葛根素和橙皮苷對熱應激條件下錦江黃牛養(yǎng)分表觀消化率和糞便菌群組成的影響
2023-02-08 02:13:08聶春桃瞿明仁宋小珍
動物營養(yǎng)學報 2023年1期
陳 豪 蘭 劍 聶春桃 陳 環(huán) 李 翌 瞿明仁 宋小珍
(江西農(nóng)業(yè)大學，江西省動物營養(yǎng)重點實驗室/營養(yǎng)飼料開發(fā)工程研究中心，南昌 330045)
南方夏季高溫高濕環(huán)境極易誘發(fā)肉牛熱應激，導致其食欲下降、免疫力低下、養(yǎng)分利用率降低，甚至出現(xiàn)熱射病，嚴重影響肉牛的生產(chǎn)性能和養(yǎng)殖效益[1]。為緩解熱應激對肉牛生產(chǎn)的不利影響，很多熱應激防治方法被大量研究。如采取遮蔭、噴淋、加裝風扇等措施來降低牛舍的溫度；通過提高飼糧蛋白質(zhì)水平、增加飼喂次數(shù)來提高肉牛養(yǎng)分攝入量；或是在肉牛出現(xiàn)熱應激疾病時使用抗生素類藥物治療，這些都在一定程度上緩解了肉牛熱應激反應，但也大大增加了飼養(yǎng)成本，甚至可能帶來肉品安全和生態(tài)環(huán)境破壞等問題。因此，尋找到一種安全、經(jīng)濟、有效的抗熱應激添加劑應用于肉牛生產(chǎn)就顯得尤為重要。錦江黃牛是江西著名的地方肉牛品種，經(jīng)過長期選育繁殖，具有抗高溫高濕、耐粗飼、抗病力和遺傳穩(wěn)定性強等優(yōu)點，而且肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)均衡、食用口感好[2]。
植物提取物通常指通過水提法、醇提法或超臨界流體萃取等手段從植物中提取的活性成分，包括生物堿類、黃酮類、多糖類等[3]。植物提取物源自天然，具有無毒副、無殘留、功能多樣等特性，因而近年來在熱應激防治上被大量研究。葛根素(puerarin)是從藥食同源植物葛根中提取的異黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗應激等多種作用[4]。汪紀倉等[5]研究發(fā)現(xiàn)，當飼糧中添加0.8 g/kg的葛根素時，其具有改善肉品質(zhì)的作用，并且可提高肉雞抗氧化能力。Peng等[6]報道，飼糧中補充葛根素可增強免疫，緩解肉牛熱應激，調(diào)節(jié)脂肪代謝。橙皮苷(hesperidin)是傳統(tǒng)中藥陳皮的主要活性成分之一，具有雙氫黃酮氧苷結構，屬于二氫黃酮衍生物，大量研究表明其具有抗氧化、抗炎、健脾促消化等功效[7-8]。賴星等[9]研究發(fā)現(xiàn)，橙皮苷可中和活性氧(ROS)并顯著提高血漿中過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，緩解仔豬的氧化應激，維護腸道微生物區(qū)系平衡，提高仔豬的抗氧化及免疫功能進而促進其生長。楊季[10]研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加50～100 mg/kg橙皮苷可以明顯提高肉仔雞的平均日增重，降低料重比(F/G)和腿肌的剪切力，增強血清和組織抗氧化及免疫功能，促進腸道形態(tài)發(fā)育。這表明葛根素、橙皮苷作為添加劑使用有緩解動物熱應激、提高機體免疫功能等作用；但目前有關葛根素、橙皮苷對熱應激條件下肉牛養(yǎng)分表觀消化利用及其機理的影響鮮有報道。因此，本試驗在前期研究基礎上，探討飼糧中添加葛根素、橙皮苷及其復合物對熱應激條件下錦江黃牛養(yǎng)分表觀消化率和糞便菌群組成的影響，旨在為葛根素、橙皮苷作為肉?？篃釕ぬ砑觿┨峁├碚搮⒖肌?/p>
1 材料與方法
1.1 試驗材料
試驗所用的葛根素、橙皮苷均購于陜西某公司，純度分別為98%、90%。
1.2 試驗飼糧
基礎飼糧參考《肉牛飼養(yǎng)標準》(NY/T 815—2004)配制，精粗比為5∶5，其組成及營養(yǎng)水平見表1。
表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %
1.3 試驗設計
本試驗選用4頭健康、體況良好、體重在250 kg左右的錦江黃牛。采用4×4拉丁方試驗設計，全程共分為4個試驗期，每個試驗期時長為16 d，每個試驗期的后4 d為采樣階段，采樣結束后即開始下1期試驗。試驗分為4個組，對照組飼喂基礎飼糧，葛根素組飼喂基礎飼糧+0.04%葛根素(飼糧干物質(zhì)占比，下同)，橙皮苷組飼喂基礎飼糧+0.20%橙皮苷，復合組飼喂基礎飼糧+0.04%葛根素+0.20%橙皮苷。試驗選在夏季高溫高濕環(huán)境[平均溫度31.8 ℃，相對濕度75.4%，溫濕指數(shù)(THI)84.6]下進行。
1.4 飼養(yǎng)管理
單欄圈養(yǎng)，每天飼喂2次(08：00和18：00)，先精后粗，精粗比為5∶5，自由飲水。每日記錄精粗料采食量。其他管理辦法同牛場。
1.5 樣品采集
1.5.1 飼料樣品采集
試驗每期采集少許精料和粗飼料樣品，混合均勻后按四分法取樣，65 ℃烘箱烘干48 h，再回潮24 h，隨后進行粉碎，再分裝入自封袋中冷凍保存。
1.5.2 糞樣采集
采取全收糞法，每期試驗的第13～15天，連續(xù)3 d收集試驗牛的全部糞便，混勻、稱重。每天取每頭牛鮮糞總重的5%，混合，按100 g加20 mL 10%的硫酸固氮，-20 ℃保存。
1.6 檢測指標
1.6.1 牛舍環(huán)境溫度、濕度以及牛的體溫、呼吸頻率
在每期試驗的第1、4、7、10、13、16天記錄試驗牛的體溫(肛溫)、呼吸頻率等。在牛舍距離地面1.5 m處的位置懸掛2個溫濕度計，在每天的07:30、13:00和19:30記錄牛舍內(nèi)的溫度和濕度，計算每天牛舍內(nèi)環(huán)境的溫濕度指數(shù)(THI)，計算公式如下：
THI=td-(0.55-0.55×RH)×(td-58)。
式中：td為華氏溫度(℉)，td=攝氏溫度(℃)×1.8+32；RH為相對濕度(%)。
1.6.2 養(yǎng)分表觀消化率
飼糧及糞便中干物質(zhì)(DM)、粗蛋白質(zhì)(CP)、粗脂肪(EE)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)等指標測定方法參照張麗英主編的《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術》進行。
某養(yǎng)分表觀消化率(%)=100×(飼糧中該養(yǎng)分含量-糞便中該養(yǎng)分含量)/飼糧中該養(yǎng)分含量。
1.6.3 菌群多樣性測定與分析
利用16S rRNA基因測序技術測定糞便菌群多樣性，具體操作由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。通過MiSeq PE300測序平臺進行微生物多樣性檢測，分析在門水平和屬水平的群落物種組成及相對豐度。以提取的樣品總DNA為模板，對細菌16S rRNA V3～V4高變區(qū)兩側的引物進行PCR擴增，所采用的細菌通用引物序列為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。
1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
先對試驗數(shù)據(jù)進行錄入和初步整理，再根據(jù)4×4拉丁方試驗設計方案進行后續(xù)統(tǒng)計分析，以SPSS 22.0中一般線性模型進行單變量分析，將試驗牛只和試驗時期作為固定效應，采用Tukey法為主，以LSD法為輔進行兩兩比較。P<0.05表示差異顯著。
2 結果與分析
2.1 牛舍環(huán)境及THI變化
根據(jù)記錄的每日牛舍內(nèi)的溫度和濕度，計算牛舍內(nèi)的THI并繪制成圖，如圖1所示。從圖中可以看到，在試驗期間，牛舍內(nèi)的THI始終處于高位，全部高于72，表明試驗牛處于熱應激狀態(tài)，符合試驗所需的熱應激條件。
圖1 牛舍環(huán)境溫度、相對濕度和溫濕度指數(shù)Fig.1 Temperature,relative humidity and THI in house of cattle
2.2 葛根素、橙皮苷對熱應激條件下錦江黃牛采食量、體溫和呼吸頻率的影響
由表2可知，與對照組相比，各試驗組采食量均無顯著變化(P>0.05)，復合組的體溫顯著下降(P<0.05)，葛根素組、橙皮苷組的呼吸頻率顯著下降(P<0.05)。
表2 葛根素、橙皮苷對熱應激條件下錦江黃牛采食量、體溫和呼吸頻率的影響Table 2 Effects of puerarin and hesperidin on feed intake,body temperature and respiratory rate of Jinjiang yellow cattle under heat stress
2.3 葛根素、橙皮苷對熱應激條件下錦江黃牛養(yǎng)分表觀消化率的影響
由表3可知，與對照組相比，葛根素組的干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和中性洗滌纖維表觀消化率顯著升高(P<0.05),橙皮苷組的粗脂肪表觀消化率顯著升高(P<0.05),復合組的粗脂肪、中性洗滌纖維表觀消化率顯著升高(P<0.05)。
表3 葛根素、橙皮苷對熱應激條件下錦江黃牛養(yǎng)分表觀消化率的影響Table 3 Effects of puerarin and hesperidin on nutrient apparent digestibility of Jinjiang yellow cattle under heat stress %
2.4 葛根素、橙皮苷對熱應激條件下錦江黃牛糞便菌群組成的影響
2.4.1 α多樣性分析
由表4可知，與對照組相比，葛根素組的Simpson指數(shù)顯著下降(P<0.05)；橙皮苷組的Shannon、Sobs指數(shù)顯著升高(P<0.05)，Simpson指數(shù)顯著下降(P<0.05)。4個組的覆蓋度均大于0.99，能準確地反映熱應激條件下錦江黃牛糞便菌群的組成。
表4 葛根素和橙皮苷對熱應激條件下錦江黃牛糞便菌群豐富度和多樣性指數(shù)的影響Table 4 Effects of puerarin and hesperidin on fecal microflora richness and diversity indexes of Jinjiang yellow cattle under heat stress
2.4.2 葛根素、橙皮苷對熱應激條件下錦江黃牛糞便菌群相對豐度的影響
由表5可知，門水平上，與對照組相比，葛根素組的放線菌門(Actinobacteriota)相對豐度顯著升高(P<0.05)，橙皮苷組、復合組的擬桿菌門(Bacteroidetes)相對豐度顯著升高(P<0.05)，放線菌門(Actinobacteriota)相對豐度顯著升高(P<0.05)。屬水平上，與對照組相比，3個試驗組的羅姆布茨菌屬(Romboutsia)和橙皮苷組的理研菌科RC9腸道菌群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)相對豐度都顯著升高(P<0.05)。其他菌種各組間差異不顯著(P>0.05)。
表5 葛根素和橙皮苷對熱應激條件下錦江黃牛糞便菌群相對豐度的影響 Table 5 Effects of puerarin and hesperidin on relative abundance of fecal microflora of Jinjiang yellow cattle under heat stress %
3 討 論
3.1 飼糧中添加葛根素和橙皮苷對熱應激條件下錦江黃牛體溫和呼吸頻率的影響
一般情況下，當THI>72時，表示處于熱應激狀態(tài)，72
劉海林等[13]用薄荷、陳皮、藿香和石膏組成的中藥配方配合益生菌飼喂熱應激奶牛，使奶牛奶產(chǎn)量提高，各試驗組直腸溫度、呼吸頻率和心率的全期平均值均低于對照組。此外，本試驗結果還顯示，葛根素+橙皮苷復合組的體溫顯著下降，這提示葛根素和橙皮苷在緩解肉牛熱應激反應上可能存在一定的互作效應。
3.2 飼糧中添加葛根素和橙皮苷對熱應激條件下錦江黃牛養(yǎng)分表觀消化率的影響
有報道顯示，熱應激可能引起機體缺氧缺血，體內(nèi)大量的血液會被分配到體表幫助散熱,從而導致消化道血流量減少，胃腸結構受損，養(yǎng)分消化利用率降低[14]。張燦[15]研究發(fā)現(xiàn)，濕熱應激狀態(tài)下藏綿羊和山羊營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率降低。本試驗結果顯示，與對照組相比，葛根素顯著提高了熱應激錦江黃牛干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維的表觀消化率，橙皮苷顯著提高了熱應激錦江黃牛粗脂肪的表觀消化率，復合添加顯著提高了熱應激錦江黃牛粗脂肪、中性洗滌纖維的表觀消化率。其原因可能與葛根素、橙皮苷中含有的黃酮類物質(zhì)能增強動物抗氧化能力、增加食欲、緩解熱應激有關[16]。李俊年等[17]研究發(fā)現(xiàn)，隨葛藤草粉替代飼糧中苜蓿草粉水平的增加，波雜山羊的干物質(zhì)、中性洗滌纖維和粗蛋白質(zhì)表觀消化率均有顯著提高。楊保田等[18]研究表明，給奶牛飼喂中草藥山楂、橘皮可提高采食量，且采食速度加快，咀嚼次數(shù)增加和咀嚼時間增長可使食物得到更充分的研磨，增加了和消化液的接觸面積，有利于消化，提高了飼料轉(zhuǎn)換率。
3.3 飼糧中添加葛根素和橙皮苷對熱應激條件下錦江黃牛糞便菌群組成的影響
α多樣性是指一個特定區(qū)域或者生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，常用的度量標準有Sobs、Chao1、Shannon、Ace、Simpson指數(shù)及覆蓋度等。Sobs、Ace和Chao1指數(shù)反映微生物群落的豐富度，Shannon、Simpson指數(shù)反映微生物群落的多樣性，Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小表明微生物多樣性越高。研究發(fā)現(xiàn)，在高溫刺激下，腸道菌群α和β多樣性降低，菌群物種豐富度與數(shù)量顯著下降[19]。本試驗結果顯示，與對照組相比，葛根素組的Simpson指數(shù)顯著下降，橙皮苷組的Sobs、Shannon指數(shù)顯著升高，Simpson指數(shù)顯著下降，這提示飼糧中添加葛根素、橙皮苷可能提高糞便菌群的多樣性。劉仲昊[20]發(fā)現(xiàn)，在育肥豬飼糧中添加500 mg/kg葛根粗提物和500 mg/kg金銀花粗提物混合物可提高育肥豬直腸微生物多樣性和豐度，改善育肥豬直腸微生物結構，促進益生菌生長和繁殖，并且可以改善育肥豬腸道菌群的代謝功能和微生物表型。Mei等[21]研究發(fā)現(xiàn)，橙皮苷能夠調(diào)節(jié)糖尿病模型小鼠腸道微生物群的結構，增加糞便中短鏈脂肪酸(SCFAs)的含量，這與本研究結果一致。
反芻動物胃腸道內(nèi)含有大量的微生物，它們在營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收過程中發(fā)揮著至關重要的作用。前人的研究結果證實，擬桿菌門和厚壁菌門(Firmicutes)是反芻動物胃腸道主要的優(yōu)勢菌群[22]，與本試驗結果一致，且兩者之和占比超過90%。擬桿菌門主要降解非纖維類物質(zhì)，有利于營養(yǎng)成分的消化和吸收[23]。Zhu等[24]研究表明，熱應激降低了蛋雞糞便中厚壁菌門相對豐度而增加擬桿菌門的相對豐度。本試驗結果顯示，橙皮苷組、復合組的擬桿菌門相對豐度均顯著升高，這表明添加橙皮苷和橙皮苷與葛根素的復合物可大大促進熱應激錦江黃牛擬桿菌門的增殖，提高肉牛降解非纖維類物質(zhì)的能力，這與本試驗中橙皮苷組和復合組的粗脂肪表觀消化率顯著提高的結果是一致的。放線菌門具有合成多種結構復雜的酶、抗生素等次生代謝產(chǎn)物的能力，能保護宿主免受病原菌感染[25]。有研究報道，反芻動物瘤胃內(nèi)的放線菌門和Desulfobacterota的相對豐度均會受熱應激的影響而降低[26]。本試驗中，葛根素組、橙皮苷組、復合組的放線菌門相對豐度都顯著升高，表明添加葛根素、橙皮苷改善了熱應激錦江黃牛糞便菌群結構，緩解了肉牛熱應激反應。
本試驗結果顯示，與對照組比較，3個試驗組的羅姆布茨菌屬相對豐度均顯著升高。羅姆布茨菌屬屬于消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)，專性厭氧菌，具有益生作用，可減輕大鼠的急性胰腺炎癥狀[27]；?；傻萚28]研究表明，黃酮類化合物可以與胃腸道微生物相互作用以改變胃腸道菌群，有針對性地促進胃腸道有益微生物的生長，這可能是3個試驗組養(yǎng)分表觀消化率提高的原因。理研菌科屬于擬桿菌門，與黏蛋白的降解呈正相關，與腸道黏膜健康具有重要作用，對維護腸道健康具有促進作用[29]。周加義等[30]研究發(fā)現(xiàn)，高溫應激可使畜禽腸黏膜機械屏障功能受損，導致腸道通透性增加，腸黏膜中某些組分改變。本試驗中，添加橙皮苷后可提高糞便中理研菌科RC9腸道菌群的相對豐度，這提示橙皮苷對維護反芻動物胃腸健康、促進養(yǎng)分消化利用具有積極作用。
4 結 論
夏季高溫高濕環(huán)境易導致錦江黃牛出現(xiàn)熱應激反應，在飼糧中添加葛根素、橙皮苷可降低錦江黃牛體溫和呼吸頻率，提高糞便菌群的多樣性及有益菌的相對豐度，提高養(yǎng)分表觀消化率，緩解錦江黃牛熱應激反應。
