模擬失重下EphrinB2/EphB4通路在共培養(yǎng)體系中血管平滑肌細(xì)胞增殖及凋亡中的作用

徐 萌，李程飛，潘益凱，李 曦，鐵婭滕，趙星成，范潔怡，王永春

(空軍軍醫(yī)大學(xué)航空航天醫(yī)學(xué)系航空航天醫(yī)學(xué)訓(xùn)練教研室，陜西 西安 710032)

隨著載人航天事業(yè)的不斷發(fā)展，失重所致的航天員心血管功能失調(diào)嚴(yán)重威脅航天員的健康以及任務(wù)的完成[1-3]。經(jīng)航天醫(yī)學(xué)實(shí)踐證明，心血管系統(tǒng)對(duì)機(jī)械應(yīng)力高度敏感，在失重或模擬失重環(huán)境下，會(huì)隨著重力的變化而發(fā)生形態(tài)和功能變化，主要表現(xiàn)為飛行后立位耐力不良[4]，這是由于微重力環(huán)境造成的體液轉(zhuǎn)移，使得機(jī)體上下半身不同部位血管所受到的跨壁壓和剪切力發(fā)生了變化[5]。促紅細(xì)胞生成素肝細(xì)胞激酶受體及其配體肝配蛋白(Ephrin)是酪氨酸激酶家族的最大成員，統(tǒng)稱(chēng)為Eph家族蛋白[6-9]，Eph/Ephrin是體內(nèi)重要的信號(hào)通路，在治療心肌梗死、高血壓以及調(diào)控血管新生和血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells，VECs)生長(zhǎng)中具有重要作用[10-12]。根據(jù)GALE等[13]的研究，一些Eph和Ephrin在血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)中表達(dá)，并在VSMCs增殖及遷移中發(fā)揮作用。現(xiàn)有研究證明，從EphrinBs到EphB4的信號(hào)傳導(dǎo)(正向信號(hào)傳導(dǎo))和從EphB4到EphrinB2的信號(hào)傳導(dǎo)(反向信號(hào)傳導(dǎo))都可以調(diào)節(jié)VSMCs的收縮性[14]。國(guó)內(nèi)外研究均表明，VECs與VSMCs作為血管壁的主要結(jié)構(gòu)細(xì)胞[15-19]，其產(chǎn)生和分泌的生物活性物質(zhì)在調(diào)節(jié)血管張力、調(diào)節(jié)血壓、抗血栓形成等方面發(fā)揮著重要作用[20]。也有研究表明，在失重/模擬失重環(huán)境下可致VECs與VSMCs的形態(tài)、功能、結(jié)構(gòu)及基因表達(dá)等發(fā)生改變[21]。然而，以往的諸如此類(lèi)研究?jī)H局限于模擬失重下單獨(dú)培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞或單獨(dú)培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞的作用機(jī)制研究，而在模擬失重環(huán)境下兩種細(xì)胞的相互調(diào)節(jié)作用研究則屈指可數(shù)。本研究以體外共培養(yǎng)的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(human aortic endothelial cells，HAECs)與人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(human aortic smooth muscle cells，HASMCs)為研究對(duì)象，通過(guò)細(xì)胞回轉(zhuǎn)器模擬失重環(huán)境，檢測(cè)VSMCs中Eph相關(guān)分子、α- 平滑肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma 2, Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X, Bax)與正常組有無(wú)差異表達(dá)，并進(jìn)一步明確Eph/Ephrin在VSMCs增殖和凋亡中的功能及機(jī)制。本研究進(jìn)一步深化了對(duì)失重/模擬失重下血管功能異常的分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料

HAECs、HASMCs、原代內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、原代平滑肌細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗和細(xì)胞生長(zhǎng)因子(上海賽百慷生物技術(shù)有限公司)；EphB4抑制劑NVP-BHG712(美國(guó)APExBIO公司)；胰蛋白酶消化液和PBS磷酸鹽緩沖液、1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR、qPCR SYBR Green Master Mix(上海翌圣生物科技有限公司)；RNAiso Plus細(xì)胞裂解液(上海生工生物工程有限公司)；預(yù)制膠試劑盒(南京金斯瑞生物科技有限公司)；RIPA裂解液、100 mmol/L PMSF和蛋白上樣緩沖液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；EphA2抗體、EphB4抗體、EphrinB2抗體(美國(guó)Abcam公司)；α-SMA抗體(美國(guó)Proteintech公司)；BAX抗體、PCNA抗體、Bcl-2抗體(美國(guó)Abcam公司)；PVDF膜(美國(guó)Invitrogen公司)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(西安壯志生物科技有限公司)；ECL發(fā)光檢測(cè)試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)；qRT-PCR儀(上海羅氏)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher公司)；2D細(xì)胞回轉(zhuǎn)器(中國(guó)航天員科研訓(xùn)練中心)；超凈工作臺(tái)(天津泰斯特儀器有限公司)；TS-100倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；TGL-20M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；化學(xué)發(fā)光儀(美國(guó)Cytiva)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞共培養(yǎng) 用含有50 mL/L胎牛血清、10 mL/L青鏈霉素雙抗、10 mL/L細(xì)胞生長(zhǎng)因子的原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基和原代平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基在含有50 mL/L CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HAECs和HASMCs。細(xì)胞回轉(zhuǎn)艙經(jīng)高壓121 ℃蒸汽滅菌30 min后，打開(kāi)艙蓋，將Transwell小室放入艙內(nèi)；在Transwell小室內(nèi)膜上按照3×108個(gè)/L的密度均勻接種HASMCs的細(xì)胞懸液1 mL，同時(shí)在艙底加入適量培養(yǎng)基以減少膜上培養(yǎng)液的蒸發(fā)；封緊艙蓋后放入37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)過(guò)夜。第2日在內(nèi)膜上按照1×108個(gè)/L的細(xì)胞密度均勻接種HAECs的細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁后，在回轉(zhuǎn)艙中加滿(mǎn)培養(yǎng)基；排盡艙內(nèi)氣泡，將排盡氣泡的回轉(zhuǎn)艙放入細(xì)胞回轉(zhuǎn)器中，培養(yǎng)48 h。將細(xì)胞分為平滑肌細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)正常重力(Control)組、平滑肌細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞模擬失重(MG)組、平滑肌細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)正常重力加抑制劑(Control+inhibitor)組、平滑肌細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)模擬失重加抑制劑(MG+inhibitor)組，其中抑制劑NVP-BHG712的工作濃度為10 μmol/L。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 取出回轉(zhuǎn)艙的小室，用RNAiso Plus裂解小室中的細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，并使用1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用LightCycler? 480檢測(cè)系統(tǒng)和qPCR SYBR Green Master Mix檢測(cè)EphB4、EphrinB2、α-SMA、PCNA、Bcl-2等基因的表達(dá)情況。PCR引物序列見(jiàn)表1。

表1 基因引物序列

1.2.3 Western blotting分析 待細(xì)胞回轉(zhuǎn)失重48 h后，收集回轉(zhuǎn)艙內(nèi)Transwell小室中的細(xì)胞總蛋白，每個(gè)小室中加入100 μL的RIPA裂解液，12 000 r/min，4 ℃離心15 min，吸取上清進(jìn)行BCA蛋白定量。每個(gè)泳道按照20 μg的蛋白量進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、快速封閉液封閉后、一抗(GAPDH為1∶1 000；α-SMA為1∶1 000；PCNA為1∶1 000；Bax為1∶1 000；Bcl-2為1∶1 000)4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，洗膜后二抗孵育1 h，洗膜后ECL化學(xué)發(fā)光觀察拍照。

1.2.4 免疫熒光檢測(cè) 選用8周齡的SD大鼠，隨機(jī)分為正常組和尾吊組，每組各6只，懸吊28 d，每日正常喂養(yǎng)，待28 d尾吊結(jié)束后處死大鼠，剝離頸動(dòng)脈血管后經(jīng)40 g/L多聚甲醛固定，固定狀態(tài)良好后，進(jìn)行修剪、脫水、包埋、切片脫蠟至水、抗原修復(fù)后切片滴加封閉液進(jìn)行封閉，一抗室溫孵育1 h或4 ℃冰箱過(guò)夜，PBST漂洗3次后二抗室溫避光孵育1 h，PBST漂洗后封片、使用熒光顯微鏡拍照觀察。

2 結(jié)果

2.1 模擬失重下對(duì)共培養(yǎng)的HASMCs中EphB4-EphrinB2的影響

為了探究共培養(yǎng)的VSMCs中的EphB4和EphrinB2是否在模擬失重下差異表達(dá)，將HASMCs和HAECs共培養(yǎng)的Transwell小室置于細(xì)胞回轉(zhuǎn)器中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，如圖1A所示，結(jié)果表明模擬失重后HASMCs中EphB4和EphrinB2基因的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)；為了探究EphB4和EphrinB2在共培養(yǎng)中的VSMCs中的作用，將HASMCs和HAECs共培養(yǎng)的Transwell小室置于細(xì)胞回轉(zhuǎn)器中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行蛋白檢測(cè)，如圖1B～C結(jié)果所示，與Control組相比，MG組中HASMCs的EphB4和EphrinB2蛋白水平明顯升高(P<0.05)，說(shuō)明失重狀態(tài)下可促進(jìn)共培養(yǎng)體系中HASMCs的EphB4-EphrinB2的表達(dá)。

A：模擬失重48 h后共培養(yǎng)的HASMCs中的EphB4和EphrinB2基因表達(dá)；B：模擬失重48 h后共培養(yǎng)的HASMCs中的EphB4和EphrinB2蛋白表達(dá)；C：EphB4和EphrinB2蛋白表達(dá)量分析結(jié)果。Control：正常重力組；MG：模擬失重組。 aP<0.05。

2.2 模擬失重下對(duì)共培養(yǎng)的HASMCs增殖的影響

為了探究EphrinB2/EphB4通路對(duì)共培養(yǎng)中的VSMCs增殖的影響，將HASMCs和HAECs共培養(yǎng)的Transwell小室置于2D回轉(zhuǎn)器中，同時(shí)加入EphB4抑制劑NVP-BHG712進(jìn)行處理，培養(yǎng)48 h后進(jìn)行蛋白檢測(cè)，如圖2A～B結(jié)果所示，與MG組相比，加入抑制劑后HASMCs和HAECs共培養(yǎng)體系中HASMCs的PCNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)；如圖2A、C結(jié)果所示，α-SMA表達(dá)顯著增高(P<0.05)。以上結(jié)果表明模擬失重效應(yīng)可通過(guò)EphrinB2/EphB4通路促進(jìn)HASMCs和HAECs共培養(yǎng)體系中HASMCs的增殖，促進(jìn)HASMCs從收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)換。

A：模擬失重48 h后共培養(yǎng)的HASMCs中的α-SMA和PCNA蛋白表達(dá)；B：PCNA蛋白表達(dá)量分析結(jié)果；C：α-SMA蛋白表達(dá)量分析結(jié)果。Control：正常重力組；Control+inhibitor：正常重力加抑制劑組；MG：模擬失重組；MG+inhibitor：模擬失重加抑制劑組。 aP<0.05。

2.3 模擬失重48 h對(duì)共培養(yǎng)中HASMCs凋亡的影響

為了探究失重對(duì)共培養(yǎng)中的HASMCs凋亡的影響，將HASMCs和HAECs共培養(yǎng)的Transwell小室置于細(xì)胞回轉(zhuǎn)器中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，如圖3A～C結(jié)果所示，與Control組相比，Bcl-2蛋白水平明顯升高(P<0.05)，Bax蛋白水平顯著降低(P<0.05)；與MG組相比，抑制劑NVP-BHG712處理后，Bcl-2蛋白水平顯著降低(P<0.05)，Bax水平顯著增高(P<0.05)，表明失重可通過(guò)EphrinB2/EphB4通路抑制共培養(yǎng)體系中HASMCs的凋亡。

A：模擬失重48 h后共培養(yǎng)的HASMCs中的Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)；B：Bcl-2蛋白表達(dá)量分析結(jié)果；C：Bax蛋白表達(dá)量分析結(jié)果。Control：正常重力組；Control+inhibitor：正常重力加抑制劑組；MG：模擬失重組；MG+inhibitor：模擬失重加抑制劑組。 aP<0.05。

2.4 免疫熒光檢測(cè)尾吊大鼠頸動(dòng)脈中EphB4的表達(dá)

為了研究模擬失重大鼠頸動(dòng)脈中EphB4的表達(dá)情況，將尾吊28 d大鼠頸動(dòng)脈經(jīng)40 g/L多聚甲醛固定，通過(guò)免疫熒光進(jìn)行檢測(cè)。如圖4A所示，與正常對(duì)照組相比，大鼠尾吊組中EphB4熒光明顯增多，通過(guò)圖4B分析紅光陽(yáng)性細(xì)胞比率發(fā)現(xiàn)，大鼠尾吊組顯著升高(P<0.05)，表明模擬失重可促進(jìn)大鼠頸動(dòng)脈血管中平滑肌EphB4的表達(dá)。

A：正常組與尾吊組大鼠頸動(dòng)脈免疫熒光；B：紅光陽(yáng)性細(xì)胞比率分析。綠光：CD31；紅光：EphB4；藍(lán)光：DAPI染色。 aP<0.05。

3 討論

長(zhǎng)時(shí)間太空飛行會(huì)使航天員出現(xiàn)心血管功能失調(diào)，其主要致病機(jī)制是內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和其他炎癥因子等多重作用的結(jié)果[22-24]。VECs是一種免疫活性器官，它具有組織相容性，并且可以誘導(dǎo)血型抗原表達(dá)白細(xì)胞的黏附分子并產(chǎn)生細(xì)胞因子[25]。由于存在允許電荷和代謝物通過(guò)的連接以及血管活性介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞在結(jié)構(gòu)上毗鄰，并且也存在著一定的功能調(diào)控關(guān)系[26]。既往的諸多研究?jī)H專(zhuān)注于模擬失重對(duì)VECs或VSMCs的單一細(xì)胞影響，而對(duì)模擬失重狀態(tài)下兩者之間的交互調(diào)節(jié)作用研究則鮮有報(bào)道[27-29]。根據(jù)本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，HASMCs的形態(tài)、功能及表型在單獨(dú)培養(yǎng)和與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)對(duì)相同刺激的反應(yīng)是不一致的[30]。VSMCs位于動(dòng)脈最厚的中膜，在不同刺激下通過(guò)收縮和舒張調(diào)節(jié)血管的血流和血壓，在妊娠、運(yùn)動(dòng)和血管損傷的情況下，對(duì)于血管重塑起著至關(guān)重要的作用。在病理?xiàng)l件下，VSMCs失去其“收縮”表型，增殖能力增強(qiáng)，在失重環(huán)境下，VSMCs也會(huì)發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，由收縮型向合成型轉(zhuǎn)換[31]。

Eph是受體酪氨酸激酶的最大亞家族，并被同樣大的Ephrin家族的細(xì)胞表面結(jié)合配體激活。受體和配體都被分為A類(lèi)和B類(lèi)：9個(gè)EphA受體與5個(gè)EphA配體結(jié)合，5個(gè)EphB受體與3個(gè)EphrinB配體結(jié)合。與其他受體酪氨酸激酶一樣，EphB受體信號(hào)是由受體的寡聚化和酪氨酸磷酸化啟動(dòng)的。其中以EphB4受體及其配體EphrinB2與血管功能研究關(guān)系最受矚目[32]。

為闡明模擬失重狀態(tài)下共培養(yǎng)體系中EphrinB2/EphB4通路在VSMCs增殖、凋亡等功能改變中的作用，本研究首先建立了模擬失重下HAECs與HASMCs共培養(yǎng)模型，并檢測(cè)了HAECs與HASMCs共培養(yǎng)體系中模擬失重狀態(tài)下EphrinB2與EphB4及VSMCs相關(guān)增殖凋亡分子的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)與Control組細(xì)胞相比，模擬失重可促進(jìn)共培養(yǎng)模型中HASMCs中EphrinB2與EphB4的表達(dá)，模擬失重效應(yīng)可通過(guò)EphrinB2/EphB4通路促進(jìn)共培養(yǎng)模型中HASMCs的增殖及向合成表型的轉(zhuǎn)化，并抑制凋亡；最后，采用免疫熒光檢測(cè)尾懸吊大鼠頸動(dòng)脈中EphB4的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)模擬失重可促進(jìn)大鼠中平滑肌的EphB4的表達(dá)。

本研究初步探討了EphrinB2/EphB4通路在共培養(yǎng)體系中VSMCs增殖、凋亡等功能改變中的作用，深化了對(duì)失重導(dǎo)致的心血管功能失調(diào)機(jī)制的認(rèn)識(shí)。