提高釀酒酵母耐受性能的研究進(jìn)展

馬吉喆，李镕濤，陸筑鳳，李加友*，徐濤*

1. 浙江理工大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院（杭州 310018）；2. 嘉興學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院（嘉興 314001）

乙醇（酒精）是重要的大宗化學(xué)品，在化學(xué)工業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、食品和農(nóng)業(yè)等方面都有非常廣泛的用途。2020年全球利用酵母發(fā)酵生產(chǎn)的乙醇達(dá)990億 L，其中美國的產(chǎn)量占54%，巴西占30%[1]*，而我國的產(chǎn)量為92億 L，約占10%。面對復(fù)雜多變的國際局勢造成的能源危機和使用化石燃料帶來的嚴(yán)重環(huán)境問題，作為最具潛力的可再生能源生產(chǎn)方式，利用淀粉和木質(zhì)纖維為原料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的技術(shù)研究深受學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界的關(guān)注，燃料乙醇是可再生能源中替代石油的最優(yōu)選擇[2]*。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的最重要微生物，因為釀酒酵母的生長速度快，對糖的轉(zhuǎn)化利用率高，并且人類對其開發(fā)利用的歷史悠久，對其生物學(xué)特性已有充分了解[3-5]*。但是，釀酒酵母對高體積分?jǐn)?shù)乙醇較為敏感，工業(yè)化的發(fā)酵體系中乙醇體積分?jǐn)?shù)通常不能超過14%，被認(rèn)為是燃料乙醇生產(chǎn)成本過高的最主要原因，這嚴(yán)重制約了燃料乙醇的商業(yè)化發(fā)展[6-8]*。

深入研究釀酒酵母對乙醇等脅迫條件的耐受機理，建立高效的應(yīng)對措施是學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界共同關(guān)注的課題?；诖?，對近年來在釀酒酵母的乙醇耐受、高溫耐受和高滲耐受機制研究進(jìn)行總結(jié)，并綜合分析提高釀酒酵母應(yīng)對各種脅迫的技術(shù)方案，為行業(yè)共同解決高體積分?jǐn)?shù)乙醇發(fā)酵提供思路。

1 釀酒酵母的耐受機制

1.1 釀酒酵母的醇類耐受機制

乙醇作為釀酒酵母的主要代謝產(chǎn)物，雖然釀酒酵母對乙醇具有較高的耐受性[6]*，但仍對乙醇的毒性作用很敏感。隨著發(fā)酵時間延長，乙醇體積分?jǐn)?shù)升高，進(jìn)而對酵母的生長產(chǎn)生抑制作用。酵母在發(fā)酵過程中能通過調(diào)節(jié)代謝來保證自身的正常生長，即產(chǎn)生乙醇耐受性。酵母的乙醇耐受性能取決于很多方面，其中酵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)和自身遺傳基因?qū)ζ淠褪苄云鹬P(guān)鍵作用[8]*，主要包括熱激蛋白合成基因、海藻糖合成酶基因[9]*及脯氨酸、精氨酸和色氨酸的tRNA基因tR（ACG）D和亮氨酸t(yī)RNA基因tL（CAA）K[10-11]*。HSP編碼基因可在乙醇的促使下合成特定的熱激蛋白，能起到穩(wěn)定細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)的作用，通過應(yīng)激反應(yīng)減弱乙醇對細(xì)胞的毒害作用，從而提高釀酒酵母乙醇耐受性[12]*。乙醇體積分?jǐn)?shù)升高時，這些基因會被激活合成相關(guān)蛋白和海藻糖，增強酵母對乙醇的抵抗能力；其中海藻糖和脯氨酸可以防止蛋白質(zhì)變性、減少膜的滲透性改變，海藻糖是細(xì)胞在環(huán)境脅迫下的應(yīng)激產(chǎn)物；脯氨酸是一種滲透保護(hù)物質(zhì)，可保護(hù)和維持生物大分子物質(zhì)在脅迫環(huán)境下的穩(wěn)定性，被認(rèn)為是酵母對脅迫因素耐受性的重要指標(biāo)[13]*。丁醇異構(gòu)體對酵母細(xì)胞的毒性要比乙醇大得多，通過增加熱休克蛋白70、敲除關(guān)鍵基因可以增加異丁醇耐受性[14]*；其中參與蛋白質(zhì)降解的基因?qū)?xì)胞耐受丁醇異構(gòu)體很重要，但和耐受乙醇的能力不相關(guān)[15]*。

1.2 釀酒酵母的高溫耐受機制

溫度作為影響酵母菌生長的重要因素，會影響酵母菌的酶活性以及對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，而不同的酵母菌對溫度的耐受性也不同[16]*。邊明鴻等[17]*從發(fā)酵的桑葚果酒中篩選的異常威克漢遜酵母可在36 ℃的高溫環(huán)境下生長。酵母菌的耐熱機制涉及多個生理過程的變化，其中誘導(dǎo)表達(dá)熱激蛋白的過程起主導(dǎo)作用[18]*，細(xì)胞內(nèi)熱激蛋白基因HSP104的大量表達(dá)可以提高酵母的耐熱性[19]*；在耐熱性很差的刀豆（HSP101缺陷型）中導(dǎo)入酵母HSP104基因并使之正常表達(dá)，刀豆的耐熱缺陷很快就得到彌補并恢復(fù)正常[20]*。海藻糖對提高溫度耐受性也有顯著作用[21]*。

1.3 釀酒酵母的高滲耐受機制

高體積分?jǐn)?shù)乙醇發(fā)酵所面臨的主要挑戰(zhàn)就在于酵母對滲透壓的耐受能力，酵母菌對滲透壓的脅迫存在多種調(diào)節(jié)途徑，如高滲透壓甘油（HOG）途徑和Yap1/skn7介導(dǎo)的途徑分別專門參與對滲透性和氧化應(yīng)激的反應(yīng)。HOG-MAPK途徑和耐高滲有密切關(guān)系，其調(diào)控機制主要在于通過信號傳遞激活3-磷酸甘油脫氫酶基因（gpd1、gpd2等），促使?jié)B透物甘油等的合成，從而改變細(xì)胞的滲透勢來提高酵母耐高滲能力[22]*。除此之外，海藻糖的合成對酵母耐高滲也有一定影響，不同發(fā)酵底物使得異常威克漢遜酵母對糖的耐受性不同，并從自然發(fā)酵果蔬酵素中分離得到耐高糖能力的異常威克漢遜酵母，這為耐高滲發(fā)酵劑的使用提供實踐經(jīng)驗[23]*。另外，Elp3基因影響釀酒酵母的咖啡因耐受性，其和耐高滲性能方面也有密切關(guān)系[24]*。

2 提高釀酒酵母耐受性的方法

在乙醇發(fā)酵過程中，以生產(chǎn)效益為導(dǎo)向的過程管理中會迫使釀酒酵母處于嚴(yán)重的不平衡狀態(tài)，即高溫、高滲透、高底物濃度和高乙醇體積分?jǐn)?shù)等環(huán)境因子的脅迫，對釀酒酵母的生長和代謝產(chǎn)生嚴(yán)重影響。因此，高性能生產(chǎn)菌株和高水平工藝控制的根本目標(biāo)就是提高酵母的耐受性，使其在特殊環(huán)境中也能維持正常的生長和代謝。關(guān)于提高釀酒酵母耐受性的方法有很多，如菌種改良、培養(yǎng)基優(yōu)化、添加輔助因子等均取得一定進(jìn)展。

2.1 菌種改良提高酵母耐受性的方法

菌種改良方法包括自然選育、傳統(tǒng)誘變育種和現(xiàn)代基因工程。自然選育是產(chǎn)業(yè)界較為常用的方法[25]*。而誘變育種可以提高突變頻率和變異譜，更容易獲得高產(chǎn)菌株。溴化乙錠是常用誘變劑，利用溴化乙錠誘變篩選出呼吸鏈缺陷型酵母菌株，在42 ℃高溫下維持較高的生長能力和發(fā)酵能力，與對照菌株相比乙醇產(chǎn)量高出2倍[26]*。但是誘發(fā)突變的隨機性比較大，要進(jìn)行大規(guī)模的篩選工作才能獲得良好效果，且變異菌株不穩(wěn)定，易出現(xiàn)回復(fù)突變?，F(xiàn)代基因工程是通過基因組改造技術(shù)來實現(xiàn)對菌種改良，如全局轉(zhuǎn)錄因子工程[27]*、基因組多重位點自動改造技術(shù)[28]*等，這些方法可在短時間里獲得優(yōu)良的菌種，是已報道最先進(jìn)的微生物育種技術(shù)。在gln3D酵母菌株中刪除GLN3，增強工程菌株的耐受性，并使異丁醇產(chǎn)量提高4.9倍[29]*。王灝等[30]*通過基因組改組技術(shù)對釀酒酵母進(jìn)行2次改造后，得到耐熱和發(fā)酵性能較好的菌株，使其可在35℃條件下有較高的乙醇產(chǎn)量；也可通過表達(dá)GLN1基因，提高釀酒酵母的谷胱甘肽含量，使其對糠醛的耐受性得到提高，乙醇產(chǎn)量也提高了5.3倍[31]*。當(dāng)然，控制釀酒酵母耐受性的調(diào)控基因數(shù)量達(dá)幾百個，涉及很多亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化，很難確定在提高酵母耐受的同時，不影響其他發(fā)酵性能。利用基因組改造和適應(yīng)性進(jìn)化篩選獲得的釀酒酵母菌株S.C D 12，工業(yè)小試發(fā)現(xiàn)其在35 ℃高溫下仍能保持良好的乙醇產(chǎn)量和較低的殘?zhí)?，適合于工業(yè)化生產(chǎn)，能極大節(jié)約工業(yè)上冷卻水的使用，降低發(fā)酵成本[32]*。也可以通過HAA1蛋白的過表達(dá)，提高釀酒酵母的乙酸耐受性[33]*。由pntAB編碼的7個大腸桿菌反應(yīng)，edd、pfl、pps、maeD、ppc和mdh作為胞質(zhì)反應(yīng)添加到釀酒酵母的骨架代謝模型中，能彌補結(jié)構(gòu)差異，改善了釀酒酵母的生產(chǎn)力[34]*。在產(chǎn)乙醇的大腸桿菌KO11菌株中過表達(dá)isc系統(tǒng)，可以提高乙醇耐受性和ADH活性，以及將醋酸合成的代謝通量轉(zhuǎn)向乙醇以提高乙醇產(chǎn)量[35]*。

2.2 優(yōu)化培養(yǎng)基提高酵母耐受性的方法

在工業(yè)發(fā)酵的生產(chǎn)中，培養(yǎng)基既是釀酒酵母的生存環(huán)境，也是其營養(yǎng)物質(zhì)的主要來源，能夠直接影響酵母的生長和代謝。發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計和優(yōu)化在整個工業(yè)發(fā)酵中有著舉足輕重的地位。通過對原有培養(yǎng)基成分進(jìn)行配比和不同的試驗設(shè)計方法，實現(xiàn)釀酒酵母對不同脅迫因素的耐受性增加，進(jìn)而實現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)物的提高。在秸稈發(fā)酵乙醇的研究中發(fā)現(xiàn)，里氏木霉（Trichoderma reesei）T12菌株產(chǎn)纖維素酶活力提高115%，秸稈被轉(zhuǎn)化為乙醇的量得到提升[36]*。在酵母發(fā)酵過程中，向培養(yǎng)基中添加磷酸二氫鉀、硫酸鎂和尿素，乙醇產(chǎn)量提升20 g/L，達(dá)到原本最高產(chǎn)量的119%[37]*。優(yōu)化培養(yǎng)條件，可以提高酵母生物量[38]*，更會對乙醇代謝起到促進(jìn)作用，達(dá)到事半功倍的效果[39]*。褚金磊等[40]*通過響應(yīng)面法優(yōu)化最適培養(yǎng)基在該培養(yǎng)基條件下發(fā)酵12 h，胞內(nèi)巰基含量最高可達(dá)1.82%，比未優(yōu)化前提高60%，使得釀酒酵母的抗氧化性提高、乙醇產(chǎn)量增加，為后期進(jìn)行高密度工業(yè)化發(fā)酵奠定基礎(chǔ)。

2.3 添加輔助因子提高酵母耐受性的方法

通過在發(fā)酵過程中添加相關(guān)的輔助因子既能夠促進(jìn)酵母生長、增強代謝、彌補酵母營養(yǎng)缺失的物質(zhì)，如表面活性劑、發(fā)酵助劑及一些金屬離子，還可以增強酵母對乙醇的耐受性，從而增加乙醇產(chǎn)量?？赏ㄟ^添加鉀離子或緩沖液來限制培養(yǎng)基的酸化，增加酵母對乙醇的耐受性，提高乙醇滴度進(jìn)而增加乙醇的耐屬性提高酒精產(chǎn)量[41]*。也可以添加鋅提高酵母細(xì)胞對乙醇、高溫和乙酸的耐受性[42]*，在0.1 mm Zn2+*條件下酵母菌達(dá)到最大的活力、生物量和乙醇產(chǎn)量[43]*。在石榴酒發(fā)酵中添加發(fā)酵助劑VVR（主要含硫酸銨鹽和無機鹽）可以提高發(fā)酵速率和乙醇產(chǎn)量[44]*；法國LALLEMAND生產(chǎn)的發(fā)酵助劑（含酸性物質(zhì)）在山葡萄酒的發(fā)酵中可以提高糖的利用率[45]*。楊昳津等[46]*通過添加外源物觀察酵母Et20的耐受性，得出硬脂酸能最大限度提高釀酒酵母菌株Et20的乙醇耐受性，促進(jìn)酵母Et20在乙醇脅迫下的生長，又提高酵母Et20的發(fā)酵強度。超高體積分?jǐn)?shù)（VHG）乙醇發(fā)酵過程添加乙醛，發(fā)酵結(jié)束的乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)17%（對照的乙醇濃度為7%）[47]*?；堇^星等[48]*總結(jié)表明乙醛由酵母通過代謝途徑產(chǎn)生，作為代謝的一個節(jié)點，乙醛既能還原成乙醇又能氧化成乙酸。將酒糟多肽作為天然產(chǎn)物添加到糖蜜培養(yǎng)基中可以促進(jìn)酵母的生長代謝和發(fā)酵性能，而且有助于酵母抵抗高滲透壓和乙醇體積分?jǐn)?shù)[49]*，添加0.5%大豆肽能有效促進(jìn)酵母生長，增加抗逆性并提髙發(fā)酵速率[50]*。在發(fā)酵體系中添加不同體積分?jǐn)?shù)的乙偶姻能夠促進(jìn)碳源更多地分配給2, 3-BD的合成途徑，從而增加乙醇產(chǎn)量[51]*。通過低強度的超聲處理，也可在不改變釀酒酵母耐受性的前提下使得釀酒酵母的生物量增加127.03%[52]*。

3 結(jié)語與展望

燃料乙醇可替代化石能源，有利于綠色發(fā)展，符合國家安全需要；充分利用農(nóng)林廢棄物為原料，可以助力解決“三農(nóng)”問題。近年來，我國燃料乙醇產(chǎn)業(yè)發(fā)展取得長足進(jìn)步，但是相比于美國、巴西等國家，中國仍面臨原材料供應(yīng)不穩(wěn)定、產(chǎn)業(yè)鏈不完整、競爭平臺不公平等問題，嚴(yán)重阻礙燃料乙醇的發(fā)展進(jìn)度[53]*。

從技術(shù)開發(fā)和生產(chǎn)管理角度來看，發(fā)酵工藝和菌種問題是整個產(chǎn)業(yè)的核心所在。工藝方面主要在于提高發(fā)酵溫度從而減少冷凝水的使用；乙醇發(fā)酵工業(yè)在降本增效問題上，更加關(guān)注對菌株的耐受性改造。通過了解釀酒酵母的生長代謝和耐受機制，通過過表達(dá)某些基因增釀酒酵母對特異性耐受性，通過對優(yōu)良菌種的篩選獲得最大效益的菌株進(jìn)行培育，除以之外通過改良培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分和插入重組質(zhì)粒誘導(dǎo)育種出高抗逆性酵母菌株，將作為研究的主流方向。隨著科技的進(jìn)步，對酵母耐受性能的研究技術(shù)也會不斷突破，更多優(yōu)秀的品種有望應(yīng)運而生，并在工業(yè)生產(chǎn)中實現(xiàn)大規(guī)模應(yīng)用，發(fā)展前景十分廣闊。