吡咯喹啉醌二鈉對種公雞抗氧化能力及睪丸組織形態(tài)的影響

龍 城 王子騰,2 旦增加布,3 盛熙暉 邢 凱 王相國 肖龍菲 呂學澤 郭 勇 倪和民 孫 越 齊曉龍*

(1.北京農(nóng)學院動物科學技術(shù)學院，北京 100096；2.中華合作時報社，北京 100070；3.那曲職業(yè)技術(shù)學校，那曲 852000；4.北京市畜牧總站，北京 100020)

生產(chǎn)實踐中，種公雞極易受到氧化應(yīng)激，尤其是睪丸。睪丸是精子發(fā)生的場所，精子發(fā)生是非?；钴S的復(fù)制過程，每秒產(chǎn)生約1 000個精子。該過程中較高的細胞分裂率意味著上皮細胞消耗線粒體氧的相應(yīng)速率亦較高。然而，睪丸血管化發(fā)育不全意味著該組織中的氧張力較低，并且睪丸內(nèi)對這一重要元素的競爭非常激烈[1]。因此，睪丸中精子發(fā)生相關(guān)的細胞都極易受到氧化應(yīng)激。

精漿富含多不飽和脂肪酸(PUFA)，對活性氧(ROS)引起的氧化應(yīng)激較敏感。研究表明，高ROS水平與精子質(zhì)量低和男性不育癥相關(guān)[2]。在老齡公雞中情況更糟，ROS隨著年齡的增長在睪丸中積累，不斷誘導(dǎo)細胞中的氧化應(yīng)激[3]。因此，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致老齡公雞繁殖性能下降的重要因素之一。盡管睪丸和精子的抗氧化能力較弱，但睪丸組織和精漿中的抗氧化化合物能保護精子免受ROS的侵害?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，研究者采用了一些方法來提高精液質(zhì)量以及睪丸和精漿的抗氧化能力，包括在膳食中添加蘋果渣[2]、α-亞麻酸[4]等，盡管如此，需要更有效的替代品來提高老齡種雞的繁殖性能，因為這些公雞尤其表現(xiàn)出與年齡相關(guān)的生育能力低下。

吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)是一種氧化還原的輔酶，是ROS清除劑，具有很強的自由基清除能力，能提高機體的抗氧化能力。研究表明，PQQ對乙醇等引起的肝損傷具有良好的保護作用[5]。在繁殖性能方面，小鼠飼糧添加PQQ對其繁殖性能和生長發(fā)育具有改善作用[6]，其機理可能是PQQ提升了小鼠機體尤其是睪丸組織的抗氧化性能，從而保護了小鼠的精子發(fā)生過程。PQQ應(yīng)用最廣泛的是其二鈉鹽形式——吡咯喹啉醌二鈉(pyrroloquinoline quinone disodium，PQQ·Na2)。本課題組前期研究結(jié)果表明，PQQ·Na2可顯著改善種公雞的繁殖性能[7]，推測PQQ可通過提高種公雞機體的抗氧化能力改善其繁殖性能。本試驗在此基礎(chǔ)上進一步研究飼糧添加PQQ·Na2對種公雞血清、肝臟、腎臟和睪丸組織抗氧化能力及對睪丸組織形態(tài)的影響，旨在為PQQ·Na2在種公雞生產(chǎn)種的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

京紅1號蛋用種公雞購自華都峪口禽業(yè)有限責任公司，PQQ·Na2購自上海醫(yī)學生命科學研究中心有限公司，PQQ·Na2中PQQ的含量為1%；無水乙醇和冰醋酸購自北京化工廠；總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測試盒、羥自由基測試盒、超氧陰離子自由基測試盒及丙二醛(MDA)測試盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗設(shè)計

選取440日齡健康的、體況一致的京紅1號蛋用種公雞96只，隨機分為4組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)4只，各重復(fù)之間體重無顯著差異(P<0.05)。對照組飼喂不添加PQQ·Na2的基礎(chǔ)飼糧，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗組飼喂在基礎(chǔ)飼糧中分別添加0.5、1.0和2.0 mg/kg PQQ·Na2的試驗飼糧。預(yù)試期1周，正試期6周。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air dry basis) %

1.3 飼養(yǎng)管理

所有試驗用種公雞均采用單籠飼養(yǎng)，參照雞場內(nèi)安排每日飼喂1次，舍內(nèi)光照充足且持續(xù)12 h，具有相關(guān)的排風設(shè)備，溫度和相對濕度分別控制在24 ℃和50%左右，保持空氣流通。種公雞自由采食，充足飲水，按正常免疫程序進行免疫接種。

1.4 采集樣本

試驗期末，每個重復(fù)選取1只種公雞用10 mL真空采血管取血，血樣在4 ℃下12 000 r/min的條件下離心20 min分離血清，于-80 ℃保存，用于后續(xù)抗氧化指標檢測；取血后進行屠宰，立即取出肝臟、腎臟和睪丸，用生理鹽水清洗表面污物，在一次性培養(yǎng)皿內(nèi)迅速剝離質(zhì)膜后立即分裝于1.5 mL離心管中，在-80 ℃冰箱內(nèi)保存，用于后續(xù)抗氧化指標檢測；將睪丸裁剪成厚度不超過0.5 cm的組織塊，將其放入配好的固定液中，使細胞維持原本的形態(tài)，用于后續(xù)睪丸組織形態(tài)(曲細精管直徑與生精上皮厚度)檢測。

1.5 檢測指標

1.5.1 抗氧化指標的測定

嚴格按照試劑盒中說明書的操作流程，用酶標儀(寶特，威努斯基，美國)分別測定血清、肝臟、腎臟和睪丸等組織中T-SOD、GSH-Px活性以及清除羥自由基能力、清除超氧陰離子能力、MDA含量。

1.5.2 睪丸組織切片的制備

采用伊紅-蘇木精(HE)染色法進行睪丸組織切片的制備，每個重復(fù)制作6張切片，具體步驟如下。

1)修塊：從4%的多聚加強固定液中取出固定好的睪丸組織塊，修成約5 mm×5 mm×2 mm的小塊后用流水沖洗12 h。

2)脫水、硬化：沖洗后的睪丸組織依次放入70%(4 h)、80%(4 h)、90%(2 h)、95%(1 h)的酒精中，再分2次放入100%(30 min)的酒精中，進行脫水。

3)透明：將脫水后的睪丸組織塊從100%的酒精中取出，放于混合液(二甲苯∶100%酒精=1∶1，20 min)中，再分2次用純二甲苯(15 min)透明。

4)浸蠟和包埋：將透明好的睪丸組織浸入到熔點為54～56 ℃熔化的石蠟中1.5 h，再放入熔點為58～60 ℃熔化的石蠟中1.5 h包埋。

5)塑型和切片：把含睪丸組織的包埋蠟塊塑成梯形，切片厚度設(shè)置為3～10 μm。

6)展片：用毛筆將切好的石蠟切片沾起，放到水浴展片機中進行展片(水溫38 ℃)，待蠟片充分展平以后，緩慢從水中撈出蠟片。

7)干燥：將載玻片放入40 ℃帶鼓風的干燥箱中進行干燥，以便進行染色。

8)染色：取已烤干的切片，采用HE染色法進行脫蠟和染色。

9)封片：把載玻片從二甲苯中取出平放于干燥木板上，待二甲苯完全揮發(fā)后，在組織上滴1滴樹膠，加蓋蓋玻片，放于切片盒中保存以備日后觀察統(tǒng)計。

10) 鏡檢：顯微鏡(尼康，日本)鏡檢，圖像采集分析睪丸曲精細管直徑與生精上皮厚度。

1.5.3 睪丸切片曲細精管直徑與生精上皮厚度指標測定

睪丸切片曲細精管直徑與生精上皮厚度測量采用顯微測微尺測量法，每張睪丸切片選擇3個視野，每個視野選擇3個大小相似的曲細精管進行測量。

顯微測微尺包括目鏡測微尺和測微臺尺。目鏡測微尺分為5大格，每格分10小格，共50小格。測微臺尺長1 mm，分為10大格，每格分為10小格，共100小格，每小格等于10 μm。將測微臺尺放在載物臺上，調(diào)焦后在視野中使目鏡和臺尺刻度在“0”刻度完全重疊，再向右找出這2個尺上的刻度重疊的格數(shù)。計算公式為：

目鏡測微尺每小格=臺尺重疊格×10 μm/目尺重疊格。

在本試驗中，目鏡測微尺上的9格與測微臺尺上的第10格重疊。按照公式，本試驗?zāi)跨R測微尺每小格長度=10×10 μm/9=11.11 μm。測量時，不再使用測微臺尺，在視野中利用目鏡測微尺記錄格數(shù)即可。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2021對原始數(shù)據(jù)進行處理。使用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，用Duncan氏法進行多重比較，然后進行趨勢檢驗，檢驗是否滿足線性和二項式等多項式變化。最終結(jié)果表示為平均值和均值標準誤(SEM)，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 飼糧添加不同水平PQQ·Na2對種公雞抗氧化能力的影響

由表2可知，與對照組相比，3個PQQ·Na2組血清中GSH-Px活性、清除羥自由基能力和清除超氧陰離子能力顯著升高(P<0.05)，血清中MDA含量顯著降低(P<0.05)；同時，1.0與2.0 mg/kg PQQ·Na2組血清中T-SOD活性顯著升高(P<0.05)。除清除超氧陰離子能力外，1.0與2.0 mg/kg PQQ·Na2組之間以上血清抗氧化指標均差異不顯著(P>0.05)。

表2 飼糧添加不同水平PQQ·Na2對種公雞血清抗氧化能力的影響Table 2 Effects of different dietary supplemental levels of PQQ·Na2 on serum antioxidant capacity of breeder cocks

由表3可知，與對照組相比，飼糧中添加不同水平PQQ·Na2均可顯著提高肝臟中T-SOD、GSH-Px活性與清除羥自由基能力和清除超氧陰離子能力(P<0.05)，顯著降低肝臟中MDA含量(P<0.05)。1.0與2.0 mg/kg PQQ·Na2組之間以上肝臟抗氧化指標差異不顯著(P>0.05)。

表3 飼糧添加不同水平PQQ·Na2對種公雞肝臟抗氧化能力的影響Table 3 Effects of different dietary supplemental levels of PQQ·Na2 on liver antioxidant capacity of breeder cocks

由表4可知，飼糧中添加0.5和2.0 mg/kg PQQ·Na2顯著提高腎臟中T-SOD活性(P<0.05)，分別較對照組提高11.0%和12.5%。隨著飼糧PQQ·Na2添加水平的增加，腎臟中GSH-Px活性和清除羥自由基能力呈線性增加(P<0.05)。腎臟中GSH-Px活性從對照組的23.20 U/mg prot增加到2.0 mg/kg PQQ·Na2組的35.77 U/mg prot，腎臟清除羥自由基能力從對照組的254.66 U/mg prot增加到2.0 mg/kg PQQ·Na2組的320.49 U/mg prot，各組間差異顯著(P<0.05)。各PQQ·Na2添加組腎臟清除超氧陰離子能力與對照組無顯著差異(P>0.05)。隨著飼糧PQQ·Na2添加水平的增加，腎臟中MDA含量呈線性下降(P<0.05)。飼糧PQQ·Na2添加水平從0增加到2.0 mg/kg可使肝臟中MDA含量降低58.9%(P<0.05)。

表4 飼糧添加不同水平PQQ·Na2對種公雞腎臟抗氧化能力的影響Table 4 Effects of different dietary supplemental levels of PQQ·Na2 on renal antioxidant capacity of breeder cocks

由表5可知，隨著飼糧 PQQ·Na2添加水平的增加，睪丸中T-SOD、GSH-Px活性以及清除超氧陰離子能力和清除羥自由基能力呈線性增加(P<0.05)，睪丸中MDA含量線性降低(P<0.05)。1.0和2.0 mg/kg PQQ·Na2組睪丸中T-SOD活性和清除超氧陰離子能力顯著高于對照組和0.5 mg/kg PQQ·Na2組(P<0.05)，同時1.0和2.0 mg/kg PQQ·Na2組睪丸中MDA含量顯著低于對照組(P<0.05)。飼糧PQQ·Na2添加水平從0增加到2.0 mg/kg，睪丸中GSH-Px活性增加了40.4%(P<0.05)。與對照組相比，飼糧中添加1.0和2.0 mg/kg PQQ·Na2顯著提高了睪丸清除超氧陰離子能力和清除羥自由基能力(P<0.05)。

表5 飼糧添加不同水平PQQ·Na2對種公雞睪丸抗氧化能力的影響Table 5 Effects of different dietary supplemental levels of PQQ·Na2 on testicular antioxidant capacity of breeder cocks

2.2 飼糧添加不同水平PQQ·Na2對種公雞睪丸組織形態(tài)的影響

由表6可知，與對照組相比，各PQQ·Na2添加組的生精小管直徑和生精上皮厚度均顯著增加(P<0.05)。同時，1.0 mg/kg PQQ·Na2組的生精小管直徑和生精上皮厚度均大于其他PQQ·Na2添加組(P<0.05)。由圖1可知，與對照組相比，在各PQQ·Na2添加組中觀察到在曲細精管內(nèi)生精細胞數(shù)量增加，且1.0 mg/kg PQQ·Na2組優(yōu)于其他組。

表6 飼糧添加不同水平PQQ·Na2對種公雞睪丸組織形態(tài)的影響Table 6 Effects of different dietary supplemental levels of PQQ·Na2 on testicular morphology of breeder cocks μm

A、B、C和 D分別代表對照組和 0.5、1.0、2.0 mg/kg PQQ·Na2組。A,B,C and D represented control group and 0.5,1.0,2.0 mg/kg PQQ·Na2 groups,respectively.圖1 各組種公雞睪丸組織切片F(xiàn)ig.1 Testicular tissue sections of breeder cocks in each group (200×)

3 討 論

3.1 飼糧添加不同水平PQQ·Na2對種公雞抗氧化能力的影響

種公雞精液中含大量多不飽和脂肪酸，其極易被氧化，進而影響精液品質(zhì)。PQQ是一種氧化還原酶輔酶，具有較強的抗氧化作用。本團隊前期研究結(jié)果表明，飼糧添加PQQ·Na2可顯著提高種公雞繁殖性能[7]。因此，本試驗推測PQQ·Na2可通過提高種公雞機體的抗氧化能力改善其繁殖性能。

機體內(nèi)含有微量的PQQ·Na2，研究表明動物從飼糧中補充一定量的PQQ·Na2才可達到自身發(fā)育生長的需要量。PQQ·Na2具有較強的清除自由基能力，PQQ·Na2的清除超氧陰離子能力和清除羥自由能力比壞血酸高30～50倍，在正常生理條件下，體內(nèi)既有自由基生成同時也有自由基被清除，因此自由基總量維持在動態(tài)平衡的某一個量左右。本試驗中試驗動物采用的是440日齡的京紅1號種公雞，這個時期的種公雞機體產(chǎn)生老化，機體氧化應(yīng)激水平相對較高，因此本試驗旨在研究PQQ·Na2是否能改善老齡種公雞的氧化應(yīng)激狀態(tài)。本試驗結(jié)果表明，飼糧添加1.0和2.0 mg/kg PQQ·Na2顯著提高了京紅1號種公雞血清、肝臟及睪丸中T-SOD、GSH-Px活性及清除羥自由基能力、清除超氧陰離子能力與腎臟中T-SOD、GSH-Px活性及清除羥自由基能力，降低了京紅1號種公雞血清、肝臟、腎臟及睪丸中MDA含量，這表明PQQ·Na2在老齡種公雞機體內(nèi)具有很高的抗氧化效率。

肝臟是膽固醇的儲存中心。膽固醇首先從小腸吸收后，運輸?shù)礁闻K，然后以高密度脂蛋白(HDL)-膽固醇的形式重新分配到靶器官(如腎臟和睪丸)[8]。肝臟受到氧化應(yīng)激后，易引起肝細胞死亡及其組織損傷[9]。因此，肝臟的脂質(zhì)過氧化可能對HDL的運輸有負面影響，而HDL對維持肝臟和腎臟的功能具有重要作用，最終影響精子的質(zhì)量。本試驗結(jié)果表明，飼糧添加1.0和2.0 mg/kg PQQ·Na2顯著提高了肝臟中T-SOD、GSH-Px活性及清除羥自由基能力和清除超氧陰離子能力，這與Qiu等[10]的研究結(jié)果一致。且本試驗表明，與1.0 mg/kg PQQ·Na2組相比，飼糧添加2.0 mg/kg PQQ·Na2未進一步改善種公雞肝臟中抗氧化指標。這可能是添加1.0 mg/kg PQQ·Na2已達到提高種公雞抗氧化能力的極限，因肝臟MDA含量在添加2.0 mg/kg PQQ·Na2后亦未見進一步降低。

睪丸是精子發(fā)生的場所。精子發(fā)生是一個非?；钴S的復(fù)制過程，能夠每秒產(chǎn)生大約1 000個精子。該過程中較高的細胞分裂率意味著上皮細胞消耗線粒體氧的相應(yīng)速率較高。因此該過程極易受到氧化應(yīng)激[1]。飼糧添加1.0和2.0 mg/kg PQQ·Na2顯著提升了種公雞腎臟和睪丸組織的抗氧化能力，這可進一步提升種公雞的抗氧化能力。Kumar等[11]同樣報道PQQ·Na2能顯著提高小鼠腎臟和睪丸的抗氧化能力。同樣有報道指出，PQQ具有清除自由基的能力[12]。在睪丸組織中，同樣表現(xiàn)為飼糧添加2.0 mg/kg PQQ·Na2未進一步改善種公雞肝臟中抗氧化指標。這提示飼糧中添加1.0 mg/kg PQQ·Na2已達到提高種公雞抗氧化能力的上限。

3.2 飼糧添加不同水平PQQ·Na2對種公雞睪丸組織形態(tài)的影響

PQQ的有益作用也反映在生精小管直徑和生精上皮厚度的改變上。飼糧添加PQQ·Na2顯著增加了生精小管直徑和生精上皮厚度，同時還增加了生精細胞的數(shù)量。Kumar等[13]研究同樣表明，飼糧添加PQQ·Na2可改善小鼠曲細精管直徑和生精上皮厚度。這可能是因為PQQ·Na2可防止老齡種公雞睪丸的氧化損傷，從而促進了生精小管和生精上皮的生長。

結(jié)合本團隊前期的結(jié)果[7]，PQQ·Na2改善種公雞繁殖性能的可能機制可能是源于其較強的抗氧化特性，保護了機體免受氧化損傷(尤其是睪丸組織)，從而保護了精子發(fā)生的過程。

4 結(jié) 論

基于上述結(jié)果，飼糧中添加1.0 mg/kg的PQQ·Na2改善了老齡種公雞的抗氧化能力，提高種公雞睪丸生精小管直徑和生精上皮厚度，而更高添加水平(2.0 mg/kg)未進一步改善機體抗氧化能力。