竹葉黃酮與包膜丁酸鈉對(duì)仙居雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)和脂質(zhì)代謝的影響

張 碩 李瑞萍 葉 軒 田 勇 李國(guó)勤 陳 黎 曾 濤 許文武 顧天天 沈軍達(dá) 陶爭(zhēng)榮 趙阿勇 盧立志*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，杭州 311300；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州 310021；3.浙江省仙居種雞場(chǎng)，臺(tái)州 311719)

植物黃酮類化合物和有機(jī)酸是目前在大量“替抗”研究中被證明效果較好的2類添加劑，具有很大的開發(fā)潛力。竹葉黃酮(bamboo leaf flavonoids，BLF)作為竹葉中主要的功能活性成分，具有抗氧化、抗應(yīng)激、抑菌、降血脂等作用[1]。張錦玥等[2]研究表明，BLF能夠解除環(huán)磷酰胺造成的免疫抑制，提高肉雞血清中禽流感和新城疫抗體水平。呂錦芳等[3]報(bào)道，飼糧中添加500 mg/kg BLF能夠極顯著提高羅曼蛋雞產(chǎn)蛋率。包膜丁酸鈉(coated sodium butyrate，CSB)是將丁酸鈉微粒用類脂包膜，使其在動(dòng)物腸道后段溶解緩釋，被腸黏膜上皮細(xì)胞充分利用。周磊等[4]報(bào)道，飼糧中添加500 mg/kg CSB能夠提高羅曼蛋種雞產(chǎn)蛋率和種蛋合格率，延長(zhǎng)產(chǎn)蛋高峰期。韓乾杰等[5]研究指出，丁酸鈉的抑菌效果雖然不顯著，但與植物精油復(fù)配后提高了植物精油的抑菌效果。由此推測(cè)，丁酸鈉與植物提取物復(fù)配可能有協(xié)同效應(yīng)。此外，單一飼料添加劑的作用效果往往有限，聯(lián)合應(yīng)用2種及以上飼料添加劑是養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)。

仙居雞是我國(guó)著名的地方雞種，蛋品質(zhì)好，肉質(zhì)細(xì)膩鮮美，但在產(chǎn)蛋率、料蛋比等生產(chǎn)性能方面的表現(xiàn)不如國(guó)外優(yōu)良蛋雞品種。因此，本試驗(yàn)旨在研究飼糧中單獨(dú)或聯(lián)合添加BLF、CSB對(duì)仙居雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)和脂質(zhì)代謝的影響，探討B(tài)LF與CSB在蛋雞養(yǎng)殖上復(fù)配使用的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

BLF總黃酮含量為40%，由浙江某生物科技有限公司提供。CSB中丁酸鈉含量為30%，由杭州某飼料有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選用200日齡同批次產(chǎn)蛋率接近的健康仙居雞300只，采用單因素隨機(jī)設(shè)計(jì)，隨機(jī)分為5組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15只。預(yù)試期7 d，正試期90 d。Ⅰ組(對(duì)照組)飼喂基礎(chǔ)飼糧，Ⅱ組(抗生素組)在基礎(chǔ)飼糧中添加40 mg/kg桿菌肽鋅，Ⅲ組在基礎(chǔ)飼糧中添加500 mg/kg BLF，Ⅳ組在基礎(chǔ)飼糧中添加500 mg/kg CSB，Ⅴ組(復(fù)配組)在基礎(chǔ)飼糧中添加500 mg/kg BLF+500 mg/kg CSB。玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧參照我國(guó)《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)中蛋雞營(yíng)養(yǎng)需求推薦值配制，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

續(xù)表1項(xiàng)目Items含量Content預(yù)混料Premix1)2.00合計(jì)Total100.00營(yíng)養(yǎng)水平Nutrientlevels2)代謝能ME/(MJ/kg)11.30粗蛋白質(zhì)CP17.00粗脂肪EE5.74粗纖維CF8.00鈣Ca3.80有效磷AP0.50總氨基酸TAA0.35

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在浙江省仙居種雞場(chǎng)全封閉式雞舍內(nèi)進(jìn)行，采用雙層階梯式籠養(yǎng)，每籠3只雞，連續(xù)的5籠為1個(gè)重復(fù)。全程粉料飼養(yǎng)，蛋雞自由采食和飲水。智能控制系統(tǒng)調(diào)節(jié)雞舍內(nèi)恒定光照時(shí)間為16 h/d，光照強(qiáng)度20 lx，溫度18～24 ℃，相對(duì)濕度55%～65%。試驗(yàn)期間每天人工喂料3次(06:00、12:00和17:00)，記錄飼料消耗。每天17:00揀蛋稱重并記錄，之后打掃雞舍衛(wèi)生，按照常規(guī)程序進(jìn)行雞只免疫和雞舍消毒。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 生產(chǎn)性能指標(biāo)的測(cè)定

每天以重復(fù)為單位記錄產(chǎn)蛋數(shù)和總蛋重，計(jì)算產(chǎn)蛋率和平均蛋重。每天記錄飼糧的消耗情況，計(jì)算平均日采食量。根據(jù)總采食量和總蛋重計(jì)算料蛋比。

1.4.2 蛋品質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)采集10枚外形完好、重量接近平均蛋重的雞蛋(3 h內(nèi)測(cè)完蛋品質(zhì))。采用蛋殼厚度儀(EGT-1601A，日本)、蛋殼強(qiáng)度儀(EFG-0503，日本)和蛋品質(zhì)測(cè)定儀(EMT-5200，日本)對(duì)蛋殼厚度、蛋殼強(qiáng)度、蛋白高度、蛋黃顏色和哈夫單位進(jìn)行測(cè)定。分離蛋清后，稱量蛋黃重，計(jì)算蛋黃比率：

蛋黃比率(%)=(蛋黃重/蛋重)×100。

1.4.3 血清脂質(zhì)代謝指標(biāo)的測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)挑選2只健康的蛋雞，翅靜脈采血10 mL，分離血清于-20 ℃冰箱保存，采用BS-420型全自動(dòng)生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)測(cè)定血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量。

1.4.4 肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定

采血完成后，蛋雞頸靜脈放血屠宰，在肝臟左葉尖端取約2 g組織裝入無RNA酶凍存管中，液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存待測(cè)。根據(jù)NCBI公布的過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)、脂肪酸合成酶(FAS)、羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGCR)、脂蛋白脂酶(LPL)、膽固醇7α-羥化酶(CYP7A1)以及內(nèi)參基因β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)的基因序列，由杭州杰瑞生物科技有限公司設(shè)計(jì)、合成引物并驗(yàn)證引物特異性，引物序列及參數(shù)見表2。

表2 引物序列及參數(shù)Table 2 Primer sequences and parameters

肝臟組織RNA的提取采用兩步法按說明書操作。使用SYBR qPCR Master Mix試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)進(jìn)行熒光定量PCR測(cè)定，使用Light Cycler 96 Real-Time PCR系統(tǒng)(瑞士羅氏公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火10 s，變性和退火步驟循環(huán)40次。熔解曲線采集程序?yàn)椋?5 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。反應(yīng)完成后提取全部Ct值，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan氏法進(jìn)行組間多重比較，P<0.05表示差異顯著，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(mean±SD)表示。

2 結(jié) 果

2.1 BLF與CSB對(duì)仙居雞生產(chǎn)性能的影響

由表3可知，在1～45 d、46～90 d和1～90 d，與對(duì)照組相比，Ⅳ組產(chǎn)蛋率顯著提高(P<0.05)，其余各組之間差異不顯著(P>0.05)。在1～45 d和1～90 d，各組之間平均蛋重差異不顯著(P>0.05)；在46～90 d，與對(duì)照組相比，Ⅴ組平均蛋重顯著提高(P<0.05)。在1～45 d、46～90 d和1～90 d，各組之間平均日采食量差異不顯著(P>0.05)；與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組平均日采食量均有不同程度降低。在1～45 d和46～90 d，各組之間料蛋比差異不顯著(P>0.05)；在1～90 d，與對(duì)照組相比，Ⅴ組料蛋比顯著降低(P<0.05)。

表3 BLF與CSB對(duì)仙居雞生產(chǎn)性能的影響Table 3 Effects of BLF and CSB on performance of Xianju hens

2.2 BLF與CSB對(duì)仙居雞蛋品質(zhì)的影響

由表4可知，各組之間蛋殼厚度、蛋殼強(qiáng)度和蛋黃顏色差異不顯著(P>0.05)。Ⅴ組哈夫單位顯著高于對(duì)照組和Ⅳ組(P<0.05)，與Ⅱ、Ⅲ組差異不顯著(P>0.05)。Ⅴ組蛋黃比率顯著低于對(duì)照組和Ⅱ組(P<0.05)。

表4 BLF與CSB對(duì)仙居雞蛋品質(zhì)的影響Table 4 Effects of BLF and CSB on egg quality of Xianju hens

2.3 BLF與CSB對(duì)仙居雞血清脂質(zhì)代謝指標(biāo)的影響

由表5可知，與對(duì)照組相比，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組血清TC、TG和LDL-C含量顯著降低(P<0.05)，Ⅱ組血清TC、TG含量差異不顯著(P>0.05)。各組之間血清HDL-C含量差異不顯著(P>0.05)。

表5 BLF與CSB對(duì)仙居雞血清脂質(zhì)代謝指標(biāo)的影響Table 5 Effects of BLF and CSB on serum lipid metabolism parameters of Xianju hens mmol/L

2.4 BLF與CSB對(duì)仙居雞肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖1可知，Ⅳ組肝臟PPARγ、SREBP-1cmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他各組(P<0.05)。Ⅲ組肝臟FASmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組和Ⅴ組(P<0.05)。試驗(yàn)組肝臟HMGCRmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。Ⅴ組肝臟CYP7A1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他各組(P<0.05)。Ⅳ組肝臟LPLmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和Ⅲ、Ⅴ組(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Value columns with the same small letter mean no significant difference (P>0.05),while with different small letters mean significant difference (P<0.05).圖1 BLF與CSB對(duì)仙居雞肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.1 Effects of BLF and CSB on expression of lipid metabolism related genes in liver of Xianju hens

3 討 論

3.1 BLF與CSB對(duì)仙居雞生產(chǎn)性能的影響

蛋雞生產(chǎn)過程中易遭受高密度、高溫、噪聲等應(yīng)激，使產(chǎn)蛋率和蛋品質(zhì)降低。BLF具有較好的抗氧化活性，可改善機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)，提高畜禽生產(chǎn)性能[1]。呂錦芳等[3]研究表明，飼糧中添加500 mg/kg BLF能夠極顯著提高羅曼蛋雞產(chǎn)蛋率。丁酸鈉作為酸化劑類飼料添加劑，能夠調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)腸絨毛發(fā)育，修復(fù)黏膜屏障。劉文峰等[6]報(bào)道，飼糧中添加500 mg/kg丁酸鈉和100 mg/kg丁酸梭菌能夠顯著提高狼山雞、蘆花雞、北京油雞的產(chǎn)蛋率。本研究借鑒前人經(jīng)驗(yàn)，在仙居雞飼糧中單獨(dú)或復(fù)配添加500 mg/kg BLF、CSB，結(jié)果表明，BLF與CSB單獨(dú)或復(fù)配使用都能提高產(chǎn)蛋率。1～45 d各組之間平均蛋重差異不顯著，而46～90 d復(fù)配組的平均蛋重顯著高于對(duì)照組，表明隨著試驗(yàn)進(jìn)行，復(fù)配組仙居雞飼料轉(zhuǎn)化率提高。在料蛋比方面，復(fù)配組1～90 d料蛋比降低。本試驗(yàn)結(jié)果與呂錦芳等[3]和劉文峰等[6]的報(bào)道基本一致，也顯示出BLF與CSB聯(lián)用對(duì)于提高蛋雞生產(chǎn)性能效果更好。

3.2 BLF與CSB對(duì)仙居雞蛋品質(zhì)的影響

影響蛋品質(zhì)的主要因素有品種、日齡、營(yíng)養(yǎng)、飼養(yǎng)管理等，目前已有諸多研究報(bào)道蛋雞飼糧中添加植物黃酮或丁酸鈉對(duì)蛋品質(zhì)有影響。戴宏健等[7]報(bào)道，飼糧中添加山楂葉黃酮能夠促進(jìn)產(chǎn)蛋后期種母雞對(duì)鈣、磷的吸收，增強(qiáng)殼腺的抗氧化功能，顯著提高蛋殼厚度和蛋殼強(qiáng)度。大豆黃酮可以顯著提高蛋殼厚度、蛋殼強(qiáng)度和蛋殼比率[8]。產(chǎn)蛋后期蛋雞飼糧中添加大豆黃酮能夠顯著提高蛋殼厚度，降低破蛋率[9]。有研究報(bào)道，飼糧中添加CSB可以提高蛋殼強(qiáng)度、哈夫單位和種蛋合格率[10-11]。在本試驗(yàn)中，各組之間蛋殼厚度和蛋殼強(qiáng)度無顯著差異，推測(cè)BLF可能對(duì)蛋雞鈣、磷代謝的影響較小。哈夫單位反映雞蛋的鮮度，本試驗(yàn)中，飼糧中添加BLF與CSB都能提高雞蛋哈夫單位，并且復(fù)配組哈夫單位顯著大于對(duì)照組，推測(cè)是因?yàn)轱暭Z中添加CSB與BLF改善了機(jī)體抗氧化功能，從而提高了雞蛋鮮度等級(jí)。蛋黃的主要成分是由肝臟合成的脂質(zhì)，BLF能夠抑制脂質(zhì)合成[12]。本試驗(yàn)中各試驗(yàn)組蛋黃顏色無顯著差異，但是BLF組和復(fù)配組蛋黃顏色高于其他試驗(yàn)組，表明BLF可能對(duì)蛋黃中的色素沉著或者脂質(zhì)含量有一定影響。與對(duì)照組相比，復(fù)配組蛋黃比率顯著降低，可能是因?yàn)锽LF與CSB聯(lián)用有抑制肝臟脂質(zhì)合成的協(xié)同效應(yīng)，具體原因有待深入研究。

3.3 BLF與CSB對(duì)仙居雞血清脂質(zhì)代謝指標(biāo)的影響

產(chǎn)蛋期蛋雞體內(nèi)脂質(zhì)代謝旺盛，由脂質(zhì)代謝紊亂引起的過度肥胖和肝臟脂肪變性等疾病在籠養(yǎng)蛋雞上尤為突出。黃酮類化合物可以調(diào)節(jié)蛋雞脂質(zhì)代謝，飼糧中添加山楂葉黃酮使產(chǎn)蛋后期麒麟雞血清TG和LDL-C含量顯著降低[13]。BLF能夠抑制脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)合成，降低血清TG含量[12,14]。丁酸鈉能夠影響大鼠肝臟與脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)母鼠胎盤脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)[15]。蛋雞飼糧中添加丁酸鈉不僅會(huì)影響胰腺消化酶的分泌，還降低了血清TG含量[10]。晏顯芳等[16]報(bào)道，補(bǔ)充丁酸鈉能夠降低草魚血清TC含量，抑制肝臟中脂肪積累。在本試驗(yàn)中，BLF與CSB對(duì)仙居雞血清脂質(zhì)代謝指標(biāo)的影響以降低作用為主，與上述研究報(bào)道基本一致。與對(duì)照組相比，飼糧中添加BLF與CSB使仙居雞血清TC、TG和LDL-C含量顯著降低，單獨(dú)或復(fù)配使用差異不顯著。HDL-C在家禽血清中含量比較固定，主要在肝臟合成，可將膽固醇從肝臟外組織轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟中代謝。本試驗(yàn)中，各組血清HDL-C含量差異不顯著。LDL-C主要在血管內(nèi)合成，在肝臟中被降解，本研究結(jié)果顯示，BLF與CSB單獨(dú)或復(fù)配可能會(huì)抑制血管內(nèi)LDL-C合成或者促進(jìn)肝臟中LDL-C降解。LDL-C在血管中沉積，容易導(dǎo)致血管堵塞甚至心肌梗死，這是造成肉雞猝死的一個(gè)重要原因[17]。由此可見，飼糧中添加BLF與CSB對(duì)維持機(jī)體健康有益。

3.4 BLF與CSB對(duì)仙居雞肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

肝臟是家禽脂肪酸從頭合成的主要部位，產(chǎn)蛋期蛋雞在雌激素作用下肝臟合成脂質(zhì)能力增強(qiáng)[18]。調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝對(duì)于預(yù)防蛋雞過肥，降低脂肪肝綜合征等疾病的發(fā)生具有重要意義。PPARγ是脂肪生成和脂肪組織發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子，與配體結(jié)合后才能結(jié)合到靶基因的調(diào)控區(qū)，調(diào)控靶基因的表達(dá)[19-20]。SREBP-1c能夠促進(jìn)PPARγ的配體生成，還能通過轉(zhuǎn)錄途徑調(diào)控FAS活性，影響體脂合成[21-22]。研究表明，BLF對(duì)FASmRNA表達(dá)有抑制作用，呈劑量依賴性抑制脂肪生成，具有預(yù)防肥胖的潛在功效[23]。國(guó)外一項(xiàng)研究顯示，丁酸鈉可以治療由高脂飼糧誘導(dǎo)的小鼠代謝紊亂，抑制肝臟組織脂肪變性[24]。在本試驗(yàn)中，飼糧中添加CSB顯著提高了仙居雞肝臟PPARγ、SREBP-1cmRNA相對(duì)表達(dá)量，飼糧中添加BLF顯著降低了肝臟FASmRNA相對(duì)表達(dá)量。這表明CSB可能通過促進(jìn)PPARγ、SREBP-1cmRNA表達(dá)，BLF通過抑制FASmRNA表達(dá)減少脂質(zhì)合成。

HMGCR是肝臟中催化膽固醇從頭合成的限速酶，CYP7A1在肝臟中催化膽固醇分解為膽汁酸，二者對(duì)于維持機(jī)體膽固醇代謝平衡起關(guān)鍵作用[25～27]。LPL是脂質(zhì)分解和轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的關(guān)鍵酶，在血漿中使載脂蛋白降解，在肝臟外組織中催化TG水解為甘油和游離脂肪酸[28]。本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組仙居雞肝臟HMGCRmRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著提高，CSB組LPLmRNA和復(fù)配組CYP7A1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高。這表明飼糧中添加BLF和CSB可能通過轉(zhuǎn)錄途徑調(diào)控肝臟和血漿中脂質(zhì)合成、分解和轉(zhuǎn)運(yùn)。

4 結(jié) 論

① 飼糧中添加BLF(500 mg/kg)、CSB(500 mg/kg)能夠提高仙居雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)，二者復(fù)配對(duì)于提高平均蛋重和哈夫單位，降低料蛋比和蛋黃比率的效果要優(yōu)于單獨(dú)使用。

② 飼糧中添加BLF(500 mg/kg)、CSB(500 mg/kg)能夠降低仙居雞血清TC、TG、和LDL-C含量，并能通過影響肝臟PPARγ、SREBP-1c、FAS等mRNA表達(dá)，調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝。