王亞珍,傅昭粵,沈娛汀,李 娟,侯永利,馬千里,方 亮,陳麗華
(空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,陜西 西安 710032)
高性能飛機(jī)在執(zhí)行飛行任務(wù)時(shí)往往會(huì)產(chǎn)生反復(fù)出現(xiàn)的正加速度(positive acceleration,+Gz),使飛行員處于+Gz重復(fù)暴露狀態(tài)[1],長(zhǎng)期的+Gz暴露會(huì)對(duì)飛行員的心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼肌肉系統(tǒng)產(chǎn)生影響,使飛行員面臨因心腦功能損傷、脊柱損傷、頸椎腰椎和骨關(guān)節(jié)退行性變所導(dǎo)致的永久性飛行任務(wù)限制[2-7],嚴(yán)重威脅飛行員的健康和職業(yè)生涯。為提高飛行員對(duì)+Gz的耐受能力,減輕+Gz重復(fù)暴露對(duì)飛行員所造成的損傷,科學(xué)家們進(jìn)行了大量研究。如有研究表明,適當(dāng)?shù)?Gz重復(fù)暴露訓(xùn)練可顯著增加飛行員的心血管功能儲(chǔ)備,提高其對(duì)+Gz的抗荷能力[8];同時(shí),也有研究表明,低+Gz預(yù)適應(yīng)可顯著減輕高+Gz重復(fù)暴露導(dǎo)致的腦皮質(zhì)和神經(jīng)元的損傷,改善高+Gz暴露引起的學(xué)習(xí)記憶功能障礙[9];適當(dāng)時(shí)間和強(qiáng)度的+Gz暴露可促使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨細(xì)胞分化增殖,促進(jìn)機(jī)體的成骨[10-11];+Gz促進(jìn)BMSCs表達(dá)多種參與成骨分化相關(guān)基因,如ALPL、RUNX2和BMP2等,促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化[12];但關(guān)于+Gz影響B(tài)MSCs整體轉(zhuǎn)錄組狀態(tài)的研究并不多見(jiàn)。鑒于此,本研究將在+15 Gz重復(fù)暴露狀態(tài)下的小鼠作為研究對(duì)象,探索不同暴露時(shí)間小鼠BMSCs的整體轉(zhuǎn)錄組變化情況,并初步分析成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)變化情況。本研究為進(jìn)一步探索高+Gz影響B(tài)MSCs成骨的機(jī)制研究打下基礎(chǔ),也為適當(dāng)+Gz暴露訓(xùn)練增強(qiáng)成骨、改善機(jī)體對(duì)壓力負(fù)荷的承受能力提供一定的參考數(shù)據(jù)。
20只6~8周齡雄性C57BL/6小鼠,飼養(yǎng)條件為SPF級(jí),平均體質(zhì)量為20 g,購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將小鼠隨機(jī)分為4組:①+15 Gz暴露1周組(+15 Gz,15 min/d,連續(xù)離心1周);② 1周對(duì)照組(0 Gz,15 min/d,連續(xù)處理1周);③+15 Gz暴露3周組(+15 Gz,15 min/d,連續(xù)離心3周);④ 3周對(duì)照組(0 Gz,15 min/d,連續(xù)處理3周),每組5只。其中,在+15 Gz暴露1周組和1周對(duì)照組的小鼠中隨機(jī)選取3只小鼠、+15 Gz暴露3周組和3周對(duì)照組中隨機(jī)選取2只小鼠提取BMSCs用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)審批通過(guò)(許可證號(hào):20180101)。
1.2.1 +Gz暴露 通過(guò)小鼠固定裝置將C57BL/6小鼠固定在動(dòng)物離心機(jī)旋轉(zhuǎn)短臂上,頭朝向離心機(jī)軸心,使小鼠身體長(zhǎng)軸與離心加速度保持平行。+Gz暴露組小鼠接受+15 Gz暴露15 min/d,分別持續(xù)暴露1周和3周。兩對(duì)照組小鼠只用裝置固定15 min/d,分別持續(xù)1周和3周,不進(jìn)行+Gz暴露。各組暴露周期完成24 h后,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1.2.2 BMSCs的提取與鑒定 45 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠后,采用頸椎脫臼法處死小鼠。750 mL/L乙醇浸泡消毒小鼠5 min后,于超凈工作臺(tái)中剝離小鼠的股骨和脛骨,剪開(kāi)關(guān)節(jié)面,注射器吸取PBS沖出骨髓,并使用70 μm濾網(wǎng)過(guò)濾以制備單細(xì)胞懸液。之后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),按1×106個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于六孔板。使用含100 mL/L胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞(37 ℃、50 ml/L CO2細(xì)胞孵箱),待融合至80%~90%時(shí)進(jìn)行傳代。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)至第二代的BMSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)情況。所用流式抗體為APC標(biāo)記的抗小鼠CD45抗體(157606,Biolegend,美國(guó))、FITC標(biāo)記的抗小鼠CD90抗體(105305,Biolegend,美國(guó))和PE標(biāo)記的抗小鼠CD105抗體(120407,Biolegend,美國(guó))。以三種熒光的Isotype抗體(981806,400605,400508;Biolegend,美國(guó))作為對(duì)照。根據(jù)細(xì)胞量加入相應(yīng)體積的抗體,4 ℃避光孵育30 min。流式清洗液洗兩次后,再加入200 μL流式清洗液重懸。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD45、CD90和CD105的表達(dá)情況來(lái)鑒定提取的細(xì)胞是否為BMSCs。
1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果分析 將提純培養(yǎng)的各組小鼠BMSCs棄去培養(yǎng)上清,PBS洗兩次后,加入Trizol(1 mL/孔)裂解細(xì)胞并提取總RNA。使用Agilent 2200生物分析儀對(duì)RNA進(jìn)行定性和定量。將標(biāo)記的cDNA文庫(kù)按等比匯集在一起,在Illumina HiSeq X Ten系統(tǒng)的單通道中進(jìn)行150 bp的對(duì)端測(cè)序。HTSeq法測(cè)定基因和lncRNA計(jì)數(shù),RPKM法測(cè)定基因表達(dá)。對(duì)mRNA進(jìn)行顯著性分析、P值計(jì)算和偽發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,F(xiàn)DR)分析后,采用DESeq算法對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選,篩選標(biāo)準(zhǔn)為:①|(zhì)log2(差異倍數(shù))|>0.585;②FDR<0.05。
1.2.4 成骨分化相關(guān)基因表達(dá)變化分析 以生物學(xué)過(guò)程作為依據(jù)將差異基因進(jìn)行GO富集分析,并分析DESeq算法所篩選出的差異表達(dá)基因,得到有關(guān)成骨分化生物學(xué)過(guò)程的4個(gè)差異基因(Alpl、Runx2、Spp1和Bmp2)。分析4個(gè)差異基因表達(dá)水平在各組的變化情況。
1.2.5 成骨分化相關(guān)差異基因表達(dá)的RT-qPCR驗(yàn)證
用Trizol法提取各組小鼠BMSCs的總RNA,按照Hifair? Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR試劑盒說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH作為內(nèi)參基因,采用CFX96 real-time PCR檢測(cè)系統(tǒng)和SYBRPremixExTaqTMⅡ檢測(cè)mRNA的表達(dá)水平,采用Ct(2-ΔΔCt)計(jì)算樣本間mRNA的相對(duì)表達(dá)量。PCR引物序列見(jiàn)表1。
表1 基因引物序列
在兩組小鼠完成+15 Gz暴露24 h后,提取小鼠的BMSCs,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)鑒定CD45-CD90+CD105+的BMSCs。BMSCs的鑒定結(jié)果如圖所示,細(xì)胞表達(dá)CD45陰性(圖1A)、CD90和CD105陽(yáng)性(圖1B~C),確定分離培養(yǎng)的細(xì)胞為BMSCs。
A:所提取BMSCs上CD45的表達(dá)情況;B:所提取BMSCs上CD90的表達(dá)情況;C:所提取BMSCs上CD105的表達(dá)情況。BMSCs:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;Isotype:同型對(duì)照。
為明確+15 Gz重復(fù)暴露對(duì)小鼠BMSCs的影響,我們對(duì)4組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,篩選+15 Gz重復(fù)暴露后小鼠BMSCs中差異表達(dá)的基因。結(jié)果顯示,與1周對(duì)照組小鼠相比,+15 Gz重復(fù)暴露1周小鼠BMSCs上調(diào)的基因有42個(gè),下調(diào)的基因有207個(gè)(圖2A~B);+15 Gz重復(fù)暴露3周小鼠相較于3周對(duì)照組BMSCs有127個(gè)上調(diào)的基因和16個(gè)下調(diào)的基因(圖2C~D)。
A:+15 Gz暴露1周小鼠的差異基因熱圖;B:+15 Gz暴露1周小鼠的差異基因火山圖;C:+15 Gz暴露3周小鼠的差異基因熱圖;D:+15 Gz暴露3周小鼠的差異基因火山圖。FDR:偽發(fā)現(xiàn)率。
為明確+15 Gz重復(fù)暴露具體通過(guò)哪些生物學(xué)過(guò)程影響小鼠BMSCs的功能,對(duì)篩選出的差異基因進(jìn)行了GO富集分析。結(jié)果顯示,與1周對(duì)照組小鼠相比,+15 Gz重復(fù)暴露1周小鼠BMSCs上調(diào)的基因主要富集在蛋白質(zhì)翻譯和磷酸化水平負(fù)性調(diào)節(jié)的生物學(xué)過(guò)程中(圖3A),而+15 Gz重復(fù)暴露3周小鼠相較于3周對(duì)照組BMSCs上調(diào)的基因主要富集在細(xì)胞黏附和成骨分化生物學(xué)過(guò)程中(圖3B)。以上結(jié)果證明,+15 Gz重復(fù)暴露3周能有效促進(jìn)小鼠BMSCs的成骨分化,而+15 Gz重復(fù)暴露1周組尚不能促進(jìn)成骨分化。
A:+15 Gz暴露1周小鼠的GO富集分析;B:+15 Gz暴露3周小鼠的GO富集分析。
為確定+15 Gz暴露影響小鼠BMSCs功能的可能信號(hào)通路,本研究對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了KEGG通路富集分析,按照富集分?jǐn)?shù)的大小,篩選出了+15 Gz暴露組富集的前15個(gè)信號(hào)通路。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,+15 Gz重復(fù)暴露1周組上調(diào)的基因主要富集在細(xì)胞黏附分子、ErbB和Ras信號(hào)通路(圖4A),而暴露3周小鼠BMSCs上調(diào)的基因主要富集在基質(zhì)與胞外受體相互作用、黏著斑、PI3K/Akt、cGMP-PKG和Wnt信號(hào)通路(圖4B)。提示+15 Gz暴露可能通過(guò)以上這些信號(hào)通路影響小鼠BMSCs的功能,也為研究相關(guān)分子機(jī)制提供一定的數(shù)據(jù)參考。
A:+15 Gz暴露1周小鼠的KEGG通路富集分析;B:+15 Gz暴露3周小鼠的KEGG通路富集分析。
為進(jìn)一步探索+15 Gz對(duì)小鼠BMSCs向成骨細(xì)胞分化的影響,我們從篩選出的基因中挑選出了與成骨分化相關(guān)的基因,以其差異倍數(shù)作為縱坐標(biāo),觀察+15 Gz暴露組與其對(duì)照組相比這些基因的表達(dá)變化情況。結(jié)果顯示,與1周對(duì)照組相比,+15 Gz暴露1周小鼠BMSCs成骨相關(guān)差異基因Alpl的表達(dá)明顯增加,約為1周對(duì)照組的1.6倍(圖5A),Runx2、Spp1和Bmp2的表達(dá)則無(wú)明顯變化;而+15 Gz暴露3周組小鼠BMSCsAlpl的表達(dá)增加,約為3周對(duì)照組的3.43倍(圖5B),Runx2、Spp1和Bmp2的表達(dá)亦無(wú)明顯差異。接著我們用RT-qRCR驗(yàn)證了各組差異基因mRNA的表達(dá)變化情況,結(jié)果顯示,+15 Gz暴露1周小鼠BMSCs成骨相關(guān)差異基因Alpl和Bmp2轉(zhuǎn)錄水平有增加趨勢(shì),但無(wú)顯著差異;而+15 Gz暴露3周小鼠BMSCs成骨相關(guān)差異基因Alpl轉(zhuǎn)錄水平顯著上升(P<0.01),提示+15 Gz重復(fù)暴露3周可能通過(guò)增加Alpl的表達(dá)促進(jìn)BMSCs的成骨分化。
A:+15 Gz暴露1周相對(duì)于1周對(duì)照組小鼠BMSCs轉(zhuǎn)錄組成骨相關(guān)差異基因;B:+15 Gz暴露3周相對(duì)于3周對(duì)照組小鼠BMSCs轉(zhuǎn)錄組成骨相關(guān)差異基因;C:RT-qRCR檢測(cè)+15 Gz暴露1周組和1周對(duì)照組小鼠BMSCs成骨相關(guān)差異基因mRNA表達(dá)水平(n=3);D:RT-qRCR檢測(cè)+15 Gz暴露3周組和3周對(duì)照組小鼠BMSCs成骨相關(guān)差異基因mRNA表達(dá)水平(n=3, bP<0.01)。
由于職業(yè)因素宇航員與飛行員經(jīng)常暴露于+Gz環(huán)境中,如載人火箭發(fā)射時(shí),宇航員暴露于+3.2 Gz中;當(dāng)載人航天器關(guān)閉第一個(gè)發(fā)動(dòng)機(jī)后,宇航員將暴露在+3.6~+4.0 Gz中達(dá)30 s;噴氣式戰(zhàn)斗機(jī)的飛行員可能會(huì)反復(fù)經(jīng)歷+9 Gz暴露[13]。為探索+Gz暴露對(duì)宇航員和飛行員身體健康的影響并找到預(yù)防或緩解的方式,LEE等[13]創(chuàng)建新的公式用來(lái)預(yù)測(cè)與人類暴露+Gz強(qiáng)度對(duì)應(yīng)小鼠的重力負(fù)荷來(lái)構(gòu)建小鼠+Gz暴露模型,結(jié)果顯示,小鼠的+9 Gz暴露強(qiáng)度接近于人類的+2.7 Gz強(qiáng)度。既往研究證實(shí)小鼠對(duì)+Gz的耐受能力遠(yuǎn)超人類,半數(shù)致死量為20 G[14]。有研究表明,+15 Gz暴露屬于小鼠生理耐受范圍內(nèi)[15],且大于+9 Gz,更接近于宇航員所經(jīng)歷的暴露強(qiáng)度,因此我們選擇建立+15 Gz暴露小鼠模型來(lái)探索+Gz暴露對(duì)BMSCs成骨的影響。
盡管+Gz重復(fù)暴露作為飛行員面臨的環(huán)境因素,通常給飛行員的身體健康帶來(lái)負(fù)面影響,然而近年來(lái)有許多研究發(fā)現(xiàn),適當(dāng)強(qiáng)度和時(shí)間的+Gz重復(fù)暴露與其他訓(xùn)練方式結(jié)合的方法能通過(guò)增加心血管功能儲(chǔ)備,增強(qiáng)飛行員對(duì)+Gz的抗荷能力。短臂人體離心機(jī)的應(yīng)用也為間歇性人工重力訓(xùn)練及相關(guān)研究提供了便利[16-17]。除此之外,大量研究表明,+Gz可作為一種正向的調(diào)控因素應(yīng)用于骨再生領(lǐng)域,如有研究發(fā)現(xiàn),+20 Gz暴露可協(xié)同骨誘導(dǎo)性納米顆粒增強(qiáng)BMSCs向成骨細(xì)胞分化,改善成骨[10];+12 Gz的暴露可通過(guò)增加成骨細(xì)胞分化關(guān)鍵基因Runx2、成骨相關(guān)基因骨鈣素和維生素D受體的表達(dá),預(yù)防長(zhǎng)期臥床患者的廢用性骨萎縮[18];+3 Gz暴露通過(guò)小鼠的前庭系統(tǒng)提高了肌肉中卵泡抑素的水平,卵泡抑素可拮抗激活素A對(duì)BMP誘導(dǎo)的間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的抑制作用[19]。然而關(guān)于+Gz影響B(tài)MSCs轉(zhuǎn)錄組的整體分析并不多見(jiàn)。
在本研究中,我們對(duì)小鼠進(jìn)行不同時(shí)間的+15 Gz暴露,然后再提取小鼠的BMSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,并通過(guò)差異基因的KEGG通路富集分析確定了+Gz影響B(tài)MSCs生物學(xué)功能的幾條信號(hào)通路,包括PI3K/Akt、cGMP-PKG和Wnt信號(hào)通路等。既往研究表明,巨噬細(xì)胞MSR1通過(guò)激活PI3K/Akt/GSK3β/β-連環(huán)蛋白途徑促進(jìn)BMSCs成骨分化和M2型巨噬細(xì)胞分化[20];BMSCs分泌的細(xì)胞外囊泡所包含的miR-22-3p可能導(dǎo)致MYC/PI3K/Akt通路的抑制,從而通過(guò)FTO抑制促進(jìn)成骨分化[21];具有半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞凋亡抑制因子通過(guò)激活Fgf-2/PI3K/Akt信號(hào)促進(jìn)BMSCs的增殖和成骨分化[22]。這些結(jié)果增加了本研究中KEGG通路富集分析提示的PI3K/Akt為+Gz暴露調(diào)節(jié)BMSCs成骨分化相關(guān)分子機(jī)制的可信度。除此之外,有研究表明,內(nèi)源性心房利鈉肽和NO/cGMP/PKG-Iα信號(hào)通路在調(diào)節(jié)BMSCs存活和增殖中扮演著不可或缺的作用[23];間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體miR-19b抑制WWP1或Smurf2的表達(dá),并通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路提高KLF5的表達(dá),從而促進(jìn)骨折愈合[24];Foxf1敲低通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)BMSCs成骨,并防止卵巢切除術(shù)誘導(dǎo)的骨質(zhì)流失[25]。這些研究也從側(cè)面驗(yàn)證了cGMP/PKG和Wnt信號(hào)通路參與+Gz影響B(tài)MSCs生物學(xué)功能的可能性。
本研究發(fā)現(xiàn),+Gz重復(fù)暴露1周和3周均能顯著增加小鼠BMSCs成骨分化相關(guān)基因Alpl的轉(zhuǎn)錄水平。有研究發(fā)現(xiàn),Alpl功能喪失或突變可能引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流減少,人和小鼠BMSCs的成骨分化下調(diào),導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[26];甲基乙二醛,是一種源自糖酵解途徑的活性羰基代謝物,可降低參與成骨分化基因Runx2和Alpl的表達(dá),對(duì)BMSCs來(lái)源成骨細(xì)胞的膠原代謝和分化產(chǎn)生負(fù)面影響[27]。因此,Alpl可能是參與+Gz重復(fù)暴露調(diào)控小鼠BMSCs成骨分化的關(guān)鍵基因之一。
綜上所述,本研究通過(guò)對(duì)+15 Gz重復(fù)暴露1周和3周小鼠的BMSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析,找到了+Gz暴露影響小鼠BMSCs成骨分化的關(guān)鍵基因之一可能是Alpl。同時(shí),轉(zhuǎn)錄組KEGG通路富集分析的結(jié)果為進(jìn)一步探索+Gz暴露影響B(tài)MSCs成骨分化的潛在機(jī)制提供了研究基礎(chǔ),也為+Gz在骨再生領(lǐng)域的研究提供了更多理論支持。