MCC950通過(guò)抑制核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3炎癥小體改善高蛋白質(zhì)飲食雛鵝生長(zhǎng)性能、尿酸代謝和腎臟損傷

朱道仙 劉 莉* 王璟琨 郝福星 吳 植 盧勁曄

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，泰州 225300；2.江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰州 225300；3.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院寵物科技學(xué)院，泰州 225300)

痛風(fēng)是哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類的一種常見(jiàn)代謝病，是一種主要由于高尿酸血癥導(dǎo)致尿酸鹽結(jié)晶在關(guān)節(jié)、軟骨及其他組織中異位沉積引起的炎性疾病[1]。雛鵝對(duì)痛風(fēng)具有易感性，發(fā)病率為10%～50%，死亡率高達(dá)50%，這嚴(yán)重危害養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展[2-5]。大量研究表明，痛風(fēng)雛鵝發(fā)生的腎臟損傷及其導(dǎo)致的腎功能受損甚至衰竭，是雛鵝死亡的主要原因之一[6-8]。深入研究腎臟損傷的分子機(jī)制，尋找潛在靶點(diǎn)，對(duì)雛鵝痛風(fēng)的防治具有重要意義。

核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3(NLRP3)/半胱氨酸天冬氨酸酶-1(Caspase-1)信號(hào)通路是一種重要的炎癥信號(hào)通路，可誘導(dǎo)下游產(chǎn)物白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和白細(xì)胞介素-18(interleukin-18，IL-18)的產(chǎn)生與釋放，促進(jìn)腎臟炎癥反應(yīng)[9-11]。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)參與高蛋白質(zhì)飼糧誘導(dǎo)雛鵝痛風(fēng)的腎臟損傷[12]。然而，這種炎癥反應(yīng)是否與NLRP3/Caspase-1信號(hào)通路相關(guān)尚不清晰。因此，本研究在飼喂雛鵝高蛋白質(zhì)飼糧基礎(chǔ)上，給予NLRP3特異性抑制劑MCC950進(jìn)行干預(yù)，觀察雛鵝生長(zhǎng)性能、尿酸代謝及腎臟損傷的變化，探討NLRP3/Caspase-1信號(hào)通路在雛鵝痛風(fēng)中的作用，為將來(lái)生產(chǎn)中以NLRP3為靶點(diǎn)的防控雛鵝痛風(fēng)新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和飼養(yǎng)管理

選取1日齡揚(yáng)州雛鵝120只，隨機(jī)分為3個(gè)組，分別為對(duì)照組(CON組)、高蛋白質(zhì)組(HP組)和高蛋白質(zhì)+MCC950組(HP+MCC950組)，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8只。對(duì)照組飼喂粗蛋白質(zhì)為16.5%的正常蛋白質(zhì)飼糧，HP組和HP+MCC950組均飼喂粗蛋白質(zhì)為24.0%的高蛋白質(zhì)飼糧，且HP+MCC950組參考廖勇等[13]的方法按10 mg/kg BW劑量腹腔注射MCC950(一種高效的NLRP3抑制劑，購(gòu)于美國(guó)Abmole公司)，每3 d注射1次，其他2組注射等量生理鹽水。試驗(yàn)采取雙層籠養(yǎng)，試驗(yàn)鵝自由采食與飲水，按正常免疫程序免疫，試驗(yàn)期為15 d。試驗(yàn)飼糧參考NRC(1994)[14]建議的鵝營(yíng)養(yǎng)需要量標(biāo)準(zhǔn)配制，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) %

1.2 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.2.1 生長(zhǎng)性能

分別于5、10和15日齡時(shí)，以重復(fù)為單位對(duì)試驗(yàn)雛鵝進(jìn)行空腹稱重，計(jì)算平均體重，同時(shí)記錄采食量，計(jì)算平均日采食量。

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取3只接近平均體重的雛鵝，頸靜脈采血后分離血清并置于4 ℃冰箱中保存，次日檢測(cè)。血清尿酸(uric acid，UA)含量采用酶比色法測(cè)定，血清肌酐(creatinine，Cr)含量采用改良苦味酸法測(cè)定，血清尿素氮(urea nitrogen，UN)含量采用脲酶-谷氨酸脫氫酶法測(cè)定。

1.2.3 血清炎癥因子含量

參考1.2.3方法采血制備血清。按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒操作說(shuō)明，檢測(cè)血清C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、IL-1β、IL-18、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)含量，試劑盒均購(gòu)于Abcam公司。

1.2.4 腎臟組織樣本采集

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每組每個(gè)重復(fù)選取1只雛鵝，頸靜脈放血致死后，取新鮮腎臟組織若干塊，一部分放入4%多聚甲醛溶液中固定用于蘇木精-伊紅(HE)染色，另一部分放入無(wú)水乙醇溶液中用于尿酸鹽染色，余下部分裝入凍存管置于液氮中用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot檢測(cè)。

1.2.5 RT-qPCR檢測(cè)

采用TRIzol法提取總RNA，定量后使用UEIris RT mix with DNase(All-in-One)試劑盒在37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s條件下逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后用QuickKing one step RT-qPCR kit(probe)試劑盒按如下條件進(jìn)行擴(kuò)增：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)35次。以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因，目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。目的基因NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表2。

表2 RT-qPCR引物序列Table 2 Primer sequences for RT-qPCR

1.2.6 Western blot檢測(cè)

信息技術(shù)的發(fā)展和互聯(lián)網(wǎng)的應(yīng)用與普及，正在深刻影響和潛移默化地改變著每個(gè)人的生活和觀念，互聯(lián)網(wǎng)為人們構(gòu)筑起了一種全新的生活和生存方式。據(jù)中國(guó)互聯(lián)網(wǎng)絡(luò)信息中心(CNNIC)發(fā)布的報(bào)告顯示，截至2011年底，中國(guó)網(wǎng)民規(guī)模已突破5億，其中青少年已占據(jù)了半數(shù)。正如中國(guó)青年網(wǎng)執(zhí)行總編藺紅玉說(shuō)：“如今的互聯(lián)網(wǎng)，已經(jīng)成了青少年的器官，成為他們生命中不可或缺的一部分……”

將100 mg腎臟組織在4 ℃的放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)裂解緩沖液中裂解20 min后，在12 000 r/min下離心15 min，收集上清液，并使用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒進(jìn)行蛋白定量。然后取50 μg蛋白用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠將蛋白樣品進(jìn)行電泳分離，再轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，分別加入兔抗NLRP3(1∶1 000)、Caspase-1(1∶1 000)、IL-1β(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)抗體在4 ℃搖床中孵育過(guò)夜。次日，加入山羊抗家兔免疫球蛋白G(IgG)抗體(1∶5 000)室溫下孵育1 h后在化學(xué)發(fā)光成像儀中顯影成像。利用Image J軟件(1.45)通過(guò)光密度測(cè)定法對(duì)蛋白含量進(jìn)行量化，以GAPDH作為內(nèi)部對(duì)照將其標(biāo)準(zhǔn)化。所用抗體均購(gòu)于賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

1.2.7 腎臟病理組織學(xué)檢測(cè)

HE染色如下：樣本從4%多聚甲醛溶液中取出，脫水，包埋在石蠟中，HE染色，并用中性膠密封，然后在顯微鏡下觀察圖像并拍照。參考馮學(xué)軒等[15]的方法，采用Gomori六胺銀法對(duì)腎臟中尿酸鹽進(jìn)行染色，主要步驟為：從無(wú)水乙醇溶液取出腎臟組織樣本，常規(guī)石蠟包埋后制成厚度為5 μm切片，然后浸入Gomori六胺銀溶液(60 ℃)30 min，沖洗，浸入氯化金溶液1 min，沖洗，再浸入海波溶液5 min，沖洗，伊紅染色液淡染30 s，沖洗后常規(guī)脫水透明，中性樹(shù)膠封固。在普通顯微鏡下觀察圖像(尿酸鹽呈黑色)，用Image J軟件(1.45)計(jì)算尿酸鹽沉著面積。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間數(shù)據(jù)差異采用SPSS 23.0中的t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，采用Pearson相關(guān)分析腎臟組織中尿酸鹽沉積面積與NLRP3蛋白相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 雛鵝生長(zhǎng)性能

由表3可知，隨著日齡的增長(zhǎng)，對(duì)照組、HP組和HP+MCC950組雛鵝的平均日采食量均呈上升趨勢(shì)，3組同日齡時(shí)的平均日采食量之間均無(wú)顯著差異(P>0.05)。15日齡時(shí)，HP組雛鵝的平均體重顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；10和15日齡時(shí)，HP+MCC950組雛鵝的平均體重均顯著高于HP組(P<0.05)。

表3 雛鵝生長(zhǎng)性能Table 3 Growth performance of goslings g

2.2 雛鵝血清生化指標(biāo)

如圖1-A所示，HP組雛鵝血清UA含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，HP+MCC950組血清UA含量顯著低于HP組(P<0.05)。以人的高尿酸血癥臨界值420 μmol/L為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算雛鵝的高尿酸血癥發(fā)病率(圖1-B)，可以看出HP組高尿酸血癥發(fā)病率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，HP+MCC950組高尿酸血癥發(fā)病率顯著低于HP組(P<0.05)。如圖1-C、圖1-D所示，HP組雛鵝血清Cr和UN含量顯著高于HP組(P<0.05)，HP+MCC950組血清Cr和UN含量顯著低于HP組(P<0.05)。

2.3 雛鵝血清炎癥因子含量

由表4可知，HP組雛鵝血清CRP、IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α和TGF-β1含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，HP+MCC950組血清CRP、IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α和TGF-β1含量均顯著低于HP組(P<0.05)。

表4 雛鵝血清炎癥因子含量Table 4 Serum inflammatory factor contents of goslings

2.4 雛鵝腎臟中NLRP3/Caspase-1信號(hào)通路相關(guān)分子mRNA相對(duì)表達(dá)量

由表5可知，HP組雛鵝腎臟中NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，分別約為對(duì)照組的2.1、2.6、3.6和3.7倍；HP+MCC950組腎臟中NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于HP組(P<0.05)。

表5 雛鵝腎臟中NLRP3/Caspase-1信號(hào)通路相關(guān)分子mRNA相對(duì)表達(dá)量Table 5 mRNA relative expression levels of NLRP3/Caspase-1 signaling pathway related molecules in kidney of goslings

2.5 雛鵝腎臟中NLRP3/Caspase-1信號(hào)通路相關(guān)分子蛋白相對(duì)表達(dá)量

如圖2所示，HP組雛鵝腎臟組織中NLRP3、Caspase-1及IL-1β的蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，HP+MCC950組腎臟組織中NLRP3、Caspase-1及IL-1β的蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于HP組(P<0.05)。

*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，Δ表示與高蛋白質(zhì)組相比差異顯著(P<0.05)。下圖同。* mean significant difference compared with the CON group (P<0.05),and Δ mean significant difference compared with the HP group (P<0.05).The same as below.圖1 雛鵝血清生化指標(biāo)Fig.1 Serum biochemical indices of goslings

圖2 雛鵝腎臟中NLRP3/Caspase-1信號(hào)通路相關(guān)分子蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Protein relative expression levels of NLRP3/Caspase-1 signaling pathway related molecules in kidney of goslings

2.6 雛鵝腎臟組織病理?yè)p傷

HE染色結(jié)果表明，對(duì)照組雛鵝腎臟組織結(jié)構(gòu)正常，腎小管清晰(圖3-A-a)；HP組腎小管擴(kuò)張，發(fā)生空泡變性、壞死(圖3-A-b)；HP+MCC950組腎組織有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管結(jié)構(gòu)較為清晰(圖3-A-c)。尿酸鹽染色結(jié)果表明，對(duì)照組雛鵝腎臟組織中幾乎無(wú)尿酸鹽沉積(圖3-A-d)，HP組尿酸鹽沉積較多(圖3-A-e)，HP+MCC950組有少量尿酸鹽沉積(圖3-A-f)。如圖3-B所示，HP組雛鵝腎臟組織尿酸鹽沉積面積顯著大于對(duì)照組(P<0.05)，HP+MCC950組腎臟組織尿酸鹽沉積面積顯著小于HP組(P<0.05)。Pearson相關(guān)分析表明，腎臟組織尿酸鹽沉積面積與NLRP3蛋白相對(duì)表達(dá)量呈顯著正相關(guān)(r=0.681，P<0.05)。

圖3 雛鵝腎臟組織病理?yè)p傷Fig.3 Pathological injury in kidney tissues of goslings

3 討 論

高尿酸血癥是一種主要由尿酸合成增多或尿酸排泄障礙引起血液中尿酸含量高于正常值的代謝性疾病[16]。高蛋白質(zhì)飲食能代謝產(chǎn)生大量嘌呤核苷酸，會(huì)增強(qiáng)嘌呤分解代謝，增加尿酸生成，導(dǎo)致高尿酸血癥的發(fā)生[17]。禽類肝臟中缺乏精氨酸酶，無(wú)法將蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物氨合成尿素，只能通過(guò)嘌呤核苷酸代謝途徑轉(zhuǎn)化為尿酸，因此高蛋白質(zhì)飲食更容易增加禽類尿酸的生成，引起高尿酸血癥[18]。在本研究中，HP組雛鵝血清尿酸含量顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明高蛋白質(zhì)飲食成功誘發(fā)雛鵝高尿酸血癥，這與相關(guān)報(bào)道結(jié)果[19-21]一致。尿酸在血液中常以陰離子形式存在，飽和度較低，過(guò)量尿酸陰離子易析出，與組織中鈣離子或鈉離子等陽(yáng)離子形成結(jié)晶并沉著在組織中，引發(fā)痛風(fēng)。研究表明，腎臟損傷是雛鵝痛風(fēng)最突出的器官病變[22]，而且這種腎臟損傷不易康復(fù)，可導(dǎo)致雛鵝生長(zhǎng)受阻，甚至死亡。本研究結(jié)果顯示，高蛋白質(zhì)飲食雛鵝腎小管擴(kuò)張，發(fā)生空泡變性、壞死，且腎臟中尿酸鹽沉積面積顯著增大，這與李曼曼等[12]對(duì)痛風(fēng)雛鵝的腎臟組織學(xué)檢查結(jié)果相一致。

NLRP3/Caspase-1信號(hào)通路主要通過(guò)激活NLRP3炎癥小體后激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，清除有害刺激，在機(jī)體的固有免疫中起著關(guān)鍵性作用[23]。但持續(xù)過(guò)度激活可導(dǎo)致多種代謝性疾病(如痛風(fēng)及腎衰竭)的發(fā)生發(fā)展[24-25]。研究表明，尿酸鹽晶體通過(guò)模式識(shí)別受體激活NLRP3炎癥小體，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和組織損傷。Yin等[26]研究發(fā)現(xiàn)，尿酸可激活NLRP3炎癥小體分泌相關(guān)炎癥因子，進(jìn)而影響腎臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和功能。Hutto等[27]研究表明，NLRP3炎癥小體活化加劇了腎臟的炎癥和纖維化。在本研究中，高蛋白質(zhì)飲食雛鵝血清中IL-1β和IL-18等炎癥因子含量升高，腎臟組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的mRNA相對(duì)表達(dá)量以及NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白相對(duì)表達(dá)量均上升，腎小管上皮細(xì)胞變性，有大量炎性浸潤(rùn)，而且腎臟組織中尿酸鹽沉積面積與NLRP3蛋白相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)。

MCC950是一種高效的NLRP3抑制劑，可抑制NLRP3/Caspase-1信號(hào)通路傳導(dǎo)[28]。郭亞凈等[29]研究發(fā)現(xiàn)，MCC950可以通過(guò)抑制NLRP3炎性小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞焦亡改善腦出血后的神經(jīng)損傷。另一項(xiàng)試驗(yàn)研究結(jié)果表明，MCC950能夠顯著抑制高糖環(huán)境中HK-2腎小管上皮細(xì)胞尿酸介導(dǎo)的NLRP3炎性小體系統(tǒng)效應(yīng)分子釋放[30]。在本研究中，與HP組比較，高蛋白質(zhì)飲食雛鵝給予MCC950后，腎臟組織中NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，腎臟組織結(jié)構(gòu)及腎功能得到改善，血清IL-1β和IL-18等炎癥因子以及尿酸含量降低。上述結(jié)果表明，抑制NLRP3可改善雛鵝的炎癥反應(yīng)和腎臟損傷，暗示NLRP3/Caspase-1信號(hào)通路通過(guò)促炎反應(yīng)引起的腎臟損傷，參與高蛋白質(zhì)飼糧誘導(dǎo)的雛鵝高尿酸血癥及痛風(fēng)過(guò)程。然而，MCC950成本高，給藥方式特殊，很難生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用。下一步將以NLRP3靶點(diǎn)，從來(lái)源廣、成本低的中草藥中篩選出對(duì)NLRP3有抑制作用的藥物，研究其對(duì)雛鵝痛風(fēng)的保護(hù)作用，以便在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

4 結(jié) 論

NLRP3抑制劑MCC950可以通過(guò)抑制NLRP3/Caspase-1信號(hào)通路減輕高蛋白質(zhì)飲食雛鵝的炎癥反應(yīng)，改善腎臟損傷，從而降低血清尿酸含量，提高生長(zhǎng)性能。