基于斑馬魚模型漢麻仁脫脂粉降尿酸作用

董艷，張正海，魏連會，宋淑敏，姬妍茹，石杰

黑龍江省科學院大慶分院（大慶 163316）

高尿酸血癥是一種由嘌呤代謝紊亂導致血液尿酸水平異常高引起的代謝性疾病[1]*。大約5%～12%的高尿酸血癥最終會發(fā)展為痛風，還與糖尿病、中風等多種疾病相關[2-4]*。然而，目前市面上銷售的治療高尿酸血癥的藥物有一些副作用，限制了其臨床應用。例如，別嘌呤醇的副作用包括胃腸道刺激、骨髓抑制、過敏綜合征、肝炎和腎功能惡化[5-6]*。越來越多的天然產品，如金槍魚提取物[7]*、乳清蛋白肽[8]*等已被證明對高尿酸血癥的控制有效且不良反應小，在高尿酸血癥治療中具有顯著優(yōu)勢。

漢麻仁含有30%以上的油脂和25%以上的蛋白[9]*。漢麻仁蛋白中含量最高的氨基酸是谷氨酸（3.74%～4.58%），其次是精氨酸（2.28%～3.10%）。除賴氨酸和含硫氨基酸外，各種必需氨基酸均滿足FAO/WHO對2～5歲嬰幼兒的建議要求，是一種優(yōu)質的蛋白質[10-11]*。漢麻仁還富含被認為是潛在的抗高血壓藥物的肽[12]*和具有潛在抗炎和心血管活性的木脂素酰胺[13]*。最近的研究發(fā)現漢麻仁還可以降低肥胖Zucker大鼠血漿尿酸水平[14]*，但其在治療高尿酸血癥的功能作用和機制尚未完全闡明。

斑馬魚作為新型模式生物，與人類有高達70%以上基因同源，且有成本低、用藥量少等多種優(yōu)點，可以高通量地進行活性物質篩選[15-16]*，具有成為優(yōu)良高尿酸模型的潛力[17]*。次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（Hypoxanthine guanine-phosphoribosyltransferases，HPRT）是嘌呤代謝補救合成途徑中的一種關鍵酶[18]*。有機陰離子轉運蛋白1（Organic anion transporter 1，OAT1）是SLC22A轉運蛋白家族的一員，在介導腎臟尿酸鹽分泌到尿液中發(fā)揮作用[19]*。因此，本研究通過將漢麻仁脫脂粉配制成500，1 000和2 000 μg/mL的3種不同質量濃度的水溶液飼養(yǎng)高尿酸斑馬魚幼魚模型，分析漢麻仁脫脂粉對斑馬魚幼魚的最大耐受濃度（Maximum tolerance concentration，MTC）及降尿酸功效和勻漿中相關基因表達水平，進而研究漢麻仁脫脂粉輔助降尿酸功效和潛在機制，為漢麻仁脫脂粉在功能食品中的應用提供理論數據[20-21]*。

1 材料與方法

1.1 動物試驗

野生型AB品系斑馬魚由杭州環(huán)特生物科技股份有限公司養(yǎng)魚中心繁殖提供，斑馬魚胚胎在光照14 h、黑暗10 h的循環(huán)水系統中以自然成對交配繁殖方式獲得。斑馬魚飼養(yǎng)于28 ℃的養(yǎng)魚用水中（水質：每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導率為450～550 μS/cm；pH為6.5～8.5；硬度為50～100 mg/L CaCO3），試驗動物使用許可證號為SCXK（浙）2022-0004。飼養(yǎng)管理符合國際AAALAC認證（認證編號：001458）的要求。發(fā)育至受精后5天（5 days post-fertilization，5dpf）的斑馬魚用于樣品輔助降尿酸功效最大耐受濃度（MTC）測定、功效評價和輔助降尿酸功效機制研究。

1.2 材料與試劑

漢麻仁脫脂粉，為實驗室經超微粉碎后采用超臨界提取自制，用標準稀釋水配制成10.0 mg/mL母液，現配現用；AmplexTM*Red Uric Acid/Uricase Assay Kit[批號2286863，賽默飛世爾科技（中國）有限公司，USA]；氧嗪酸鉀（批號為C1808048，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，China），用含0.1%羧甲基纖維素的標準稀釋水配制成20 mmol/L母液，現配現用；黃嘌呤鈉鹽（批號為SLBV3159，Sigma，USA），用標準稀釋水配制成10 mmol/L母液，現配現用；別嘌呤醇（批號為MKCM1316，Sigma，USA），用100%DMSO配成13.6 mg/mL母液，-20 ℃保存；二甲基亞砜（DMSO，批號BCCD8942，Sigma，Switzerland）；無水乙醇（批號20210529，國藥集團化學試劑有限公司，China）；iTaq Universal SYBR Green Supermix（貨號1725124，Bio-rad，USA）；FastQuant RT Kit試劑盒[貨號KR106-02，天根生化科技（北京）有限公司，China]；RNA-Quick Purification Kit（RNA快速提取試劑盒）（貨號RN001，上海奕杉生物，China）。

1.3 儀器與設備

SZX7解剖顯微鏡（OLYMPUS，Japan）；CP214精密電子天平（OHAUS，USA）；703001型6孔板（Nest Biotech，China）；T100普通PCR擴增儀（Bio-rad，Singapore）；CFX Connect熒光定量PCR儀（Bio-rad，Singapore）；PICO17/21高速冷凍離心機（ThermoFisher，Germany）；Nanodrop2000紫外-可見光分光光度計（Thermo，Austria）；BE-6100微孔板迷你離心機（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，China）。

1.4 方法

1.4.1 漢麻仁脫脂粉制備流程

漢麻籽→脫殼→CO2超臨界萃取3次→超微粉碎（0.150 mm）→漢麻仁脫脂粉

1.4.2 漢麻仁脫脂粉主要成分分析方法

蛋白質含量測定：GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》[22]*。

脂肪含量測定：GB 5009.6—2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》[23]*。

碳水化合物含量測定：GB/Z 21922—2008《食品營養(yǎng)成分基本術語》[24]*。

水分含量測定：GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》[25]*。

1.4.3 最大檢測耐受濃度（MTC）測定

將240尾5dpf正常發(fā)育的斑馬魚隨機分為正常對照組、模型對照組和含五種質量濃度（125，250，500，1 000，2 000和4 000 μg/mL）的漢麻仁脫脂粉的實驗組于含3 mL標準稀釋水（pH約為7.8±0.2，硬度約為250 mg/L，以CaCO3計）6孔板中，每組30尾。

除正常對照組外，其余各試驗組均以終濃度為0.5 mmol/L的黃嘌呤鈉鹽和10 mmol/L的氧嗪酸鉀水溶液聯合誘導斑馬魚高尿酸模型。試驗組斑馬魚的標準稀釋水中除含有氧嗪酸鉀和黃嘌呤鈉鹽外，另含有不同濃度的漢麻仁脫脂粉。正常對照組不作任何藥物處理。置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中20 h后，觀察各試驗組斑馬魚幼魚各靶器官的毒性及死亡情況，對各試驗組斑馬魚幼魚各靶器官無毒性且不會導致斑馬魚幼魚死亡的樣品濃度即為該樣品的MTC。將MTC作為最高劑量，并依次3倍遞減確定中劑量組和低劑量組給藥濃度。

1.4.4 輔助降尿酸功效評價方法

樣品配制方法同1.4.3小節(jié)。將180尾5dpf正常發(fā)育的斑馬魚隨機分為正常對照組、模型對照組、別嘌呤醇組、和含3種質量濃度（500，1 000和2 000 μg/mL）的漢麻仁脫脂粉試驗組，每組30尾。

陽性對照組飼養(yǎng)斑馬魚的標準稀釋水中除含有氧嗪酸鉀和黃嘌呤鈉鹽外，另含有別嘌呤醇136 μg/mL。各組斑馬魚在恒溫28.5 ℃的培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)20 h后，于30 mL的預冷至0 ℃的0.9%氯化鈉中均質，4 ℃勻漿，10 000 r/min離心10 min，取上清液利用AmplexTM*Red Uric Acid/Uricase Assay Kit尿酸熒光檢測試劑盒，使用多功能酶標儀軟件采集數據，激發(fā)波長530～560 nm，發(fā)射波長590 nm，分析斑馬魚體內（勻漿）尿酸熒光信號強度。

1.4.5 降尿酸基因研究方法

樣品配制方法同1.4.3小節(jié)，各試驗組斑馬魚給藥方式同1.4.4小節(jié)。28 ℃處理20 h后，使用RNA快速提取試劑盒提取各組均質化斑馬魚總RNA，利用紫外-可見光分光光度計對總RNA濃度和純度進行測定。取2.00 μg斑馬魚樣品總RNA，按照cDNA第一鏈合成試劑盒說明操作，合成20.0 μL cDNA，通過q-PCR檢測β-actin、HPRT1和OAT1基因的表達。

1.5 數據統計方法

統計學處理結果采用mean±SE表示。用SPSS 26.0軟件進行統計學分析，單因素方差分析采用t檢驗和方差分析，P＜0.05表明差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 漢麻仁脫脂粉主要成分分析結果

漢麻仁脫脂粉中的主要成分為蛋白質，其含量為70.3 g/100 g，其次為碳水化合物14.6 g/100 g，脂肪含量為5.2 g/100 g，相對漢麻仁脂肪含量降低很多。CO2超臨界萃取能有效地提取漢麻仁里的油脂。

表1 漢麻仁脫脂粉主要成分含量表 單位：g/100 g

2.2 漢麻仁脫脂粉的最大耐受濃度（MTC）

由表2可知，在試驗條件下，當漢麻仁脫脂粉濃度最高為2 000 μg/mL時，對斑馬魚幼魚各靶器官無毒性且不會導致斑馬魚死亡，漢麻仁脫脂粉對模型斑馬魚的最大耐受濃度（MTC）為2 000 μg/mL。選擇了樣品低劑量500 μg/mL、中劑量1 000 μg/mL、高劑量2 000 μg/mL，進行漢麻仁脫脂粉輔助降尿酸功效評價試驗。

表2 漢麻仁脫脂粉最大檢測濃度（n=30）

2.3 漢麻仁脫脂粉輔助降尿酸功效評價結果

由表3和圖1可知，與正常對照組比較，模型對照組斑馬魚尿酸熒光信號強度顯著增高（P＜0.05），斑馬魚高尿酸模型建立成功，與模型對照組比較，低劑量組500 μg/mL斑馬魚尿酸熒光信號增強，是因為試驗中尿酸的檢測原理是檢測尿酸反應后的過氧化氫濃度，500 μg/mL質量濃度斑馬魚試驗中產生過氧化氫，數值就會比模型組略高，但無統計學差異，中劑量1 000 μg/mL組比模型組斑馬魚尿酸熒光信號降低但無統計學差異、高劑量2 000 μg/mL斑馬魚尿酸熒光信號強度降低，差異顯著（P＜0.05）。

表3 漢麻脫脂粉的輔助降尿酸活性（n=3）

圖1 樣品處理后斑馬魚尿酸熒光信號強度

2.4 RNA提取結果及引物序列信息

樣品處理結束后，提取斑馬魚總RNA，用紫外-可見光分光光度計測定RNA的濃度及A260/A280比值（表4），A260/A280比值均在1.8～2.2之間，表明提取得到斑馬魚總RNA質量較好，可用于后續(xù)q-PCR試驗。引物序列見表5。

表4 總RNA的濃度及A260/A280比值（n=30，樣本一）

表5 引物序列信息

2.5 定量PCR檢測

漢麻脫脂粉對高尿酸模型斑馬魚中HPRT1和OAT1基因表達的影響如表6、圖2和圖3所示與模型對照組，漢麻仁脫脂粉中劑量組1 000 μg/mL提高了HPRT1相對表達（P＜0.05），高劑量組2 000 μg/mL對HPRT1相對表達不顯著，推測是2 000 μg/mL質量濃度組基因表達比較快，在檢測的時間點已經過了高峰，基因表達下降了。漢麻仁脫脂粉對OAT1相對表達無顯著差異。

表6 樣品輔助降尿酸功效機制研究相關基因表達的影響（n=3）

圖2 HPRT1和OAT1基因相對表達量

3 結論

漢麻仁脫脂粉對模型斑馬魚的MTC為2 000 μg/mL，與模型對照組狀態(tài)相似，漢麻仁脫脂粉具有輔助降低給予氧嗪酸鉀和黃嘌呤鈉鹽建立高尿酸模型斑馬魚體內尿酸的功效，分析其原因與通過上調HPRT1（次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶基因）基因的表達有關。隨著生活水平的提高，人們的飲食習慣也產生很大的改變，如高嘌呤物質的攝入，患上高尿酸血癥、痛風的人群越來越大。目前針對此類疾病的治療藥物存在較大的毒副作用，促使人們從安全的自然產物中挖掘新的有效的降尿酸活性物質，以便改善和治療高尿酸血癥、痛風疾病[26]*。漢麻仁脫脂粉是目前尚未被充分利用的一類低值完美蛋白資源之一。研究為漢麻仁脫脂粉在輔助降尿酸功能和特醫(yī)食品的開發(fā)利用提供技術基礎，為漢麻仁的高值利用提供有效途徑。同時為證明漢麻仁脫脂粉中起輔助降尿酸作用主要成分，下一步將對漢麻仁脫脂粉中蛋白質降尿酸功效進行研究。