硒源對(duì)泌乳牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)及微生物區(qū)系的影響

付 瑤 齊志國(guó) 王 俊 李 巖 金銀姬 程柏叢 郭江鵬*

(1.北京市畜牧總站，北京 100107；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部人力資源開發(fā)中心/中國(guó)農(nóng)學(xué)會(huì)，北京 100125)

近年來，富硒畜禽產(chǎn)品的巨大市場(chǎng)開發(fā)潛力使得有關(guān)硒的研究成為當(dāng)前學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)之一。飼糧中常見的補(bǔ)硒形式有無機(jī)硒和有機(jī)硒2種，研究表明無機(jī)硒生物利用率低，同時(shí)具有潛在毒性[1-2]，所以在實(shí)際生產(chǎn)中推薦使用有機(jī)硒源補(bǔ)硒。多數(shù)學(xué)者在硒源的選擇和硒的最佳用量方面進(jìn)行了相關(guān)研究，并證明了硒在反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)、生產(chǎn)和免疫方面的關(guān)鍵作用[3-7]，但仍存在一定的局限性。瘤胃是反芻動(dòng)物的第一胃，反芻動(dòng)物采食富硒飼糧到達(dá)瘤胃，瘤胃內(nèi)豐富的微生物對(duì)不同硒源飼糧進(jìn)行消化，導(dǎo)致瘤胃內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變[8]。研究表明，瘤胃微生物可以直接將硒源合成含硒氨基酸[9]。同時(shí)，瘤胃微生物對(duì)有機(jī)硒的吸收率更高，能顯著降低無機(jī)硒的利用率[10-11]。反之，硒也會(huì)影響反芻獸新月單胞菌等瘤胃微生物的生長(zhǎng)繁殖[12-13]。

羥基硒代蛋氨酸(HMSeBA)是一種新型的有機(jī)硒源，屬于硒硫氨酸的羥基類似物，被吸收后代謝為硒甲硫氨酸，2013年歐盟委員會(huì)宣布它可以作為硒源補(bǔ)充劑添加到動(dòng)物飼糧中[14]，其作用已經(jīng)在豬[15]和雞[16]上得到了證實(shí)，但在奶牛上的研究甚少。本項(xiàng)目組已有的研究表明，硒源可以顯著增加奶牛血硒、乳硒含量及乳硒/血硒，且添加HMSeBA上述指標(biāo)顯著高于添加亞硒酸鈉(SS)，分別比后者高239.09%、31.02%和43.75%，但平均日采食量、產(chǎn)奶量及乳成分無顯著差異。為了更好地綜合評(píng)估不同硒源在奶牛生產(chǎn)中的應(yīng)用，鑒于其對(duì)奶牛瘤胃影響的研究鮮見報(bào)道，作用效果尚需實(shí)證，本試驗(yàn)旨在研究HMSeBA作為一種新型有機(jī)硒源與SS對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)及微生物區(qū)系的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取48頭泌乳中期的健康荷斯坦奶牛[泌乳日齡為(179±22)日齡，日產(chǎn)奶量為(34.00±3.87) kg/d，胎次為(3.38±1.28)胎]，隨機(jī)分為3組，即對(duì)照組、SS組及HMSeBA組，每組16頭。預(yù)試期2周，正試期9周。

1.2 試驗(yàn)飼糧

試驗(yàn)過程中，每天投料2次，保證奶牛自由采食、飲水，早、中、晚擠奶。參照《奶牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 34—2004)配制飼糧，所用預(yù)混料為無外源添加硒預(yù)混料。對(duì)照組飼糧不額外添加硒源，另外2組在對(duì)照組飼糧基礎(chǔ)上額外添加SS(分析純化學(xué)試劑，純度≥99.5%)或HMSeBA(含硒量為2%)，添加量均為15 mg/(d·頭)，實(shí)際測(cè)得的3組飼糧硒含量分別為0.096、0.500和0.500 mg/kg DM。對(duì)照組飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 對(duì)照組飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the diet for control group (DM basis) %

1.3 樣品采集與測(cè)定

1.3.1 樣品采集

在試驗(yàn)結(jié)束前最后1 d晨飼后4 h，每組選取6頭體況良好的奶牛，使用口腔插管采集瘤胃液，并經(jīng)4層紗布過濾。采集好瘤胃液后，測(cè)定pH，一部分置于2 mL凍存管中，保存在液氮中，測(cè)定瘤胃微生物區(qū)系；一部分置于50 mL離心管中，保存在-20 ℃冰箱中，測(cè)定氨態(tài)氮和揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度。

1.3.2 樣品測(cè)定

1.3.2.1 瘤胃發(fā)酵參數(shù)測(cè)定

瘤胃液pH采用UB-7 pH計(jì)測(cè)定；瘤胃液VFA濃度采用TP-2060型氣相色譜儀測(cè)定，方法為Erwin等[17]的氣相色譜分析法；瘤胃液氨態(tài)氮濃度采用UV-1601型紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定，方法為Broderick等[18]的靛酚藍(lán)-分光光度法。

1.3.2.2 瘤胃微生物多樣性測(cè)定

DNA提取和檢測(cè)：按照天根(北京)DNA提取試劑盒的步驟說明進(jìn)行提取，使用NanoDrop2000(Thermo Scientific,美國(guó))對(duì)DNA的濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)。

擴(kuò)增及測(cè)序：使用含barcode的特異引物擴(kuò)增16S rDNA的V3～V4可變區(qū)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收，用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)檢測(cè)定量。將純化的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行等量混合，連接測(cè)序接頭，構(gòu)建Miseq測(cè)序文庫。通過Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。

用FLASH軟件對(duì)reads進(jìn)行拼接，通過Uparse軟件將相似性≥97%的序列聚類到同一操作分類單元(OTU)并進(jìn)行注釋，使用QIME軟件計(jì)算微生物群落α多樣性，使用R軟件(vision 3.2.2)計(jì)算樣品間UniFrac距離，分析微生物群落β多樣性。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過SAS 9.2軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并進(jìn)行Duncan氏多重比較，計(jì)算均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)和P值。P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 瘤胃發(fā)酵參數(shù)

由表2可知，瘤胃液pH、氨態(tài)氮濃度、各VFA的比例、乙酸/丙酸、總VFA濃度均不受硒源的影響(P>0.05)，且3組奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)均在正常范圍內(nèi)。

表2 硒源對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響Table 2 Effects of selenium sources on rumen fermentation parameters of dairy cows

2.2 瘤胃微生物區(qū)系

2.2.1 瘤胃微生物多樣性

由表3可知，3組樣品文庫覆蓋率均在0.99以上，可見每個(gè)樣品測(cè)序量合理，能夠很好地反映瘤胃微生物群落種類和結(jié)構(gòu)多樣性；反映豐富度實(shí)際觀測(cè)值的Sobs指數(shù)和反映譜系多樣性的PD whole tree指數(shù)在HMSeBA組顯著高于對(duì)照組和SS組(P<0.05)，但另外2組間無顯著差異(P>0.05)；3組間反映群落均勻度的Pielou指數(shù)無顯著差異(P>0.05)，各組間存在相似的群落均勻度。HMSeBA組豐富度Chao1指數(shù)顯著高于對(duì)照組和SS組(P<0.05)，但另外2組間無顯著差異(P>0.05)；硒源對(duì)Shannon指數(shù)無顯著影響(P>0.05)，各組間存在相似的均一性。

表3 硒源對(duì)奶牛瘤胃微生物多樣性指數(shù)的影響Table 3 Effects of selenium sources on diversity indexes of rumen microorganisms of dairy cows

2.2.2 瘤胃中細(xì)菌群落相似性

采用基于Unweighted UniFrac距離的偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)對(duì)對(duì)照組、SS組和HMSeBA組奶牛瘤胃中細(xì)菌群落差異進(jìn)行研究。由圖1可知，第1主成分貢獻(xiàn)率是10.00%，第2主成分貢獻(xiàn)率是12.26%，對(duì)照組、SS組和HMSeBA組奶牛的瘤胃液樣品可以明顯區(qū)分并聚成3個(gè)類群，說明瘤胃液樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯。

圖1 各組瘤胃液樣品偏最小二乘法判別分析Fig.1 PLS-DA of rumen fluid samples in each group

2.2.3 瘤胃中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在門和屬水平上的變化

在3組奶牛的瘤胃微生物中鑒定出了18個(gè)門，其中13個(gè)門為全部樣本所共有。在門水平上，相對(duì)豐度占比大于1%的菌門為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、糖化菌門(Saccharibacteria)和變形菌門(Proteobacteria)，平均相對(duì)豐度分別為(55.46±9.15)%、(38.79±9.08)%、(1.41±0.42)%和(1.12±1.05)%。由表4可知，硒源對(duì)各組優(yōu)勢(shì)菌門相對(duì)豐度均無顯著影響(P>0.05)。

表4 硒源對(duì)奶牛瘤胃門水平微生物相對(duì)豐度的影響Table 4 Effects of selenium sources on relative abundance of rumen microorganisms at phylum level of dairy cows %

在3組奶牛的瘤胃微生物中鑒定出了227個(gè)屬，其中117個(gè)屬在所有樣品中存在。高相對(duì)豐度的菌屬有普雷沃氏菌屬_1(Prevotella_1)(19.24±7.95)%、解琥珀酸菌屬(Succiniclasticum)(12.55±5.43)%、未分類擬桿菌門_S24-7菌群(norank_ f_Bacteroidales_S24-7_group)(5.76±3.67)%、瘤胃球菌科NK4A214群(Ruminococcaceae_NK4A214_group)(5.62±2.15)%、克里斯滕森菌科R-7群(Christensenellaceae_R-7_group)(3.09±1.14)%、毛螺菌科NK3A20群(Lachnospiraceae_NK3A20_group)(3.06±1.22)%、瘤胃球菌科UCG-014(Ruminococcaceae_UCG-014)(2.89±1.42)%、未分類擬桿菌門S11腸道群(norank_f_Bacteroidales_BS11_ gut_group)(2.70±1.88)%、普雷沃氏菌屬_7(Prevotella_7)(2.62±4.57)%、瘤胃球菌屬_2(Ruminococcus_2)(2.39±1.67)%、理研菌科RC9腸道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)(2.17±1.29)%、瘤胃球菌屬_1(Ruminococcus_1)(1.83±0.87)%、丁酸弧菌屬_2(Butyrivibrio_2)(1.62±1.14)%、普雷沃氏菌科UCG-001(Prevotellaceae_UCG-001)(1.47±0.62)%、候選糖化假絲酵母菌屬(Candidatus_Saccharimonas)(1.41±0.42)%、瘤胃球菌科UCG-005(Ruminococcaceae_UCG-005)(1.36±0.68)%、產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌群([Eubacterium]_coprostanoligenes_group)(1.14±0.39%)、反芻動(dòng)物真桿菌群([Eubacterium]_ruminantium_group)(1.13±0.59)%和普雷沃氏菌科UCG-003(Prevotellaceae_UCG-003)(1.05±0.62)%。由表5可知，3組的優(yōu)勢(shì)菌屬均為Prevotella_1和Succiniclasticum，但其相對(duì)豐度3組間差異不顯著(P>0.05)。

表5 硒源對(duì)奶牛瘤胃優(yōu)勢(shì)菌屬相對(duì)豐度的影響Table 5 Effects of selenium sources on relative abundance of rumen dominant bacteria of dairy cows %

表6比較了不同硒源之間的瘤胃屬水平差異細(xì)菌。3組的顯著差異性細(xì)菌有6種(至少存在于1個(gè)樣品中的占總序列0.05%相對(duì)豐度的微生物)。其中，HMSeBA組Ruminococcaceae_NK4A214_group、Ruminococcaceae_UCG-004和Blautia相對(duì)豐度顯著高于另外2組(P<0.05)，HMSeBA組毛螺菌科NK4A136群(Lachnospiraceae_NK4A136_group)相對(duì)豐度顯著低于另外2組(P<0.05)，但對(duì)照組和SS組無顯著差異(P>0.05)；SS組和HMSeBA組毛形桿菌屬(Lachnobacterium)相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但2組間無顯著差異(P>0.05)；對(duì)照組和HMSeBA組月形單胞菌屬(Selenomonas)相對(duì)豐度顯著低于SS組(P<0.05)，但2組間無顯著差異(P>0.05)。

表6 硒源對(duì)奶牛瘤胃屬水平微生物相對(duì)豐度的影響Table 6 Effects of selenium sources on relative abundance of rumen microorganisms at genera level of dairy cows %

3 討 論

3.1 硒源對(duì)瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

瘤胃液pH、氨態(tài)氮、VFA等能夠反映瘤胃發(fā)酵的情況。瘤胃液pH的正常值范圍是5.5～7.5，當(dāng)數(shù)值小于6.2時(shí)，會(huì)抑制纖維分解菌的活動(dòng)[19]。本研究中，對(duì)照組、SS組和HMSeBA組瘤胃液pH分別為6.49、6.38和6.30，說明本試驗(yàn)條件下3組奶牛瘤胃液pH均適宜于瘤胃微生物的活動(dòng)。VFA是飼糧中碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生的終物質(zhì)[20]，對(duì)于有機(jī)硒源對(duì)VFA的影響，學(xué)者得到了不同的結(jié)論。Wang等[21]、Shi等[22]認(rèn)為飼糧中添加酵母硒或納米硒可顯著增加丙酸濃度，且顯著降低乙酸/丙酸。同時(shí)，Wei等[23]的研究表明，飼糧中添加HMSeBA可以顯著增加丙酸、丁酸及總VFA濃度，顯著降低乙酸/丙酸，且隨著添加量的增加，丙酸、丁酸及總VFA濃度線性增加，乙酸/丙酸線性降低。Serra等[24]研究表明，乙酸、丙酸、總VFA濃度及乙酸/丙酸都略有降低。但Erasmus等[25]、倪麗麗[26]并未發(fā)現(xiàn)硒源對(duì)VFA濃度有顯著影響，這與本試驗(yàn)的結(jié)果相似。本試驗(yàn)中，3組飼糧奶牛的VFA比例及乙酸/丙酸無顯著差異，說明在本試驗(yàn)條件下，硒源沒有顯著影響瘤胃的發(fā)酵模式，試驗(yàn)結(jié)果的不同可能與硒的添加量、奶牛泌乳期等的不同有關(guān)。氨態(tài)氮可為瘤胃微生物蛋白質(zhì)合成提供氮源，瘤胃微生物對(duì)飼糧蛋白質(zhì)的利用率隨微生物活性的增加而增加[27]。本試驗(yàn)中，3組飼糧奶牛瘤胃液中氨態(tài)氮的濃度沒有顯著差異，且均在正常值范圍內(nèi)，間接證明了3個(gè)處理未對(duì)瘤胃微生物菌群活躍度產(chǎn)生不良影響。

3.2 硒源對(duì)瘤胃微生物群落的影響

本試驗(yàn)中，3組飼糧對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)影響不顯著，但是在瘤胃細(xì)菌群落組成上觀察到了差異。Chao1指數(shù)、Sobs指數(shù)及PD whole tree指數(shù)變化趨勢(shì)相近，其中，Chao1指數(shù)代表微生物群落的相對(duì)豐度，數(shù)值越大代表相對(duì)豐度越高；Sobs指數(shù)代表觀測(cè)的OTU數(shù)目；PD whole tree指數(shù)代表譜系多樣性[28]。本試驗(yàn)中，HMSeBA組3個(gè)指數(shù)均顯著高于對(duì)照組和SS組，說明HMSeBA組奶牛的瘤胃具有較高的物種豐富度。Pielou指數(shù)代表群落的均勻度，本試驗(yàn)未觀察到顯著差異。Shannon指數(shù)綜合反映了群落的豐富度和均勻度，數(shù)值越大樣本均一性越好[29]。該指數(shù)在本試驗(yàn)中未觀察到顯著差異，說明3組存在相似的均一性。

在門水平上的分析結(jié)果顯示，3組奶牛瘤胃液中的主要細(xì)菌菌門為Firmicutes和Bacteroidetes，兩者占比超過93%，與前人研究結(jié)果[30-31]一致。本試驗(yàn)中，3個(gè)處理對(duì)奶牛瘤胃液中2種主要菌門相對(duì)豐度無顯著影響。在屬水平上，占比排名前2位的細(xì)菌菌屬為Prevotella_1和Succiniclasticum，兩者占比超過29%，與前人研究結(jié)果[32-33]一致。本試驗(yàn)中，3個(gè)處理對(duì)奶牛瘤胃液中2種主要菌屬相對(duì)豐度無顯著影響。

差異分析顯示，在屬水平上，HMSeBA組Ruminococcaceae_UCG-004、Ruminococcaceae_NK4A214_group和Blautia相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組和SS組，Lachnospiraceae_NK4A136_group相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組和SS組。SS組和HMSeBA組Lachnobacterium相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組，對(duì)照組和HMSeBA組Selenomonas相對(duì)豐度顯著低于SS組。Ruminococcaceae_NK4A214_group、Ruminococcaceae_UCG-004都是瘤胃球菌科的潛在有益菌，屬于纖維降解菌，在瘤胃內(nèi)參與纖維降解，產(chǎn)物為纖維酶降解纖維二糖等纖維類物質(zhì)[34-35]，其相對(duì)豐度的增加可以顯著提高飼糧中性洗滌纖維(NDF)的消化率[36-37]。有學(xué)者證明，HMSeBA有助于增加NDF的表觀消化率[38]。同時(shí)，也有研究證實(shí)Ruminococcaceae具有免疫調(diào)節(jié)和平衡內(nèi)環(huán)境的作用[39-40]。本試驗(yàn)中，HMSeBA組Ruminococcaceae_NK4A214_group、Ruminococcaceae_UCG-004相對(duì)豐度均顯著高于其他2組，這可以作為HMSeBA提高NDF消化率的原因之一，也推測(cè)HMSeBA具有更好地提高奶牛免疫力和平衡瘤胃內(nèi)環(huán)境的作用。Blautia屬于纖維降解菌，是一種以生產(chǎn)短鏈脂肪酸為目標(biāo)的微生物[41]，研究表明其具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能[42-43]，Lachnospiraceae_NK4A136_group在臨床上作為免疫[44]、結(jié)腸炎[45]鑒定的標(biāo)志微生物，其豐度越高表示免疫力或抗病性越低。本試驗(yàn)中，HMSeBA組Blautia相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組和SS組，而Lachnospiraceae_NK4A136_group相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組和SS組，因而可以推測(cè)HMSeBA對(duì)提高奶牛免疫力或抗病性的作用更明顯。Lachnobacterium是厚壁菌門的有益菌，主要發(fā)酵葡萄糖，發(fā)酵產(chǎn)物為乳酸，還有極少量的乙酸和丁酸[46]。本試驗(yàn)中，雖然表現(xiàn)出了明顯差異，但因其含量低，可能沒有對(duì)奶牛機(jī)體產(chǎn)生較大影響。瘤胃微生物具有濃縮飼糧硒的能力，至少15個(gè)屬的微生物參與了硒的轉(zhuǎn)化和有機(jī)硒的形成[47-48]。Hudman等[12]、Koening等[49]的研究發(fā)現(xiàn)，Selenomonas能夠?qū)⑽铣珊被幔被岜缓铣傻骄w蛋白中，同時(shí)它能將少部分的氧化型硒還原成元素硒，且SS能顯著促進(jìn)Selenomonas的生長(zhǎng)。這與本試驗(yàn)結(jié)果相似，即對(duì)照組和HMSeBA組Selenomonas相對(duì)豐度顯著低于SS組，這似乎可以為SS降低硒的生物學(xué)利用率提供一定程度的依據(jù)。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下，與無外源添加硒相比，添加SS或HMSeBA未對(duì)泌乳中期荷斯坦奶牛瘤胃發(fā)酵類型產(chǎn)生顯著影響，且對(duì)瘤胃主要優(yōu)勢(shì)菌門和優(yōu)勢(shì)菌屬相對(duì)豐度無顯著影響。但添加HMSeBA可以顯著提高物種豐富度，且在屬水平上檢測(cè)到4種具有顯著差異的功能性細(xì)菌Ruminococcaceae_NK4A214_group、Ruminococcaceae_UCG-004、Blautia、Lachnospiraceae_NK4A136_group。