件下，血清總蛋白、白蛋白和球蛋白含量與對照組相比無顯著差異，說明三丁酸甘油酯對黃顙魚血清中蛋白質(zhì)含量無顯著影響。高劑量添加三丁酸甘油酯增加脂肪沉積[24]，添加少量三丁酸甘油酯則可有效降低肝臟和血清脂肪含量，在高水平大豆油飼料中，添加4 g/kg三丁酸甘油酯可顯著降低大黃魚脂肪沉積，減少脂肪生成相關(guān)基因的表達[21]。而本研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加3種不同水平的三丁酸甘油酯對黃顙魚脂肪沉積無顯著影響，推測可能和魚的種類和添加劑量偏低有關(guān)。谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶是判斷肝臟健康狀況和蛋白質(zhì)代謝的重要指標，谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶正常情況下應(yīng)存在于肝細胞內(nèi)，當肝細胞損傷時，谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶才會進入血液。本研究表明，500、1 000、2 000 mg/kg組黃顙魚血清谷草轉(zhuǎn)氨酶活性低于對照組，但各組間無顯著差異；各組間血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性無顯著差異，說明飼料中添加三丁酸甘油酯對黃顙魚肝臟功能無顯著影響，在胡子鯰[25](Clariasfuscus)中研究結(jié)果與本試驗相同。尿素氮是蛋白質(zhì)代謝最終產(chǎn)物，也是判斷機體蛋白質(zhì)代謝能力強弱的關(guān)鍵指標。血清中尿素氮含量在1 000 mg/kg組為最高，但各組間無顯著差異，說明三丁酸甘油酯對黃顙魚蛋白質(zhì)代謝無顯著影響。

3.3 三丁酸甘油酯對黃顙魚血清免疫功能的影響

溶菌酶由T細胞、B細胞、淋巴細胞、噬菌體等細胞產(chǎn)生，魚血液中高水平的LZM與吞噬細胞釋放LZM產(chǎn)量增加有關(guān)[26]，本試驗中，與對照組相比，500、1 000和2 000 mg/kg組的血清LZM活性顯著升高，其中500 mg/kg組活性最高，隨添加水平增多而呈下降趨勢，推測飼料中添加三丁酸甘油酯可能激活吞噬細胞等產(chǎn)生LZM。同樣，Xie等[7]發(fā)現(xiàn)在鯉魚高植物蛋白質(zhì)飼料中添加2 g/kg三丁酸甘油酯可顯著提高血清LZM活性；Zhou等[10]在草魚飼料中添加200～400 mg/kg的三丁酸甘油酯亦得到相同的結(jié)論。AKP是一種堿性磷酸水解酶，是甲殼類和魚類重要的非特異性指標，也是反映水生動物健康狀況的重要指標[27]；C3是由肝細胞產(chǎn)生、參與體液免疫反應(yīng)的大分子球白質(zhì)，可以通過補體經(jīng)典激活途徑和旁路激活途徑參與免疫應(yīng)答，可直接溶解或中和病毒[28]，本試驗中，500和1 000 mg/kg組血清AKP活性顯著升高，各組間血清C3含量無顯著差異。IgM是B細胞分泌的一種參與體液免疫的抗體，IgM可與病原體結(jié)合發(fā)生非特異性免疫反應(yīng)。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與0 mg/kg組相比，500、1 000、2 000 mg/kg組血清IgM含量都有所增加，其中1 000 mg/kg組的血清IgM含量顯著高于2 000 mg/kg組。本研究結(jié)果表明，飼料中添加適量的三丁酸甘油酯可增加黃顙魚非特異性免疫。

3.4 三丁酸甘油酯對黃顙魚血清抗氧化能力的影響

魚類在正?；驂毫l件下會產(chǎn)生自由基和活性氧，為避免這些化合物對機體產(chǎn)生損傷，生物體可產(chǎn)生抗氧化酶如SOD、GSH-Px、CAT及MDA和T-AOC。T-AOC反映了機體整體抗氧化綜合能力，SOD可清除機體產(chǎn)生的自由基，維持機體抗氧化能力和抗氧化平衡[29]，本試驗中，500 mg/kg組黃顙魚血清T-AOC顯著高于0 mg/kg組，但1 000、2 000 mg/kg組T-AOC逐漸降低，說明添加500 mg/kg三丁酸甘油酯可顯著提高黃顙魚綜合抗氧化能力，過量添加三丁酸甘油酯可能對黃顙魚抗氧化能力產(chǎn)生負面影響，500、1 000、2 000 mg/kg組黃顙魚血清SOD的活性顯著提高，1 000 mg/kg組血清SOD活性最高，表明飼料中添加適量的三丁酸甘油酯可顯著增加黃顙魚抗氧化能力，在草魚[8,29]、團頭魴[5]上也有相同的結(jié)果。機體在應(yīng)激或壓力環(huán)境下易產(chǎn)生對細胞毒害作用的過氧化氫，而CAT能將過氧化氫分解為水和氧氣，避免過氧化氫對細胞的損害，本試驗中，2 000 mg/kg組血清CAT活性顯著高于其他各組，表明飼料添加適量三丁酸甘油酯可提高CAT活性，增強機體抗氧化能力。三丁酸甘油酯可增加ATP的含量，激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和蛋白激酶B(AKT)信號傳導(dǎo)，進一步激活細胞內(nèi)重要的多功能轉(zhuǎn)錄因子——乳紅系衍生的核因子2相關(guān)因子(Nrf2)信號通路，提高抗氧化酶基因的表達，從而增強抗氧化酶活性[30]。本試驗中，各組間的血清GSH-Px活性及GSH和MAD含量無顯著差異，這與草魚[8]、烏醴[15]、團頭魴[5]的研究結(jié)果不同，推測原因可能和魚的種類和三丁酸甘油酯的添加水平有關(guān)，具體原因有待進一步研究。研究結(jié)果表明，飼料中添加三丁酸甘油酯有助于黃顙魚提高抗氧化能力，不同添加水平對黃顙魚抗氧化指標也會產(chǎn)生不同的影響。

4 結(jié) 論

本研究表明，飼料中添加不同水平的三丁酸甘油酯可改善黃顙魚的生長性能、飼料效率，增強非特異性免疫力和抗氧化能力，三丁酸甘油酯可能是魚類潛在的免疫刺激劑，其最適宜添加水平為1 000 mg/kg。