不同pH下瘤胃微生物菌群密度及理化特性的變化

張 麗 李 川 邱清華 張 健 陳薪芋 許蘭嬌 趙向輝 李艷嬌 梁 歡 歐陽克蕙

(江西省動物營養(yǎng)重點實驗室，江西農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)與飼料安全創(chuàng)新團隊，南昌 330045)

瘤胃酸中毒是影響現(xiàn)代反芻動物生產(chǎn)的重要代謝病之一。正常情況下，反芻動物瘤胃內(nèi)的pH維持在6.5～7.5，當瘤胃pH低于5.8時[1](也有研究者認為是低于5.5時[2-3])，即視為發(fā)生亞急性瘤胃酸中毒(SARA)，pH低于5.0則發(fā)生急性瘤胃酸中毒[1]；或者pH降至5.2～5.6，且至少每天維持3 h以上，則認為發(fā)生了瘤胃酸中毒[4]。這種持續(xù)的低pH可對瘤胃微生物產(chǎn)生不同程度的酸脅迫。研究表明，微生物在面對酸脅迫時，可通過調(diào)控胞內(nèi)pH(pHi)的動態(tài)平衡、誘導脅迫應(yīng)激蛋白的表達，以及調(diào)節(jié)細胞膜形態(tài)功能等方式，來減少酸脅迫對細胞造成的損傷[5]。但當脅迫超過微生物的自身調(diào)節(jié)能力時，細胞內(nèi)質(zhì)子和酸根離子逐漸積累，pHi迅速降低，細胞膜和內(nèi)部大分子結(jié)構(gòu)會受損，從而影響細胞的正常生長和代謝，嚴重的情況下造成微生物死亡[6-8]。瘤胃微生物在遭受酸脅迫時發(fā)生的理化特性改變、增殖速度減慢、甚至死亡現(xiàn)象，也是影響瘤胃發(fā)酵及微生物區(qū)系變化的重要原因。目前，研究者更多關(guān)注瘤胃pH變化下瘤胃發(fā)酵特征以及微生物區(qū)系的改變，對瘤胃微生物本身理化特性的影響目前還未見相關(guān)報道。瘤胃酸中毒情況下瘤胃微生物是否遭受了酸脅迫，這種脅迫如何從生理學角度來度量，復(fù)雜的瘤胃菌群在酸脅迫下的生理應(yīng)答表現(xiàn)與單一菌是否相同?這些都是我們未掌握的內(nèi)容。基于此，本研究旨在研究低pH對瘤胃菌群密度及理化特性的影響，解析酸脅迫環(huán)境下瘤胃菌群的生理應(yīng)答，為探討瘤胃酸中毒的發(fā)生機制提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及飼糧

試驗以5頭干奶期荷斯坦奶牛作為瘤胃液供體。奶牛飼糧精粗比為40∶60，飼糧組成為20%苜蓿干草、20%羊草干草、10%酒糟、10%象草、23%玉米、5%麥麩、4.5%豆粕、3%棉籽粕、2.5%菜籽粕和2%預(yù)混料。每日飼喂2次(08：00和18：00)，自由飲水。

1.2 試驗設(shè)計和試驗方法

試驗采用體外法，參考瘤胃酸中毒的判定標準設(shè)置5個處理，培養(yǎng)液pH分別為6.5、5.8、5.5、5.2和5.0，每個處理5個重復(fù)。晨飼前采集瘤胃液，使用4層紗布對瘤胃液進行過濾除雜混合后，測定pH為6.82，保存于保溫瓶中并迅速轉(zhuǎn)運至實驗室備用。參考Menke等[9]的方法配制人工唾液，按瘤胃液∶人工唾液=1∶2配制混合培養(yǎng)液，39 ℃及飽和二氧化碳(CO2)下保存?zhèn)溆?。? mol/L鹽酸(HCl)和1 mol/L氫氧化鈉(NaOH)調(diào)節(jié)pH為6.5、5.8、5.5、5.2和5.0，然后往每個發(fā)酵瓶加入0.4 g底物(風干的干奶期奶牛飼糧)和60 mL培養(yǎng)液，通入CO2至飽和，并用橡膠塞密封。放入恒溫搖床39 ℃下培養(yǎng)至3 h后冰浴終止發(fā)酵，用于相關(guān)指標的測定。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 瘤胃菌群密度測定

瘤胃菌群密度測定參考吳重德[10]的方法并稍作修改。樣品經(jīng)紗布過濾除雜，每個樣品取2 mL培養(yǎng)液離心，棄上清，等體積重懸，取上清液，作為測定管；同時，取上清液經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過濾后，作為空白對照管。分別加入96孔板，于600 nm的全波長酶標儀(SpectraMax 190,Molecular Devices,Sunnyvale,CA,美國)下測定吸光度(OD)值。

1.3.2 瘤胃微生物氫ATP酶(H+-ATPase)活性測定

參考文獻[11]使用H+-ATPase活性檢測試劑盒(GMS50244.3 v.A，上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)測定瘤胃微生物H+-ATPase活性。取1 mL培養(yǎng)液離心，棄上清液，加入500 μL裂解液，充分混勻，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的1.5 mL離心管，渦旋振蕩15 s，置于冰槽，每隔10 min渦旋振蕩15 s，30 min后離心，移取500 μL上清液再次離心，棄上清液，加入200 μL保存液，混勻，靜置。具體測定方法參照試劑盒說明書進行。

1.3.3 瘤胃微生物胞內(nèi)ATP含量測定

采用螢火蟲素酶-螢火蟲素化學發(fā)光法[12]，使用ATP含量檢測試劑盒(A095-1-1，南京建成生物工程研究所)測定瘤胃微生物胞內(nèi)ATP含量。取1.5 mL培養(yǎng)液，使用生理鹽水重懸，加入200 μL裂解液，吹散后使用振蕩儀充分裂解5 min，裂解后離心。在上清液中加100 μL酶工作液到全黑色檢測孔，室溫放置5 min后，加入20 μL樣品，混勻，放入多功能酶標儀檢測，使用光度計測定lum值。多功能酶標儀(SpectraMax M2,Molecular Devices,Sunnyvale,CA,美國)設(shè)置為wellscan9點掃描后的平均值。整個過程置于冰上操作，待測定胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量后，計算ATP含量。

1.3.4 瘤胃微生物胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量的測定

使用胞內(nèi)蛋白質(zhì)檢測試劑盒(A045-4-2，南京建成生物工程研究所)，采用二喹啉甲酸(BCA)法測定瘤胃微生物胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量。樣品處理方法同1.3.3，取上清液測定，具體測定方法參照試劑盒說明書進行。

1.3.5 瘤胃微生物pHi和細胞跨膜pH差(ΔpH)的測定

瘤胃微生物pHi和ΔpH根據(jù)Guan等[13]報道的方法，采用熒光探針法，使用BCECF-AM試劑盒(S1006，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)進行測定。取1 mL培養(yǎng)液離心，棄上清；底物使用50 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸鉀(HEPES-K)緩沖液(pH=8)清洗重懸；加入1 μL的BCECF-AM，30 ℃孵育20 min；使用磷酸鉀(pH=7)清洗后重懸，樣液分為2份；一份不離心、另一份離心，分別使用激發(fā)波長490和440 nm測定，發(fā)射波長設(shè)定為525 nm，狹縫寬度5 nm(F)。根據(jù)下列公式計算熒光強度：

I=(S490-F490)/(S440-F440)。

式中：I表示熒光強度；S490、S440分別表示懸混液在490和440 nm下的OD值；F490、F440分別表示上清液在490和440 nm下的OD值。

pH標準曲線的測定：每個樣品對應(yīng)一條標準曲線，預(yù)處理方法同上，用等體積含1 μmol/L纈氨霉素(離子載體)和1 μmol/L尼日利亞菌素(去除質(zhì)子梯度的解偶聯(lián)劑)的HEPES-K緩沖液(pH=8)清洗重懸；30 ℃孵育20 min，離心收集沉淀，使沉淀分別重懸在不同pH的50 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH=4和5)和50 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH=6和7)中，加入1 μL的BCECF-AM，反應(yīng)條件及測定條件與樣品測定相同，測定出熒光強度，以pH為橫坐標、lg熒光強度為縱坐標繪制標準曲線，依據(jù)標準曲線計算pHi。

ΔpH根據(jù)以下公式計算：

ΔpH=pHi-pHex。

式中：ΔpH表示細胞跨膜pH差；pHi表示胞內(nèi)pH；pHex表示胞外pH。

1.3.6 瘤胃微生物細胞膜通透性的測定

參照Wu等[14]的方法，使用碘化丙啶(PI)檢測試劑盒(40710ES03，上海翌圣生物技術(shù)有限公司)測定瘤胃微生物細胞膜通透性。取培養(yǎng)液1 mL，離心收集沉淀，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌并離心，棄上清液；經(jīng)PBS清洗后重懸，稀釋至適當?shù)臐舛?。? mL稀釋后的樣品，平均分為2份，一份加入5 μL PI，立即避光反應(yīng)5 min(37 ℃避光孵育)；另一份不做處理。用PBS校對熒光分光光度計，取200 μL溶液，隨后在激發(fā)波長536 nm和發(fā)射波長617 nm條件下檢測未染色和染色后細胞中的熒光值，并利用以下公式分析細胞膜通透性：

PI吸收因子=[F(PBS+cells+PI)-F(PBS+cells)]/[F(PBS+PI)-F(PBS)]。

式中：F表示熒光值；PBS表示磷酸鹽緩沖液；cells表示細菌；PI表示碘化丙啶。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 24.0軟件中的ANOVA過程進行單因素方差分析，并使用Duncan氏法進行多重比較檢驗，以P<0.05為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié) 果

2.1 不同pH下瘤胃微生物菌群密度的變化

由圖1可見，隨著pH的不斷降低，瘤胃菌群密度呈先下降后上升再下降的波動，并在pH 5.2處理達到最高峰，且顯著高于其他各處理(P<0.05)。與pH 6.5處理相比，pH 5.8處理的瘤胃菌群密度顯著降低(P<0.05)，而pH 5.5和5.0處理的瘤胃菌群密度與pH 6.5和5.8處理之間無顯著差異(P>0.05)。

數(shù)據(jù)柱標注無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。Value columns with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).The same as below.圖1 不同pH下瘤胃微生物菌群密度的變化Fig.1 Changes of rumen microbiota density at different pH

2.2 不同pH下瘤胃微生物H+-ATPase活性的變化

由圖2可見，隨著pH的不斷降低，瘤胃微生物H+-ATPase活性呈上升后下降的趨勢，在pH 5.5處理達到最高，但各處理之間差異不顯著(P>0.05)。

圖2 不同pH下瘤胃微生物H+-ATPase活性的變化Fig.2 Changes of H+-ATPase activity in rumen microbiota at different pH

2.3 不同pH下瘤胃微生物胞內(nèi)ATP含量的變化

由圖3可見，隨著pH的不斷降低，瘤胃微生物胞內(nèi)ATP含量不斷下降，各處理之間無顯著差異(P>0.05)。

圖3 不同pH下瘤胃微生物胞內(nèi)ATP含量的變化Fig.3 Changes of intracellular ATP content in rumen microbiota at different pH

2.4 不同pH下瘤胃微生物胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量的變化

由圖4可見，隨著pH的不斷降低，瘤胃微生物胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量顯著升高(P<0.05)，且各處理間差異均達到顯著水平(P<0.05)。pH 5.8、5.5、5.2和5.0處理的瘤胃微生物胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量分別約為pH 6.5處理的1.20倍、1.49倍、1.89倍和2.13倍。

圖4 不同pH下瘤胃微生物胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量的變化Fig.4 Changes of intracellular protein content in rumen microbiota at different pH

2.5 不同pH下瘤胃微生物pHi和ΔpH的變化

由圖5可見，瘤胃微生物pHi隨pH的降低呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。與pH 6.5處理相比，pH 5.8處理的瘤胃微生物pHi并無顯著改變(P>0.05)，但pH 5.5和5.2處理瘤胃微生物pHi顯著升高(P<0.05)，pH 5.0處理又下降至與pH 6.5處理無顯著差異(P>0.05)。pH 5.5和5.2處理的瘤胃微生物pHi差異也不顯著(P>0.05)。由圖6可見，瘤胃微生物的ΔpH隨pH的降低先升高后降低，在pH 5.5處理達到最高。與pH 6.5處理相比，其他各處理瘤胃微生物的ΔpH顯著升高(P<0.05)，pH 5.5處理與pH 5.2處理之間無顯著差異(P>0.05)。與pH 5.5和5.2處理相比，pH 5.0處理瘤胃微生物的ΔpH顯著降低(P<0.05)。

圖5 不同pH下瘤胃微生物pHi的變化Fig.5 Changes of pHi in rumen microbiota at different pH

圖6 不同pH下瘤胃微生物ΔpH的變化Fig.6 Changes of ΔpH in rumen microbiota at different pH

2.6 不同pH下瘤胃微生物細胞膜通透性的變化

由圖7可見，隨著pH的不斷降低，瘤胃微生物熒光強度逐漸升高，說明膜通透性逐漸增大。與pH 6.5處理相比，pH 5.8處理的瘤胃微生物細胞膜通透性無顯著變化(P>0.05)；而pH 5.5、5.2和5.0處理的瘤胃微生物細胞膜通透性顯著高于pH 6.5處理(P<0.05)，且這3個處理之間差異均顯著(P<0.05)。

圖7 不同pH下瘤胃微生物細胞膜通透性的變化Fig.7 Changes of membrane permeability of rumen microbiota at different pH

3 討 論

3.1 不同pH下瘤胃菌群密度的變化

在微生物發(fā)酵過程中，環(huán)境酸脅迫對微生物生長和繁殖有較大影響[15-16]。在對單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)和運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)等的研究中均發(fā)現(xiàn)，隨著pH的下降，微生物的生長受到抑制，增殖速度下降，菌群密度降低[17-19]。這是由于酸脅迫影響了細胞的正常生長和代謝，嚴重的情況下甚至造成微生物死亡。與上述單一菌的研究結(jié)果不同的是，本試驗中瘤胃菌群密度呈現(xiàn)了波動變化，且在pH為5.2時顯著高于其他各處理。這可能是由于瘤胃微生物種類繁多，它們的最適環(huán)境pH和對低pH的耐受性不同，導致在不同pH環(huán)境下其增殖速度改變。例如，瘤胃細菌中纖維分解菌對pH的變化非常敏感，最適pH為6.2～7.0，當pH低于6.0時就會被抑制[20]。埃氏巨型球菌(Megasphaeraelsdenii)和反芻獸新月單胞菌(Selenomonasruminantium)的耐酸最低pH分別是5.6和5.4[21-22]。牛鏈球菌(Streptococcusbovis)[23]及乳酸桿菌[24](Lactobacillus)是瘤胃中典型的耐酸菌，耐酸最低pH分別為4.8和4.3，當pH低于5.0時生長開始受到抑制[25]。前人的研究表明，當瘤胃pH由6.5下降至5.8時，原蟲和纖維分解菌等大量消失；而在pH為5.5時，一些較耐酸的乳酸分解菌如埃氏巨型球菌和反芻獸新月單胞菌開始增加；當pH持續(xù)降低，耐酸的牛鏈球菌和乳酸桿菌大量繁殖[26]；當pH繼續(xù)下降到5.0以下，更多菌包括乳酸產(chǎn)生菌的生長都受到抑制。因此，我們推測本研究中瘤胃菌群所表現(xiàn)出的菌群密度的波動變化，有可能是因為瘤胃酸中毒過程中菌群結(jié)構(gòu)在不斷變化，但具體原因還需要更深入的研究。

3.2 不同pH下瘤胃微生物H+-ATPase活性的變化

H+-ATPase是一種膜結(jié)合的蛋白酶，能夠水解胞內(nèi)ATP從而逆濃度梯度跨膜轉(zhuǎn)運氫離子(H+)，以保持胞內(nèi)pH的穩(wěn)定[27]。H+-ATPase在維持細胞pHi穩(wěn)定方面起著極其重要的作用。當微生物遭受酸脅迫時，H+大量流入胞內(nèi)，為維持胞內(nèi)微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，微生物可通過激活質(zhì)膜上的H+-ATPase活性，消耗ATP將H+泵出胞外，從而提高自身耐酸能力[28]。Wang等[28]研究表明，在pH越低的環(huán)境中，白色鏈霉菌(Streptomycesalbus)的H+-ATPase活性越高。Miwa等[29]通過體外連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)，將培養(yǎng)物的pH從5.5降低到4.5，發(fā)現(xiàn)牛鏈球菌的H+-ATPase活性提高了2.2倍，這說明在酸脅迫下，細菌需要通過提高H+-ATPase活性恢復(fù)pHi。本試驗中，瘤胃微生物在培養(yǎng)液pH由6.5下降到5.5的過程中，H+-ATPase活性隨pH的降低呈上升趨勢，這一研究結(jié)果與前人研究結(jié)果相一致；但在pH為5.2和5.0時，H+-ATPase活性反而降低。張群[30]的研究也同樣發(fā)現(xiàn)，隨著pH的降低，產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogene)H+-ATPase活性并未升高而是呈下降的趨勢。因此，我們推測當pH下降到5.2以下，瘤胃中的耐酸菌如乳酸桿菌等大量繁殖，細菌耐酸不再依賴H+-ATPase途徑，而是如酒酒球菌(Oenococcusoeni)一樣轉(zhuǎn)而依賴胞內(nèi)生成堿或者消耗胞內(nèi)質(zhì)子等途徑來實現(xiàn)[31]。

3.3 不同pH下瘤胃微生物胞內(nèi)ATP含量的變化

能量不僅需要供給菌體生長和繁殖，也被用以抵御微生物所遭受的酸脅迫，維持細胞生存，如質(zhì)子的泵出、DNA等大分子損傷的修復(fù)以及受損蛋白的清除等[32]。眾多研究發(fā)現(xiàn)，細菌的胞內(nèi)ATP含量都隨pH的降低而降低，且強酸脅迫下胞內(nèi)ATP含量顯著降低[33-35]。王大慧等[36]研究表明，富硒產(chǎn)朊假絲酵母(Selenium-enrichcandida)在pH為3.5和5.5條件下，隨著發(fā)酵時間的延長，在發(fā)酵15和24 h時胞內(nèi)ATP含量無顯著差異，而在發(fā)酵36 h后胞內(nèi)ATP含量顯著降低。陳楊等[37]研究同樣表明，灰色產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesgriseochromogenes)胞內(nèi)ATP含量在培養(yǎng)12～24 h急劇增加，之后驟降。這說明細菌在脅迫環(huán)境下，細菌胞內(nèi)需要增加ATP的供給，以泵出質(zhì)子(H+)抵御酸脅迫，當脅迫時間較長，由于能源物質(zhì)的不足，或者胞質(zhì)酸化導致細胞器功能損傷，會造成胞內(nèi)ATP含量的降低[38]。Lou等[39]研究發(fā)現(xiàn)，細長聚球藻(Synechococcuselongatus)在受到短時間脅迫時，胞內(nèi)ATP含量會升高。在本研究中，隨著pH的降低，瘤胃微生物胞內(nèi)ATP含量逐漸下降，但差異并不顯著。這說明本試驗條件下，脅迫時間尚短，瘤胃微生物胞內(nèi)能量供給尚充足，因此能暫時保證ATP的供給平衡；如果脅迫時間再延長，將有可能導致胞內(nèi)ATP含量的下降。

3.4 不同pH下瘤胃微生物胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量的變化

低pH會導致DNA的脫嘌呤和脫嘧啶，從而對細胞生物大分子產(chǎn)生破壞作用。而細菌體內(nèi)可通過產(chǎn)生具有保護和修復(fù)作用的一些應(yīng)激蛋白和分子伴侶蛋白，參與酸脅迫應(yīng)激反應(yīng)，對DNA和蛋白質(zhì)進行保護和修復(fù)，也能清除受損的蛋白，從而起到穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)、維持細胞功能的作用[40-42]。研究表明，變形鏈球菌(Streptococcusmutans)和肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)在酸脅迫下，分子伴侶DnaK水平和熱應(yīng)激蛋白Gro ES、Gro EL等的表達水平顯著上調(diào)[43]。吳重德[10]采用雙向差異凝膠電泳(2D-DIGE)和同位素標記相對和絕對定量(i-TRAQ)技術(shù)對干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)酸脅迫前后蛋白表達進行研究，發(fā)現(xiàn)脅迫后(pH 3.5)與脅迫前(pH 6.5)相比，有23個蛋白上調(diào)1.25倍以上，其中包括與9個與碳水化合物和能量代謝相關(guān)的、6個與蛋白與轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)的蛋白，以及5個分子伴侶蛋白。李琳瓊等[44]則發(fā)現(xiàn)酸脅迫下鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)中分子質(zhì)量在35～180 ku的部分膜蛋白表達量提高，表達種類增加，其耐酸性提高，生存能力增強。在本研究中，隨著pH的不斷降低，瘤胃微生物胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量顯著升高，這一結(jié)果與前人的研究結(jié)果相一致，說明瘤胃微生物在pH降低的情況下會通過增加相關(guān)蛋白來抵御酸脅迫，但具體是哪種蛋白還需要更進一步的研究。

3.5 不同pH下瘤胃微生物pHi和ΔpH的變化

pHi穩(wěn)態(tài)是微生物的一種正常生理狀態(tài)，同時pHi在一定范圍內(nèi)的小幅度變化也是微生物抵抗酸脅迫的一種重要機制[45]。在營養(yǎng)物質(zhì)匱乏的體外培養(yǎng)系統(tǒng)中，酸脅迫下細菌快速獲得能量的來源主要是依靠ΔpH和電位差(Δψ)這2種質(zhì)子推動力，在質(zhì)子推動力的作用下，細胞膜H+-ATPase可以合成ATP[46]。Thomassin等[47]研究發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)在pH 6.0和5.5條件下，細菌pHi隨培養(yǎng)基pH的降低而升高。然而，也有研究者發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、酵母菌(Saccharomyces)在胞外pH下降時，pHi降低[48-49]。這可能是酸脅迫強度不同時細菌的不同反應(yīng)。程昌勇[50]研究表明，在pH為5.5和4.5時，單核細胞增生李斯特菌的pHi先快速下降后緩慢反彈，然后維持穩(wěn)定狀態(tài)；而在pH為3.5時，細菌pHi急劇下降后無任何反彈趨勢。這說明單核細胞增生李斯特菌在弱酸脅迫時，可通過調(diào)節(jié)pHi產(chǎn)生較大的ΔpH獲得驅(qū)動質(zhì)子泵出的動力，但在強酸脅迫時，細菌穩(wěn)態(tài)被破壞，無法再恢復(fù)原有機能。本研究中，我們也觀察到瘤胃微生物pHi在pH由6.5下降到5.5時不斷提高，在pH為5.0時又降低；而ΔpH在培養(yǎng)液pH下降過程中不斷提高，但在pH為5.0時又降低。這說明pH 5.0可能造成較強的酸脅迫，瘤胃微生物無法再通過提高ΔpH途徑來調(diào)節(jié)質(zhì)子平衡，開始更依賴其他途徑來減緩酸脅迫。

3.6 不同pH下瘤胃細菌細胞膜通透性的變化

細胞膜是保護細胞的屏障。細胞的生理活性與細胞膜通透性密切相關(guān)，其也可以反映細胞的生理狀態(tài)[51]。通常，膜的通透性是維持細胞存活和代謝活性的關(guān)鍵因素[52]。Hu等[53]研究表明，酸脅迫能改變細胞膜通透性，并隨著酸脅迫時間的延長而增大通透性。吳重德等[54]研究表明，干酪乳桿菌在酸脅迫下表面變得粗糙，細胞膜結(jié)構(gòu)受到破壞和破裂，細胞膜透性增加。Wu等[55]研究表明，酸脅迫環(huán)境會使干酪乳桿菌細胞膜脂肪酸組成發(fā)生改變，進而導致細胞膜通透性增大，這說明酸脅迫環(huán)境時會使細胞膜組分發(fā)生變化，從而降低細胞膜的完整性，增加細胞膜的通透性[56]。此外，Wu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，光滑念珠菌(Candidaglabrata)在pH 2.0環(huán)境下細胞膜通透性增大且ATP含量降低，說明細胞膜通透性增大導致H+大量進入胞內(nèi)使細胞器功能損傷進而影響著細胞的能量代謝。在本研究中，瘤胃微生物膜通透性隨著pH的降低而顯著增加，與上述研究結(jié)果相一致，說明瘤胃微生物在低pH環(huán)境下，細胞膜受到了損傷，不利于其生長繁殖。

4 結(jié) 論

① 隨著pH下降，瘤胃微生物菌群密度、pHi和H+-ATPase活性均呈現(xiàn)波動變化，胞內(nèi)ATP含量沒有顯著變化，但胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量顯著提高，細胞膜通透性顯著增加。

② 當pH降低至5.5時，瘤胃微生物細胞膜通透性和pHi顯著上升，表明其開始受到較嚴重的酸脅迫。

③ 當pH降低到5.2時，瘤胃微生物菌群密度最高，瘤胃菌群結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了較大的變化。