飼糧鈣水平對5～8周齡懷鄉(xiāng)雞生長性能、骨骼特性及鈣磷代謝的影響

何雪萍 范海丹 陳靜文 尹福泉 杜炳旺 王潤蓮

(廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，湛江 524088)

鈣作為動物體必需的常量元素，對骨骼和牙齒的形成、神經(jīng)和肌肉興奮性及多種酶的活性至關(guān)重要，飼糧鈣含量不足或鈣磷比不適容易導(dǎo)致家禽骨骼發(fā)育不良或腿部疾病，這是家禽生產(chǎn)中造成經(jīng)濟(jì)損失的主要營養(yǎng)問題之一[1]。研究懷鄉(xiāng)雞飼糧中適宜的鈣水平，對懷鄉(xiāng)雞的規(guī)范飼養(yǎng)及地方標(biāo)準(zhǔn)制定具有重要的意義。我國現(xiàn)行《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)[2]的鈣需要量主要參考NRC(1994)[3]，規(guī)定了快大型肉雞及黃羽肉雞的鈣需要量，但現(xiàn)代肉雞品種繁多，其生長潛力、飼料轉(zhuǎn)化效率、骨骼結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及肉品質(zhì)等方面和之前相比存在較大差異[4]，因此，不同肉雞品種的實(shí)際鈣需要量可能與早期制定的肉雞標(biāo)準(zhǔn)有一定出入。近年來，先后有許多研究在白羽肉雞、黃羽肉雞及愛拔益加(AA)肉雞上進(jìn)行了鈣需要量評定工作[5-16]，但更多的是針對快速生長肉雞前期階段鈣需要量的研究，就慢速型生長的地方肉雞以及肉雞中后期階段鈣需要量的研究不多，有文獻(xiàn)建議根據(jù)地方肉雞的產(chǎn)肉特點(diǎn)制定相應(yīng)的營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)[17]。近年發(fā)布的黃羽肉雞農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《黃羽肉雞營養(yǎng)需要量》(NY/T 3645—2020)[18]給出了慢速型黃羽肉雞1～30日齡、31～60日齡、61～90日齡及90日齡以上各階段的鈣需要量，但其中僅明確了肉雞的生長性能指標(biāo)，未見對肉品質(zhì)、骨骼性能等其他性能的描述以及對鈣、磷等礦物質(zhì)需要量的確定依據(jù)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，飼糧不同鈣水平對8周齡末懷鄉(xiāng)雞屠宰性能沒有明顯的影響，僅個(gè)別體尺指標(biāo)呈顯著性變化，支撐數(shù)據(jù)有限，該試驗(yàn)結(jié)果僅給出了懷鄉(xiāng)雞生長后期飼糧鈣水平的參考范圍[19]。懷鄉(xiāng)雞是華南地區(qū)著名的肉雞品種，是一種慢速生長的地方肉雞，具有優(yōu)良肉品質(zhì)和獨(dú)特的骨骼特點(diǎn)[20]。有研究表明，滿足懷鄉(xiāng)雞骨骼生長的飼糧磷水平高于黃羽肉雞標(biāo)準(zhǔn)[21]，因此推測其飼糧鈣水平也可能和黃羽肉雞標(biāo)準(zhǔn)有一定出入。關(guān)于鈣需要量的研究多以生長性能、骨骼性能、血清鈣磷代謝指標(biāo)為評定依據(jù)[5-15]。近期的一項(xiàng)報(bào)道發(fā)現(xiàn)骨骼鈣代謝的分子標(biāo)記物也可敏感評價(jià)肉雞鈣營養(yǎng)狀況[16]。因此，本試驗(yàn)以懷鄉(xiāng)雞為研究對象，考察飼糧鈣水平對懷鄉(xiāng)雞生長性能、骨骼特性、鈣磷代謝指標(biāo)及骨骼鈣代謝標(biāo)記物基因表達(dá)的影響，以探討反映懷鄉(xiāng)雞鈣營養(yǎng)狀況的敏感指標(biāo)，評定5～8周齡懷鄉(xiāng)雞飼糧中鈣的適宜水平。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與動物分組

采用完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將240只28日齡體重[(381.66±5.68) g]均一的懷鄉(xiāng)雞(公雞)，隨機(jī)分為5個(gè)組(每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8只雞)，分別飼喂5個(gè)不同鈣水平的試驗(yàn)飼糧，進(jìn)行飼養(yǎng)試驗(yàn)，持續(xù)28 d，期間觀測生長和耗料情況，飼養(yǎng)試驗(yàn)?zāi)┤⊙汉凸趋罉悠愤M(jìn)行生化和分子表達(dá)指標(biāo)分析。

1.2 試驗(yàn)飼糧

采用玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，飼糧營養(yǎng)水平參考我國《黃羽肉雞營養(yǎng)需要量》[18]以及與懷鄉(xiāng)雞生長、產(chǎn)肉性能相近的地方品種雞的營養(yǎng)參數(shù)[2,9-10]確定?；A(chǔ)飼糧含鈣0.75%，通過改變基礎(chǔ)飼糧中沸石粉和貝殼粉的用量調(diào)整飼糧鈣水平，配制其他4個(gè)鈣水平(0.85%、0.95%、1.05%和1.15%)飼糧，各組飼糧鈣水平的實(shí)際測定值分別為0.75%、0.85%、0.96%、1.05%和1.14%，非植酸磷水平均為0.40%，其他營養(yǎng)成分(代謝能、粗蛋白質(zhì)、氨基酸等)的水平也完全一致。5～8周齡懷鄉(xiāng)雞基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 5～8周齡懷鄉(xiāng)雞基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet for Huaixiang chickens at 5 to 8 weeks of age (air-dry basis) %

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)雞采用3層疊式金屬籠進(jìn)行籠養(yǎng)，飼養(yǎng)全程自由采食和飲水，溫度穩(wěn)定在25～26 ℃，相對濕度保持在60%～65%，每天清1次糞便，每天觀察雞只精神狀態(tài)，記錄病死情況，及時(shí)淘汰病雞，計(jì)算耗料情況，試驗(yàn)開始及8周齡末以重復(fù)為單位稱雞空腹重，每周統(tǒng)計(jì)采食量。

1.4 血液采樣與指標(biāo)測定

飼養(yǎng)試驗(yàn)?zāi)?，將試?yàn)雞空腹12 h后，從各個(gè)重復(fù)中選取接近平均體重的2只雞，稱取活體重后，翅靜脈采血各4 mL，合為1個(gè)樣品，離心(離心力1 008×g，SN-LSC-1離心機(jī))10 min獲得血清，測定血清鈣、磷含量和堿性磷酸酶活性。檢測方法嚴(yán)格按照南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒及說明書進(jìn)行。

1.5 骨骼采樣與指標(biāo)測定

試驗(yàn)雞采血后屠宰，按照陳靜文等[21]所述方法進(jìn)行脛骨和中趾骨取樣，制成風(fēng)干骨骼樣品，并采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法[22]測定其灰分、鈣及磷含量(722型可見分光光度計(jì)，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)。

1.6 脛骨堿性磷酸酶基因表達(dá)測定

采集右側(cè)脛骨于-196 ℃液氮中速凍后，-80 ℃冰箱凍存，按Zhang等[23]描述的步驟采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測定堿性磷酸酶的mRNA相對表達(dá)量。提取脛骨RNA，檢測RNA純度、濃度和完整性(NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)和安捷倫2100生物分析儀)，對可用的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Applied Biosystems7500，美國)。以β-肌動蛋白為內(nèi)參基因，以不同處理的混合樣作為對照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算堿性磷酸酶mRNA相對表達(dá)量[24]。PCR引物信息見表2。

表2 PCR引物信息Table 2 Information of primers for PCR

1.7 養(yǎng)分表觀代謝率

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行代謝試驗(yàn)。從飼養(yǎng)試驗(yàn)中的各組選取體重相近的6只雞轉(zhuǎn)入代謝試驗(yàn)籠內(nèi)，分別飼喂相應(yīng)組的試驗(yàn)飼糧，預(yù)飼3 d使雞只適應(yīng)新的環(huán)境，每天正常飼喂和飲水，觀察雞只的采食和排糞尿情況，預(yù)飼第3天20:00停食不停水，第4天08:00稱重，開始正試試驗(yàn)，正試期為3 d，采用全收糞方法，每天飼喂和飲水并收集排泄物，稱重后立即放入65～70 ℃的烘箱中烘干，最后將3 d的排泄物放在一起65～70 ℃烘干，測定初水分并制成分析樣品。另外采集各組試驗(yàn)飼糧樣品，制成分析樣品。按照國家標(biāo)準(zhǔn)方法[22]測定飼糧和排泄物樣品中干物質(zhì)、粗灰分、鈣、磷含量，按照下式計(jì)算養(yǎng)分表觀代謝率：

某養(yǎng)分表觀代謝率(%)=[(攝入該養(yǎng)分量-排泄物該養(yǎng)分量)/攝入該養(yǎng)分量]×100。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。方差分析前對所有數(shù)據(jù)先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)和正態(tài)性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布。采用SAS軟件的一般線性模型(GLM)進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD法進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)。用不相關(guān)比較法(Orthogonal)分析各差異顯著指標(biāo)隨飼糧鈣水平變化的線性或曲線反應(yīng)，采用二次曲線模型、線性折線模型及二次折線模型進(jìn)行曲線擬合分析[21,24-26]，其鈣水平采用實(shí)測值。根據(jù)二次曲線模型的拐點(diǎn)、線性折線及二次折線模型轉(zhuǎn)折點(diǎn)效應(yīng)值對應(yīng)的鈣水平求得鈣的需要量。方差分析和曲線擬合的顯著水平為P<0.05，0.05≤P<0.10為存在變化趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長性能

由表3可知，懷鄉(xiāng)雞5～8周齡的末重、平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和耗料增重比(F/G)在不同的鈣水平組間無顯著差異(P>0.05)。

表3 飼喂不同鈣水平飼糧懷鄉(xiāng)雞的生長性能Table 3 Growth performance of Huaixiang chickens fed diets with different Ca levels

2.2 脛骨特性

由表4可知，脛骨折斷力、脛骨灰分含量、脛骨灰分磷含量和脛骨脫脂鈣磷比在不同的鈣水平組間無顯著差異(P>0.05)，但飼糧鈣水平對懷鄉(xiāng)雞脛骨灰分鈣含量有顯著影響(P<0.05)。趨勢分析表明，脛骨灰分鈣含量隨飼糧鈣水平呈顯著的二次曲線變化(P<0.05)，其最佳擬合方程(y=-56.12x2+109.80x-18.10，R2=0.48)為二次曲線模型，據(jù)此評價(jià)懷鄉(xiāng)雞飼糧中適宜的鈣水平為0.98%。

表4 飼喂不同鈣水平飼糧懷鄉(xiāng)雞的脛骨特性Table 4 Tibia characteristics of Huaixiang chickens fed diets with different Ca levels

2.3 趾骨特性

由表5可知，趾骨灰分含量、趾骨灰分磷含量和趾骨脫脂鈣磷比在不同的鈣水平組間無顯著差異(P<0.05)，唯有趾骨灰分鈣含量組間存在差異顯著(P>0.05)。趨勢分析表明，趾骨灰分鈣含量隨飼糧鈣水平的升高呈顯著的線性變化(P<0.05)，但有二次曲線變化的趨勢(P=0.079)，其最佳擬合方程(y=-18.64x2+31.15x+25.22，R2=0.92)為二次曲線模型。

表5 飼喂不同鈣水平飼糧懷鄉(xiāng)雞的趾骨特性Table 5 Toe characteristics of Huaixiang chickens fed diets with different Ca levels

2.4 血清鈣磷代謝指標(biāo)及脛骨堿性磷酸酶mRNA相對表達(dá)量

由表6可知，血清磷含量、鈣磷比、堿性磷酸酶活性在不同的鈣水平組間無顯著差異(P>0.05)，但血清鈣含量及脛骨堿性磷酸酶mRNA相對表達(dá)量組間存在差異顯著(P<0.05)，說明兩者可敏感反映懷鄉(xiāng)雞體內(nèi)鈣的營養(yǎng)狀況。趨勢分析表明，血清鈣含量及脛骨堿性磷酸酶mRNA相對表達(dá)量隨飼糧鈣水平的升高呈顯著的二次曲線變化(P<0.05)，其中血清鈣含量的最佳擬合方程(y=-12.71x2+24.60x+13.31，R2=0.77)為二次曲線模型，脛骨堿性磷酸酶mRNA相對表達(dá)量的最佳擬合方程[y=1.15-1.16×(0.90-x)，R2=0.99]為線性折線模型。

表6 飼喂不同鈣水平飼糧懷鄉(xiāng)雞的血清鈣磷代謝指標(biāo)及脛骨堿性磷酸酶mRNA相對表達(dá)量Table 6 Serum Ca and P metabolic indices and tibia ALP mRNA relative expression level of Huaixiang chickens fed diets with different Ca levels

續(xù)表6項(xiàng)目Items飼糧鈣水平DietaryCalevel/%0.750.850.951.051.15P值P-value鈣水平Calevel線性Linear二次曲線Quadratic脛骨堿性磷酸酶mRNA相對表達(dá)量TibiaALPmRNArelativeexpressionlevel1.32±0.05a1.21±0.04ab1.16±0.03b1.15±0.03b1.16±0.03b0.0150.0710.008

2.5 養(yǎng)分表觀代謝率

由表7可知，飼糧鈣水平對干物質(zhì)和磷表觀代謝率沒有顯著影響(P>0.05)，但對粗灰分和鈣表觀代謝率有顯著影響(P<0.05)。趨勢分析表明，粗灰分和鈣表觀代謝率隨飼糧鈣水平的升高呈顯著的二線曲線變化(P<0.05)，二者的最佳擬合方程[粗灰分表觀代謝率:y=-128.17x2+251.00x-104.93(R2=0.87)；鈣表觀代謝率：y=-72.00x2+139.71x-28.99(R2=0.84)]均為二次曲線模型。

表7 飼喂不同鈣水平飼糧懷鄉(xiāng)雞的養(yǎng)分表觀代謝率Table 7 Apparent metabolic rates of nutrients of Huaixiang chickens fed diets with different Ca levels %

2.6 敏感指標(biāo)擬合方程確定鈣需要量

將各敏感指標(biāo)的最佳擬合方程匯總為表8。由表8可知，隨著飼糧鈣水平的升高，脛骨和趾骨灰分鈣含量、血清鈣含量、粗灰分和鈣表觀代謝率均呈二次曲線變化，脛骨堿性磷酸酶mRNA相對表達(dá)量呈線性折線變化，據(jù)此求得懷鄉(xiāng)雞飼糧鈣適宜水平分別為0.98%、0.84%、0.97%、0.98%、0.97%、0.90%，為確保滿足鈣磷代謝及骨骼生長需要，取最大值0.98%為5～8周齡懷鄉(xiāng)雞鈣需要量。

表8 敏感指標(biāo)擬合方程確定鈣需要量Table 8 Fitted equations of sensitive indices to acquire Ca requirement for Huaixiang chickens

3 討 論

不同家禽及同一種家禽在不同的生長階段對鈣的需要量不同[2-3]。我國目前飼養(yǎng)的肉雞主要有3種類型：生長速度快的快大型肉雞、慢速生長的地方肉雞及其雜交品種[4]。懷鄉(xiāng)雞是一種慢速生長的地方肉雞雞種，具有獨(dú)特的外觀特點(diǎn)、胴體性能和肉品質(zhì)與風(fēng)味，深受華南和周邊地區(qū)歡迎[20]。懷鄉(xiāng)雞的飼養(yǎng)一般分為3個(gè)生長階段：0～4周齡、5～8周齡、9～17周齡，17周齡上市，體重達(dá)1 500 g[20]。為科學(xué)配制懷鄉(xiāng)雞飼糧以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)，本試驗(yàn)研究了懷鄉(xiāng)雞5～8周齡階段飼糧鈣適宜水平。

敏感指標(biāo)的選擇是營養(yǎng)需要量評定的關(guān)鍵因素之一。已有研究多以生長性能、骨骼性能、血清鈣磷代謝指標(biāo)評定鈣需要量，如早期在白羽肉雞、嶺南黃羽肉雞、貴妃雞及麒麟雞上的研究[6-10]及近期在AA肉雞上的報(bào)道[11-16]。另有報(bào)道指出，堿性磷酸酶與骨骼鈣磷代謝密切相關(guān)，其活性可用于評價(jià)蛋鴨的鈣需要量[27]；最新的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，骨骼堿性磷酸酶作為鈣代謝的標(biāo)記物，其轉(zhuǎn)錄水平也可敏感評價(jià)肉雞鈣營養(yǎng)狀況[14,16]。本試驗(yàn)綜合上述生長性能、骨骼特性、血清鈣磷代謝指標(biāo)及堿性磷酸酶基因分子表達(dá)指標(biāo)，探討其劑量效應(yīng)規(guī)律，評定懷鄉(xiāng)雞5～8周齡階段的鈣需要量。結(jié)果表明，脛骨和趾骨灰分鈣含量、血清鈣含量、脛骨堿性磷酸酶mRNA相對表達(dá)量、粗灰分和鈣表觀代謝率均隨著飼糧鈣水平的升高呈顯著的二次曲線變化，擬合分析求得飼糧適宜鈣水平為0.84%～0.98%。根據(jù)前人報(bào)道[13-14]，一般選取其中最大值為需要量，以確保滿足所有鈣磷代謝指標(biāo)及骨骼生長需要，故建議該階段懷鄉(xiāng)雞飼糧中鈣水平為0.98%。

擬合模型的選擇對劑量效應(yīng)反應(yīng)法判斷適宜的養(yǎng)分需要量非常關(guān)鍵。不同的曲線模型有其特定的變化規(guī)律，適合于不同的數(shù)據(jù)分布特點(diǎn)[25]。陳麗欣等[26]對肉雞和肉鴨飼糧鈣水平與脛骨灰分含量的劑量效應(yīng)反應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行了7種常用模型的比較，發(fā)現(xiàn)綜合所有擬合數(shù)據(jù)的擬合程度和最佳擬合出現(xiàn)的頻度，二次曲線、線性折線和二次折線模型擬合效果優(yōu)于其他模型，因此，本試驗(yàn)研究中采用了該3種擬合模型進(jìn)行曲線擬合。

綜合以上敏感指標(biāo)(骨骼灰分鈣含量、血清鈣含量及脛骨堿性磷酸酶mRNA相對表達(dá)量、粗灰分和鈣表觀代謝率)，得出其飼糧適宜鈣水平為0.84%～0.98%，取最大值確保滿足所有鈣磷代謝指標(biāo)及骨骼生長需要，因此，懷鄉(xiāng)雞5～8周齡飼糧鈣水平為0.98%時(shí)可獲得最佳的骨骼性能及鈣磷代謝。我國《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)[2]和NRC(1994)[3]建議的快大型肉雞和黃羽肉雞5～8周齡階段鈣需要量均為0.90%，新近發(fā)布的黃羽肉雞農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《黃羽肉雞營養(yǎng)需要量》(NY/T 3645—2020)[18]建議31～60日齡階段的鈣需要量為0.72%[18]，可見，試驗(yàn)得出的懷鄉(xiāng)雞5～8周齡階段飼糧鈣適宜水平高于快速生長肉雞和黃羽肉雞的鈣需要量。另外，與快大型肉雞和快速型嶺南黃羽肉雞同一階段的結(jié)果相比，也有不同程度偏高，如蔣守群等[5]和洪平等[7-8]指出，4～6周齡嶺南黃羽肉雞在飼糧鈣水平為0.90%時(shí)，對改善脛骨性能的效果較好；近期一項(xiàng)研究得出快大型肉雞4～6周齡飼糧鈣水平推薦量為0.72%[14]。但以往報(bào)道的一些慢速生長的地方肉雞的鈣需要量結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果類似，其飼糧適宜鈣水平均高于標(biāo)準(zhǔn)推薦量，如潘文等[9]指出，1～49日齡貴妃雞飼糧適宜鈣水平為1.10%；趙玉振等[11]報(bào)道麒麟雞1～28日齡飼糧鈣需要量為1.18%，分析原因可能與地方肉雞的生長環(huán)境和養(yǎng)分利用率偏低[1]有關(guān)。

4 結(jié) 論

① 脛骨和趾骨灰分鈣含量、血清鈣含量、脛骨堿性磷酸酶mRNA相對表達(dá)量、粗灰分和鈣表觀代謝率可作為5～8周齡懷鄉(xiāng)雞鈣需要量評定的敏感指標(biāo)。

② 建議5～8周齡懷鄉(xiāng)雞飼糧鈣水平為0.98%。