基于斜率比法評定斷奶仔豬對不同銅源的相對生物學利用率

晏家友 羅宗剛 李書偉 湯文杰 鄺聲耀

(1.四川省畜牧科學研究院，成都 610066；2.動物遺傳育種四川省重點實驗室，成都 610066；3.西南大學動物科學技術學院，榮昌 402460；4.四川省畜科飼料有限公司，成都 610066；5.畜禽生物制品四川省重點實驗室，雙流 616200)

銅是動物機體必需的微量元素之一，它在動物的生長發(fā)育及免疫調節(jié)等方面都發(fā)揮著重要的營養(yǎng)生理作用，可以作為酶的組成成分或激活劑，參與體內物質代謝；可以維持鐵的代謝，促進血紅蛋白合成和紅細胞成熟；可以參與骨細胞、膠原和彈性蛋白的形成，促進骨骼發(fā)育[1-2]。目前，無機銅(如硫酸銅和堿式氯化銅)是飼糧中銅源的主要添加形式，但是其存在吸收率低、排放量高，吸濕性、易結塊等負面問題，還會對飼糧中的維生素和油脂產生破壞作用[3-4]。因而，研發(fā)和應用更加安全、有效和環(huán)保的新銅源來滿足動物對銅的營養(yǎng)需要，已成為當今飼料行業(yè)的必然趨勢。2019年4月，我國農業(yè)農村部發(fā)布第162號公告，批準檸檬酸銅作為新型有機銅源在斷奶仔豬飼糧中使用。研究表明，斷奶仔豬飼糧中添加低劑量(20或30 mg/kg)檸檬酸銅形式的銅，不但可以促進仔豬生長，而且可以提高免疫力，進而降低腹瀉率和死亡率[5-6]。進一步研究發(fā)現，在仔豬飼糧中，與硫酸銅或堿式氯化銅相比，檸檬酸銅更能發(fā)揮營養(yǎng)性和功能性的作用，這可能與其生物學利用率有關[7]。然而，關于斷奶仔豬對檸檬酸銅的生物學利用率研究尚未見相關報道。生物學利用率又稱之為生物學效價，評定微量元素生物學利用率的方法主要有平衡試驗法、放射性同位素法和斜率比法，其中前2種方法因成本高、設備貴等原因沒有得到廣泛應用，而斜率比法操作比較簡單，對試驗器材要求不高，是目前評定微量元素生物學利用率的常用方法[8-9]。因此，本試驗通過研究不同銅源和銅添加水平對斷奶仔豬生長性能、血清銅含量與含銅酶活性以及組織銅含量的影響，探討堿式氯化銅和檸檬酸銅的相對生物學利用率，為新型銅源在仔豬生產中的科學選擇和合理應用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗銅源

試驗采用的3種銅源——硫酸銅(五水硫酸銅，飼料級，Cu2+含量實測值為25.0%)、堿式氯化銅(飼料級，Cu2+含量實測值為58.0%)和檸檬酸銅(飼料級，Cu2+含量實測值為35.0%)，均由四川省某飼料有限公司提供。

1.2 試驗設計

采用3×2雙因子隨機區(qū)組試驗設計(銅源分別為硫酸銅、堿式氯化銅和檸檬酸銅；銅添加水平分別為20和30 mg/kg)，另設1個不額外添加銅源的對照組。

1.3 試驗動物與管理

試驗在西南大學科教實訓基地進行。選取平均體重(8.98±0.48) kg的杜×長×大三元雜交斷奶仔豬112頭，隨機分為7組，每組4個重復，每個重復4頭豬，以重復為單位分欄。試驗前，對豬舍進行徹底清掃和消毒。試驗期間，人工喂料和清糞，每天06:00、11:00和17:00各飼喂1次，仔豬自由采食、飲水。試驗豬舍執(zhí)行常規(guī)免疫程序，嚴格控制溫濕度，保持舍內通風換氣。試驗預試期3 d，正試期28 d。

1.4 試驗飼糧

參照NRC(2012)和《中國飼料成分及營養(yǎng)價值表(2021年第32版)》配制玉米-豆粕型基礎飼糧?；A飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

1.5 樣品采集與處理

1.5.1 血樣采集與處理

試驗第28天，從每個組隨機選取8頭豬，前腔靜脈采血10 mL，在室溫下靜置0.5 h，2 000 r/min離心10 min，制備血清，于-20 ℃冷凍保存，待測。

1.5.2 組織采集與處理

試驗結束當天，從每個重復隨機選取2頭健康仔豬，放血屠宰后立即分離出心臟、肝臟、胰臟、腎臟和跖骨。取心臟、肝臟、胰臟和腎臟樣品各2～3 g，在65 ℃烘至恒重，經室溫回潮24 h后用研缽碾碎，備測。先用去離子水加熱煮沸跖骨，然后剔除跖骨外層附著的肌肉和結締組織，再用去離子水沖洗干凈，于550 ℃灰化至恒重，最后取樣約1 g，備測。

1.6 測定指標與方法

1.6.1 生長性能

試驗開始和結束時，分別對每頭仔豬進行空腹稱重，計算每頭仔豬的平均日增重(ADG)。試驗期內，以重復為單位，記錄總投料量和總余料量，計算每頭仔豬的平均日采食量(ADFI)。根據每頭仔豬的ADG和ADFI計算料重比(F/G)。

1.6.2 血清含銅酶活性

利用紫外-可見光分光光度計(Uvikon XS，Secomen，法國)，采用比色法測定血清中銅藍蛋白(CP)和銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)活性。測定所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.6.3 血清和組織銅含量

利用原子吸收光譜儀(240FS，安捷倫，美國)，按照《食品安全國家標準 食品中銅的測定》(GB 5009.13—2017)中第二法火焰原子吸收光譜法，測定血清、心臟、肝臟、胰臟、腎臟和跖骨中銅含量。

1.7 數據統(tǒng)計與分析

試驗數據經Excel 2010處理后，利用SAS 9.4軟件中的GLM程序進行雙因素方差分析，差異顯著時采用Duncan氏法進行多重比較，試驗結果均用“平均值±標準差”表示，且以P<0.05為差異顯著性判斷標準。建立多元線性回歸方程：Y=a0+a1X1+a2X2+a3X3(Y為所測指標，a0為截距，X1、X2和X3分別為硫酸銅、堿式氯化銅和檸檬酸銅形式的銅添加水平)，以硫酸銅的生物學利用率為100%，根據斜率比法計算堿式氯化銅和檸檬酸銅相對于硫酸銅的生物學利用率，計算方法分別為(a2/a1)×100和(a3/a1)×100[10]。

2 結 果

2.1 不同銅源和銅添加水平對斷奶仔豬生長性能的影響

由表2可知，飼糧銅源、銅添加水平及其交互作用對斷奶仔豬ADG、ADFI和F/G均無顯著影響(P>0.05)。檸檬酸銅組斷奶仔豬末重、ADG和ADFI最高，料重比最低；30 mg/kg銅添加水平組斷奶仔豬末重、ADG和ADFI最高，料重比最低，但與其他組差異均不顯著(P>0.05)。

表2 不同銅源和銅添加水平對斷奶仔豬生長性能的影響Table 2 Effects of different Cu sources and Cu supplemental levels on growth performance of weanling piglets

續(xù)表2銅源或銅添加水平CusourceorCusupplementallevel始重Initialweight/kg末重Finalweight/kg平均日增重ADG/kg平均日采食量ADFI/kg料重比F/G銅添加水平Cusupplementallevel/(mg/kg)08.972±0.01020.284±4.0150.404±0.0810.752±0.0241.861±0.114208.969±0.01320.645±3.0100.417±0.0790.761±0.0531.825±0.066308.982±0.01221.572±2.9170.450±0.0690.778±0.0601.729±0.059P值P-value銅源Cusource0.9960.4230.3710.5430.552銅添加水平Cusupplementallevel0.9900.3650.3660.5420.833銅源×銅添加水平Cusource×Cusupplementallevel0.9720.9460.5930.8630.954

2.2 不同銅源和銅添加水平對斷奶仔豬血清銅含量與含銅酶活性的影響

由表3可知，飼糧銅源和銅添加水平對斷奶仔豬血清銅含量具有顯著影響(P<0.05)，而對血清CP和Cu/Zn-SOD活性均無顯著影響(P>0.05)；飼糧銅源和銅添加水平的交互作用對斷奶仔豬血清銅含量與含銅酶活性均無顯著影響(P>0.05)。根據血清銅含量與飼糧銅添加水平建立的多元線性回歸方程為：Y=0.215+0.077X1+0.085X2+0.093X3(R2=0.326，P=0.016)。式中，Y為血清銅含量；X1、X2和X3分別為飼糧中硫酸銅、堿式氯化銅和檸檬酸銅形式的銅添加水平。以斷奶仔豬對硫酸銅的生物學利用率為100%，則斷奶仔豬對堿式氯化銅和檸檬酸銅的相對生物學利用率分別為110.39%和120.78%。

表3 不同銅源和銅添加水平對斷奶仔豬血清銅含量與含銅酶活性的影響Table 3 Effects of different Cu sources and Cu supplemental levels on serum Cu content and Cu-containing enzyme activities of weanling piglets

續(xù)表3銅源或銅添加水平CusourceorCusupplementallevel銅Cu/(mg/L)銅藍蛋白CP/(U/L)銅鋅超氧化物歧化酶Cu/Zn-SOD/(U/mL)P值P-value銅源Cusource0.0350.8870.142銅添加水平Cusupplementallevel0.0160.3650.500銅源×銅添加水平Cusource×Cusupplementallevel0.7600.8100.566

2.3 不同銅源和銅添加水平對斷奶仔豬組織銅含量的影響

由表4可知，飼糧銅源和銅添加水平對斷奶仔豬肝臟銅含量具有顯著影響(P<0.05)，而對心臟、腎臟、胰臟和跖骨銅含量均無顯著影響(P>0.05)；飼糧銅源和銅添加水平的交互作用對斷奶仔豬組織銅含量無顯著影響(P>0.05)。根據肝臟銅含量與飼糧銅添加水平建立的多元線性回歸方程為：Y=5.415+0.593X1+0.708X2+0.807X3(R2=0.465，P=0.013)。式中，Y為肝臟銅含量；X1、X2和X3分別為飼糧中硫酸銅、堿式氯化銅和檸檬酸銅形式的銅添加水平。以斷奶仔豬對硫酸銅的生物學利用率為100%，則斷奶仔豬對堿式氯化銅和檸檬酸銅的相對生物學利用率分別為119.39%和136.09%。

表4 不同銅源和銅添加水平對斷奶仔豬組織銅含量的影響Table 4 Effects of different Cu sources and Cu supplemental levels on tissue Cu content of weanling piglets mg/kg

3 討 論

3.1 不同銅源和銅添加水平對斷奶仔豬生長性能的影響

銅作為動物機體必需的微量元素之一，對保證斷奶仔豬健康生長具有極其重要的作用。實際生產中，缺銅容易導致仔豬產生共濟失調、關節(jié)腫脹、骨質脆弱以及營養(yǎng)性貧血等癥狀，進而影響其生長速度[11-12]。研究證明，飼糧中額外添加125～250 mg/kg硫酸銅(以銅計，后同)能顯著提高仔豬的生長性能[13-14]。然而，高銅的使用雖然對促進仔豬生長和提高飼料利用率有效，但長期添加會危害機體健康、降低動物產品品質，還會造成銅源浪費，以及帶來養(yǎng)殖環(huán)境污染等安全隱患[15-17]。我國農業(yè)農村部發(fā)布的第2625號公告《飼料添加劑安全使用規(guī)范》規(guī)定，仔豬(體重≤25 kg)配合飼料中銅的最高限量(包含飼料原料本底值)為125 mg/kg。因而，在實現滿足仔豬營養(yǎng)需要、改善飼料品質等預期目標的前提下，要減少飼糧中銅的用量。研究證實，低水平的有機銅完全可以滿足仔豬對銅的營養(yǎng)需要，并且不會影響其生長性能[18-19]。Armstrong等[20]研究結果表明，仔豬飼糧中添加33、66或100 mg/kg檸檬酸銅與添加225 mg/kg硫酸銅具有同等促生長效果。Peng等[5]研究發(fā)現，飼糧中只需添加30 mg/kg檸檬酸銅就可以促進斷奶仔豬生長。Yan等[6]進一步研究發(fā)現，飼糧中添加20 mg/kg檸檬酸銅與添加180 mg/kg硫酸銅相比，斷奶仔豬的生長性能無顯著差異。上述研究結果提示，以檸檬酸銅為銅源，飼糧中補充較低水平的銅即可滿足仔豬的生長需要。本試驗結果表明，飼糧中添加20或30 mg/kg硫酸銅、堿式氯化銅或檸檬酸銅，仔豬的ADG、ADFI和F/G均無顯著差異，分析其原因可能是受銅的化學結構、飼糧中銅含量和豬的生長階段等因素影響所致。因此，本試驗中生長性能指標不適用于評價斷奶仔豬對不同銅源的生物學利用率。

3.2 不同銅源和銅添加水平對斷奶仔豬血清銅含量與含銅酶活性的影響

3.2.1 不同銅源和銅添加水平對斷奶仔豬血清銅含量的影響

銅經過小腸吸收后進入血液，而血清中的銅含量可以反映其吸收率和利用率[21-22]。Pastorelli等[23]研究發(fā)現，飼糧中添加150 mg/kg硫酸銅可以提高斷奶仔豬血清中的銅含量。Armstrong等[24]研究指出，斷奶仔豬飼糧中添加15～125 mg/kg檸檬酸銅與添加250 mg/kg硫酸銅相比，血清銅含量差異并不顯著。本試驗結果顯示，飼糧銅源和銅添加水平對斷奶仔豬血清銅含量具有顯著影響；通過多元線性回歸方程計算得出：以血清銅含量為評價指標，堿式氯化銅和檸檬酸銅相對于硫酸銅(100%)的生物學利用率分別為119.39%和136.09%，說明斷奶仔豬對檸檬酸銅的生物學利用率高于硫酸銅和堿式氯化銅。

3.2.2 不同銅源和銅添加水平對斷奶仔豬血清含銅酶活性的影響

CP和Cu/Zn-SOD是動物體內主要的含銅酶，對調節(jié)機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用[25]。血液中的銅主要分布于血漿和紅細胞中，結合成CP的形式存在[26]。CP具有氧化酶的活性，能催化氧化多酚及多胺；同時CP還具有抗氧化的作用，可以防止組織中脂質過氧化物和自由基的生成[27-28]。Cu/Zn-SOD是一種抗氧化金屬酶，能清除超氧陰離子自由基，防止自由基破壞細胞的組成、結構和功能，保護細胞免受氧化損傷[29-30]。本研究發(fā)現，飼糧中添加20或30 mg/kg硫酸銅、堿式氯化銅或檸檬酸銅對斷奶仔豬血清CP和Cu/Zn-SOD活性均沒有顯著影響。本試驗結果與Peng等[5]的研究結果一致，這可能是由于血清中作為CP和Cu/Zn-SOD活性中心的銅離子已經接近飽和，因而在不同銅源和銅添加水平組沒有表現出明顯差異。

3.3 不同銅源和銅添加水平對斷奶仔豬組織銅含量的影響

銅在動物體內的分布十分廣泛，血液中的銅經循環(huán)系統(tǒng)運輸后到達機體各組織器官。本研究表明，仔豬體內肝臟中銅的含量最高，其次為腎臟和心臟，而胰臟和跖骨中銅的含量較低。研究發(fā)現，動物吸收的銅大部分貯存于肝臟，并且肝臟中的銅含量與飼糧中銅的添加形式和添加水平密切相關[31-32]。因此，肝臟銅含量常作為評價動物對不同銅源生物學利用率的敏感指標。目前，關于仔豬對不同銅源生物學利用率方面的研究較少。VanValin等[33]在牛上的研究結果表明，以肝臟銅含量為評價指標時，堿式氯化銅和賴氨酸銅相對于硫酸銅(100%)的生物學利用率分別為112%和103%。吳學壯等[34]以肝臟銅含量為敏感指標評價肉雞對不同銅源的相對生物學利用率，結果發(fā)現，堿式氯化銅和蛋氨酸銅相對于硫酸銅(100%)的生物學利用率分別為127.61%和137.64%。本試驗結果表明，斷奶仔豬肝臟銅含量與飼糧銅添加水平之間存在顯著的線性回歸關系，采用肝臟銅含量為評價指標，堿式氯化銅和檸檬酸銅相對于硫酸銅(100%)的生物學利用率分別為119.39%和136.09%。本試驗結果與VanValin等[33]和吳學壯等[34]的研究結果相似，提示斷奶仔豬對檸檬酸銅和堿式氯化銅的生物學利用率高于硫酸銅。但是，Liu等[35]以肝臟銅含量和膽汁銅含量為評價指標時，卻發(fā)現肉雞對有機銅和無機銅的生物學利用率沒有顯著差異，究其原因可能是因為機體對有機銅和無機銅的吸收方式存在差異。動物消化道對銅的吸收是機體利用銅的前提，因此，有必要進一步研究不同銅源在動物消化道中的吸收規(guī)律及其作用機制。

4 結 論

本試驗條件下，斷奶仔豬對低銅飼糧(銅添加水平為20或30 mg/kg)中3種銅源的相對生物學利用率表現為檸檬酸銅>堿式氯化銅>硫酸銅。