鹽脅迫對(duì)苜蓿營養(yǎng)品質(zhì)及附著微生物群落的影響

常 春 盧 強(qiáng) 孫 林 都 帥 格根圖 尹 強(qiáng) 賈玉山*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院，呼和浩特 010010；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，呼和浩特 010010；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，呼和浩特 010010；4.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，杭州 310058)

苜蓿(MedicagosativaL.)是多年生豆科牧草，具有適應(yīng)性強(qiáng)和營養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，其蛋白質(zhì)含量高，素有“牧草之王”的美譽(yù)。生物脅迫和非生物脅迫與苜蓿的生長發(fā)育密切相關(guān)，而鹽脅迫是影響苜蓿產(chǎn)量和營養(yǎng)品質(zhì)的主要非生物脅迫因素[1-2]。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織報(bào)告指出全球鹽堿地面積約為9.55×109hm2，而我國鹽堿地面積總計(jì)9.91×108hm2，主要分布在我國東北、華北及濱海等地[3]。種植苜蓿不僅能改良土壤鹽漬化，還能提高土壤肥力，緩解我國優(yōu)質(zhì)牧草飼料短缺和人畜爭糧的問題[4-6]。因此，在鹽堿地種植苜蓿是鹽漬化土壤改良、畜牧業(yè)健康發(fā)展和保障糧食安全的必然趨勢(shì)和重要研究方向。

苜蓿因較高的營養(yǎng)品質(zhì)被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)，其中青貯是雨季等限制性環(huán)境下苜蓿貯藏利用的主要方式之一[7-8]。青貯調(diào)制的機(jī)理是利用以乳酸菌為主的微生物發(fā)酵，通過其生命代謝活動(dòng)產(chǎn)生有機(jī)酸，使青貯飼料得以保存[9-10]，但青貯發(fā)酵是多種微生物共同作用的過程，微生物的種類和數(shù)量直接影響青貯品質(zhì)[11]。目前，鹽堿地苜蓿微生物群落研究還鮮有報(bào)道。鹽脅迫最直觀的體現(xiàn)是通過抑制光合作用和呼吸作用影響苜蓿產(chǎn)量[1,12]。以氯化鈉(NaCl)進(jìn)行鹽脅迫發(fā)現(xiàn)低濃度鹽脅迫對(duì)苜蓿生長無顯著影響，而隨著鹽含量增加苜蓿生長才會(huì)受到抑制，鹽含量達(dá)到400 mmol/L時(shí)苜蓿的生長發(fā)育基本停止[13]。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)輕度鹽脅迫與中、高度鹽脅迫相比能夠提高苜蓿產(chǎn)量，甚至優(yōu)于無鹽脅迫處理[14]。目前，有關(guān)苜蓿種子鹽脅迫萌發(fā)條件的篩選、耐鹽基因的篩選與表達(dá)、鹽脅迫對(duì)苜蓿生長發(fā)育的影響已進(jìn)行了諸多研究。也有研究發(fā)現(xiàn)，在鹽堿環(huán)境下，植物內(nèi)生真菌與植物生長和內(nèi)分泌密切相關(guān)[15]，例如，經(jīng)假單胞菌處理后能增加植物體內(nèi)脯氨酸含量，增強(qiáng)植物抗氧化應(yīng)激能力[16]。但鹽脅迫對(duì)苜蓿營養(yǎng)品質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)影響的研究還存在空白。因此，本試驗(yàn)擬開展鹽脅迫對(duì)苜蓿營養(yǎng)品質(zhì)及其附著微生物群落結(jié)構(gòu)影響的研究，從營養(yǎng)物質(zhì)組成和微生物群落角度探討苜蓿適應(yīng)鹽脅迫的規(guī)律，為鹽漬化地區(qū)苜蓿種植和青貯利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于包頭市鑫泰農(nóng)業(yè)試驗(yàn)基地，地處內(nèi)蒙古包頭市九原區(qū)哈林格爾鎮(zhèn)，位于黃河“幾字彎”，東經(jīng)110°27″～110°37″，北緯40°05″～40°17″，屬典型鹽漬化區(qū)域，該區(qū)域土壤鹽含量呈梯度分布(<1‰、1‰～2‰、2‰～3‰和3‰～4‰)。鹽含量大于1‰的土壤pH為8.44～8.73，無明顯差異。試驗(yàn)區(qū)氣候?yàn)楸睖貛Т箨憵夂?，雨熱同期，年平均氣溫?.8 ℃，年平均降雨量約為330 mm，多集中在6～9月。

1.2 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究以“中苜3號(hào)”苜蓿為試驗(yàn)材料，苜蓿種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所提供。紫花苜蓿于2020年5月播種，播種方式為條播，行距10 cm。試驗(yàn)地鹽含量分別為<1‰(無鹽脅迫，CK處理)、1‰～2‰(輕度鹽脅迫，LS處理)、2‰～3‰(中度鹽脅迫，MS處理)和3‰～4‰(重度鹽脅迫，HS處理)。每個(gè)鹽脅迫處理設(shè)置3個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)面積為30 m2(5 m×6 m)。所用試驗(yàn)材料為2021年第1茬初花期刈割苜蓿，來源于不同鹽含量試驗(yàn)地，留茬高度為5～8 cm。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 營養(yǎng)指標(biāo)測(cè)定

新鮮苜蓿刈割后取樣品500 g于105 ℃殺青15 min，在65 ℃下烘至恒重，計(jì)算干物質(zhì)(dry matter,DM)含量，粉碎后保存?zhèn)錅y(cè)。粗蛋白質(zhì)(crude protein,CP)含量使用杜馬斯燃燒法測(cè)定[17]。中性洗滌纖維(neutral detergent fiber,NDF)和酸性洗滌纖維(acid detergent fiber,ADF)含量使用Van Soest等[18]的方法測(cè)定?？扇苄蕴妓衔?water-soluble carbohydrates,WSC)含量使用蒽酮-硫酸比色法[19]測(cè)定?？扇苄缘鞍踪|(zhì)(soluble protein,SP)含量采用三氯乙酸法[20]進(jìn)行測(cè)定。采用GB/T 18246—2000《飼料中氨基酸的測(cè)定》方法測(cè)定脯氨酸和谷氨酸含量。

1.3.2 微生物多樣性分析

取5 g苜蓿樣品與45 mL無菌蒸餾水于拍打袋，無菌勻質(zhì)器12次/s拍打2 min，轉(zhuǎn)移至無菌50 mL離心管，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，-80 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù) E.Z.N.A.?soil DNA kit說明書進(jìn)行微生物群落總DNA提取。使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA的質(zhì)量，使用NanoDrop 2000測(cè)定DNA濃度和純度。對(duì)16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃保存。使用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGG GTWTCTAAT-3′)對(duì)16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增引物由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系包括：5×TransStartFastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上游引物(5 μmol/L) 0.8 μL，下游引物(5 μmol/L) 0.8 μL，TransStartFastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，超純水補(bǔ)足至20 μL。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，27個(gè)循環(huán)。使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，并用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進(jìn)行純化。使用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并用QuantusTMFluorometer對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量。使用NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫，利用Illumina公司的MiSeq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Fastq對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控，并使用Flash進(jìn)行拼接；使用Uparse以97%的相似度閾值對(duì)序列進(jìn)行操作分類單元(OTU)聚類，同時(shí)剔除嵌合體；基于Silva 16S rRNA數(shù)據(jù)庫(v138)，利用RDP對(duì)OTU代表序列進(jìn)行物種分類學(xué)注釋并得到結(jié)果；通過距離量化分析樣本間群落結(jié)構(gòu)差異，計(jì)算樣本間距離獲得距離矩陣，使用主坐標(biāo)分析(PCoA)結(jié)合ANOSIM進(jìn)行組間差異檢驗(yàn)，評(píng)估群落結(jié)構(gòu)的差異性；基于物種注釋結(jié)果，使用韋恩圖對(duì)各處理中微生物物種組成進(jìn)行解析，單因素方差分析獲得優(yōu)勢(shì)微生物組成信息；使用R version 3.6.3對(duì)鹽脅迫、微生物及營養(yǎng)指標(biāo)進(jìn)行斯皮爾曼相關(guān)性計(jì)算，并繪制相關(guān)性熱圖。使用Excel 2007對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理和前期處理。使用SigmaPlot 12.5進(jìn)行相關(guān)圖表的繪制。使用Adobe Illustrator CS6進(jìn)行相關(guān)圖片的整理。使用SAS 9.0進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對(duì)苜蓿營養(yǎng)物質(zhì)組成的影響

苜蓿營養(yǎng)物質(zhì)組成在鹽脅迫下表現(xiàn)出復(fù)雜的變化規(guī)律。從圖1可以看出，根據(jù)鹽含量聚類分析出現(xiàn)了3種聚類方式，即CK、LS處理和HS、MS處理；按營養(yǎng)物質(zhì)劃分為2類，即纖維類和其他類營養(yǎng)物質(zhì)。MS處理酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維含量顯著低于其他處理(P<0.05)；MS處理木質(zhì)素含量顯著低于CK處理(P<0.05)，與LS和HS處理無顯著差異(P>0.05)。MS處理谷氨酸、脯氨酸、可溶性蛋白質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和可溶性碳水化合物含量與其他處理相比顯著增加(P<0.05)，且均以CK處理最低。各處理脂肪酸含量無顯著差異(P>0.05)。

同行數(shù)據(jù)框標(biāo)注不同字母表示在0.05水平差異顯著(P<0.05)。Data frame in the same row with different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level (P<0.05).圖1 鹽脅迫下苜蓿營養(yǎng)物質(zhì)組成Fig.1 Nutritive substance composition of alfalfa at salt stress

2.2 鹽脅迫苜蓿微生物群落多樣性分析

鹽脅迫下苜蓿表面附著的微生物群落多樣性如圖2所示。所有處理的微生物群落多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù)，圖2-A)和豐富度指數(shù)(Chao1指數(shù)，圖2-B)均無顯著差異(P>0.05)。韋恩圖(圖2-C)顯示CK、LS、MS和HS處理共有的OTU有98個(gè)，特有的OTU數(shù)分別為11、13、9和6個(gè)，表明不同程度鹽脅迫改變了苜蓿表面附著的微生物群落結(jié)構(gòu)。為深入研究各處理微生物群落的差異進(jìn)行PCoA，PCoA圖顯示鹽脅迫未完全改變其微生物群落結(jié)構(gòu)。

2.3 鹽脅迫微生物群落組成分析

物種分類信息的差異說明了微生物群落結(jié)構(gòu)的變化對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)。由表1可知，在門水平上，主要為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)。變形菌門為所有處理中的優(yōu)勢(shì)菌門，相對(duì)豐度均超過了80%，其次是放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門，有趣的是厚壁菌門的相對(duì)豐度在MS和HS處理增加。在屬水平上，泛菌屬(Pantoea)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、根瘤菌屬(Rhizobium)和腸桿菌屬(Enterobacter)為優(yōu)勢(shì)菌屬。甲基桿菌屬和根瘤菌屬隨著鹽含量的增加呈下降趨勢(shì)，MS和HS處理中甲基桿菌屬和根瘤菌屬的相對(duì)豐度顯著低于CK處理(P<0.05)。厚壁菌門和擬桿菌門中的優(yōu)勢(shì)菌屬雖然發(fā)生了變化，但各處理間無顯著差異(P>0.05)。

A：Shannon指數(shù)；B：Chao1指數(shù)；C：OTU水平韋恩圖；D：OTU水平主坐標(biāo)分析。A:Shannon index;B:Chao1 index;C:Venn diagram at OTU level;D:PCoA at OTU level.圖2 鹽脅迫下微生物群落多樣性Fig.2 Microbial community diversity at salt stress

表1 鹽脅迫下苜蓿微生物群落組成Table 1 Microbial community composition of alfalfa at salt stress %

續(xù)表1門水平Phylumlevel屬水平Genuslevel處理TreatmentsCKLSMSHSSEMP值P-value擬桿菌門Bacteroidetes0.390.6710.596.12金黃色桿菌屬Chryseobacterium0.230.129.270.032.290.4428網(wǎng)絡(luò)鞘氨醇桿菌屬Sphingobacterium0.060.271.282.650.470.1872黃桿菌屬Flavobacterium0.050.170.033.290.790.4195厚壁菌門Firmicutes0.741.840.613.02微小桿菌屬Exiguobacterium0.571.070.091.260.280.4953芽孢桿菌屬Bacillus0.010.180.031.340.310.4113放線菌門Actinobacteria5.946.474.305.34短小桿菌屬Curtobacterium1.35b3.22a1.97ab1.36b0.320.0079微桿菌屬M(fèi)icrobacterium1.870.960.951.970.240.2551其他Others其他Others6.96a4.80ab2.74b4.97ab0.530.0133

2.4 鹽脅迫苜蓿附著微生物群落功能分析

基于KEGG的微生物群落結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行PICRUSt功能預(yù)測(cè)分析，結(jié)果如圖3所示。在等級(jí)1水平代謝功能分為6類，包括代謝、環(huán)境信息處理、基因信息處理、細(xì)胞代謝過程、人類疾病和有機(jī)系統(tǒng)(圖3-A)。在此基礎(chǔ)上對(duì)功能進(jìn)行細(xì)化，如圖3-B所示，代謝主要富集在碳水化合物代謝和氨基酸代謝，環(huán)境信息處理集中在膜轉(zhuǎn)運(yùn)，基因信息處理集中在復(fù)制和修復(fù)。為深入了解微生物參與的代謝功能，在等級(jí)2水平上繼續(xù)細(xì)化，在等級(jí)3水平上排名前30的代謝功能如圖3-C所示，代謝主要富集在核酸代謝、氨基酸代謝、能量代謝和碳水化合物代謝。排名前30的代謝功能所占代謝途徑達(dá)22條，碳水化合物代謝仍是代謝的主要方式。從圖3-C中可以發(fā)現(xiàn)，代謝能力從CK處理到LS處理呈升高的趨勢(shì)，隨著鹽含量繼續(xù)增加，代謝能力呈現(xiàn)持續(xù)下降的變化趨勢(shì)，在輕度鹽脅迫(LS處理)時(shí)代謝能力達(dá)到峰值。

2.5 鹽脅迫苜蓿附著微生物與多重營養(yǎng)指標(biāo)關(guān)聯(lián)分析

鹽脅迫與微生物組成密切相關(guān)，關(guān)聯(lián)分析顯示鹽含量與鞘脂單胞菌屬的相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，與甲基桿菌屬、阿爾塔米拉金色單胞菌屬、叢毛單胞菌屬和金黃色桿菌屬的相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.001,P<0.01)(圖4-A)。

微生物群落結(jié)構(gòu)與營養(yǎng)品質(zhì)的形成密切相關(guān)[21]，本試驗(yàn)基于斯皮爾曼相關(guān)性分析揭示了鹽脅迫下主要微生物屬的相對(duì)豐度(前25)與營養(yǎng)物質(zhì)含量的相關(guān)關(guān)系。常規(guī)營養(yǎng)物質(zhì)含量與微生物屬相對(duì)豐度的相關(guān)關(guān)系如圖4-B所示(圖中只顯示存在顯著相關(guān)性的微生物屬)，阿爾塔米拉金色單胞菌屬、甲基桿菌屬、微桿菌屬和根瘤菌屬的相對(duì)豐度均與干物質(zhì)含量無顯著相關(guān)關(guān)系(P>0.05)；阿爾塔米拉金色單胞菌屬的相對(duì)豐度與酸性洗滌纖維和木質(zhì)素含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.001，P<0.05)，與粗蛋白質(zhì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)；甲基桿菌屬的相對(duì)豐度只與酸性洗滌纖維和木質(zhì)素含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01，P<0.05)；而微桿菌屬的相對(duì)豐度與木質(zhì)素含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，與粗蛋白質(zhì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)；根瘤菌屬的相對(duì)豐度與酸性洗滌纖維、木質(zhì)素和中性洗滌纖維含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.001，P<0.01，P<0.05)，與粗蛋白質(zhì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。

A：等級(jí)1水平代謝功能；B：等級(jí)2水平代謝功能；C：等級(jí)3水平代謝功能。A:metabolism functions at level 1;B:metabolism functions at level 2;C:metabolism functions at level 3.圖3 基于KEGG的鹽脅迫下苜蓿微生物群落功能預(yù)測(cè)Fig.3 Function prediction of microbial community of alfalfa at salt stress based on KEGG

對(duì)非常規(guī)營養(yǎng)物質(zhì)含量進(jìn)行的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，與非常規(guī)營養(yǎng)物質(zhì)含量存在顯著相關(guān)性的微生物屬也是阿爾塔米拉金色單胞菌屬、甲基桿菌屬和根瘤菌屬(圖4-C)。阿爾塔米拉金色單胞菌屬的相對(duì)豐度與谷氨酸、脯氨酸和可溶性碳水化合物含量存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)；根瘤菌屬的相對(duì)豐度與谷氨酸、脯氨酸和可溶性碳水化合物含量存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01)；甲基桿菌屬的相對(duì)豐度和谷氨酸含量存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。

A：鹽脅迫和前25個(gè)微生物屬的相關(guān)性；B：前25個(gè)微生物屬與常規(guī)營養(yǎng)物質(zhì)的相關(guān)性；C：前25個(gè)微生物屬與非常規(guī)營養(yǎng)物質(zhì)的相關(guān)性。圖中只顯示存在顯著相關(guān)性的微生物屬。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001。A:correlation between salt stress and microbial genus (top 25);B:correlation between microbial genus (top 25) and conventional nutritive substances;C:correlation between microbial genus (top 25) and unconventional nutritive substances.Only with significant difference of the genera were noted.*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001.圖4 鹽脅迫下關(guān)聯(lián)分析Fig.4 Correlation analysis at salt stress

3 討 論

植物光合作用與其生長發(fā)育緊密相關(guān)，而鹽脅迫會(huì)限制光合作用直接影響其生長發(fā)育[12]。鹽脅迫的增強(qiáng)使土壤水勢(shì)下降，導(dǎo)致植物生理干旱，引起滲透脅迫[22]。植物為應(yīng)對(duì)鹽脅迫引起的滲透脅迫做出防御，體內(nèi)脯氨酸和可溶性碳水化合物的含量增加[23]，降低植物體內(nèi)束縛水和自由水的比例，保證體內(nèi)水分的轉(zhuǎn)運(yùn)[24]。此外，脯氨酸和谷氨酸含量的增加有利于緩解植物的氧化應(yīng)激，增強(qiáng)對(duì)鹽脅迫環(huán)境的適應(yīng)能力[25-26]。氨基酸的增加促進(jìn)了蛋白質(zhì)和可溶性蛋白質(zhì)的積累，但鹽脅迫超過植物可以承受的閾值時(shí)則會(huì)出現(xiàn)負(fù)效應(yīng)。因此，在本研究中，隨著鹽含量的增加，脯氨酸、谷氨酸、可溶性碳水化合物、蛋白質(zhì)和可溶性蛋白質(zhì)的含量呈梯度變化，且在中度鹽脅迫下達(dá)到最大值。有研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿中纖維類物質(zhì)含量與鹽脅迫沒有顯著相關(guān)性[27]。本研究與上述研究結(jié)果存在差異，鹽脅迫與纖維類物質(zhì)(酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維和木質(zhì)素)含量密切相關(guān)。鹽脅迫限制光合作用影響糖類物質(zhì)合成進(jìn)而影響細(xì)胞的分化和細(xì)胞壁組成可能是導(dǎo)致該結(jié)果的原因之一。

微生物群落結(jié)構(gòu)的組成與宿主生長發(fā)育、健康狀況和免疫防御密切相關(guān)。在本研究中，在不同鹽脅迫條件下微生物群落的多樣性和豐富度均無顯著差異，且韋恩圖顯示共有的和特有的OTU變化較小，PCoA表明鹽脅迫未完全改變其微生物群落結(jié)構(gòu)。為深入了解微生物群落結(jié)構(gòu)和組成的變化，本研究在門水平和屬水平對(duì)主要微生物群落組成進(jìn)行了分析。變形菌門是苜蓿中最主要的菌門，所有處理該菌門的相對(duì)豐度均超過了80%，其次是厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門。在屬水平上各種微生物屬所占比例雖然發(fā)生了變化，但起主導(dǎo)作用的微生物屬，如泛菌屬和假單胞菌屬，在不同鹽脅迫條件下微生物群落的多樣性和豐富度無顯著差異。本研究結(jié)果顯示，隨著鹽含量的增加，甲基桿菌屬和根瘤菌屬的相對(duì)豐度呈降低趨勢(shì)，這可能是由于甲基桿菌屬對(duì)鹽脅迫敏感[28-29]，且鹽脅迫能夠抑制根瘤菌屬的生命代謝活動(dòng)[30]。

微生物群落結(jié)構(gòu)的變化常導(dǎo)致其代謝功能發(fā)生改變。在等級(jí)1水平的主要代謝功能是代謝、環(huán)境信息處理和基因信息處理。代謝功能在等級(jí)2水平主要表現(xiàn)在碳水化合物代謝和氨基酸代謝，碳水化合物代謝和氨基酸代謝所對(duì)應(yīng)的代謝通路在等級(jí)3水平上表現(xiàn)出明顯的差異，進(jìn)一步表明蛋白質(zhì)、氨基酸、可溶性碳水化合物和纖維類物質(zhì)的差異。另外，環(huán)境信息處理主要集中在膜轉(zhuǎn)運(yùn)所對(duì)應(yīng)的代謝通路，可能影響細(xì)胞壁的合成，導(dǎo)致纖維類物質(zhì)出現(xiàn)差異。脂肪酸能夠有效抵御非生物脅迫對(duì)植物帶來的不良影響[31]，而本研究中脂肪酸含量在不同程度鹽脅迫下均無顯著差異，微生物群落功能的變化未導(dǎo)致脂肪酸相關(guān)代謝出現(xiàn)變化可能是導(dǎo)致該結(jié)果的主要原因。在上述基礎(chǔ)上對(duì)主要營養(yǎng)物質(zhì)和差異微生物進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)差異微生物與營養(yǎng)品質(zhì)密切相關(guān)。甲基桿菌屬和根瘤菌屬的相對(duì)豐度與纖維類物質(zhì)含量表現(xiàn)出強(qiáng)正相關(guān)關(guān)系，但還未見甲基桿菌屬和根瘤菌屬與纖維類物質(zhì)互作的報(bào)道。根瘤菌屬的相對(duì)豐度與谷氨酸、脯氨酸和粗蛋白質(zhì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，根瘤菌可利用周圍氮素進(jìn)行固氮，促進(jìn)自身生長繁殖[32]，這可能是導(dǎo)致該結(jié)果的主要原因。

4 結(jié) 論

本研究將苜蓿常規(guī)營養(yǎng)指標(biāo)與高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合探討鹽脅迫對(duì)苜蓿營養(yǎng)品質(zhì)及其附著微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫未完全改變苜蓿的營養(yǎng)品質(zhì)和附著的微生物群落結(jié)構(gòu)；鹽脅迫與鞘脂單胞菌屬的相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與甲基桿菌屬的相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；中度鹽脅迫(鹽含量2‰～3‰)能夠提高苜蓿營養(yǎng)品質(zhì)，改善附著的微生物群落中擬桿菌門和厚壁菌門的相對(duì)豐度。