上?？诎斗蛛x單增李斯特菌耐藥性及MLST分型研究

黃新新，何宇平*，寧雪，趙勇，郭德華，曾靜

1. 上海海關(guān)動植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心（上海 200135）；2. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院（上海 201306）；3. 中國海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心（北京 100026）

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）為重要的食源性致病菌，對免疫力低下的人群例如孕婦、老人及兒童等尤為易感，可引發(fā)腦膜炎、敗血癥及流產(chǎn)，死亡率高達(dá)30%[1]*。上?？诎睹磕赀M(jìn)口大量各類冰鮮及冷凍食品，來自挪威、智利的大西洋鮭魚、北極貝等冰鮮食品因其口味鮮美而廣受歡迎。然而單增李斯特菌除廣泛存在于各類食品中，在4 ℃保存的食物中也可生長繁殖，這對用作生食的冰鮮刺身帶來很大風(fēng)險，加之其能抵御冷凍等各種嚴(yán)苛條件，造成食品安全的重大隱患[2]*。研究基于口岸進(jìn)出口食品風(fēng)險監(jiān)管的需求，檢測從東亞、歐洲、南美及北美冰鮮和冷凍食品中分離到的單增李斯特菌耐藥性，結(jié)合全基因測序分析各菌株的多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST），旨在了解世界各地單增李斯特菌耐藥發(fā)展趨勢及分布規(guī)律。提升政府監(jiān)管力度，保障食品安全。

1 材料與方法

1.1 菌株

47株單增李斯特菌分離株來源于歐洲、南美、北美、東亞及中國上海各地，分離自大西洋鮭魚、巴氏魚柳、雞翅、豬耳及上海食品加工廠生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的食品或環(huán)境樣品，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定。藥敏質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC29213購自美國ATCC菌株保藏中心。所有菌株-80 ℃保存于10%甘油肉湯中。

1.2 儀器與試劑

全自動藥敏試驗(yàn)菌液接種及判讀系統(tǒng)（珠海美華醫(yī)療科技有限公司，型號：MA120）；高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司，型號：5427R）；細(xì)菌藥物MIC測試板及M-H肉湯培養(yǎng)基（珠海美華醫(yī)療科技有限公司）；細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；緩沖蛋白胨水（BPW）、腦心浸液營養(yǎng)肉湯、李氏增菌（LB1，LB2）基礎(chǔ)（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）；李斯特菌顯色培養(yǎng)基（上海中欣生物工程有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌株復(fù)蘇

從甘油凍存管中取100 μL菌液接種到5 mL腦心浸液營養(yǎng)肉湯中，在37 ℃條件下，按150 r/min振蕩過夜。

1.3.2 藥敏試驗(yàn)

菌懸液制備：挑取純培養(yǎng)單個菌落于稀釋液瓶內(nèi)壁研磨，呈細(xì)菌懸液0.5麥?zhǔn)蠁挝?，可以參照?biāo)準(zhǔn)比濁管，也可以用濁度計(jì)測量。吸50 μL菌懸液，加至M-H肉湯培養(yǎng)基內(nèi)混勻后，加入測試板藥敏孔，每孔100 μL。貼好膜，35～37 ℃孵育18～24 h后判讀結(jié)果。測試板中的藥物種類：1. 氨芐西林（ampicillin，AM）；2. 青霉素（penicillin，PEN）；3. 苯唑西林（oxacillin，OXA）；4. 紅霉素（erythromycin，ERY）；5. 克林霉素（clindamycin，CLI）；6. 環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）；7. 達(dá)托霉素（daptomycin，DAP）；8. 復(fù)方新諾明（trimethoprim sulfamethoxazole，SXT）；9. 萬古霉素（vancomycin，VA）；10. 四環(huán)素（tetracyclines，TET）；11. 氯霉素（chloramphenicol，CHL）；12. 慶大霉素（gentamicin，GEN）；13. 頭孢西丁（cefoxitin，CXT）；14. CFZ頭孢唑林（cefazolin，CFZ）；15. 美羅培南（meropenem，MER）。藥敏判定參照了美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（Clinical and Laboratory Standard Institute，CLSI）標(biāo)準(zhǔn)：CLSI M100 ED31-2021，以金黃色葡萄球菌為參照判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.3 基因組抽提

利用試劑盒進(jìn)行基因組DNA抽提，采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA完整性和純度檢測，采用Qubit 3.0進(jìn)行DNA濃度檢測，提取后的DNA送上海生工生物工程股份有限公司。

1.3.4 建庫測序

利用超聲波儀 Covaris M220（Covaris，Woburn，MA，USA）將各基因組DNA樣本隨機(jī)打斷成300 bp左右的片段，隨后按照操作說明書，利用NEBNext?Ultra? DNA Library Prep Kit for Illumina?（NEB，USA）進(jìn)行文庫構(gòu)建，采用Agencourt AMPure XP（Beckman，USA）進(jìn)行磁珠純化，并用GenNextTM*NGS Library Quantification Kit（Toyobo，Japan）進(jìn)行定量，之后采用illumina平臺進(jìn)行測序。

1.3.5 MLST分析

用拼接好的序列（scaffolds）和mlst的數(shù)據(jù)庫（指定的方案）進(jìn)行比對，得到每個樣本的分型。分析工具：mlst分型和最小生成樹可視化使用R語言（v3.6.3）工具包MLSTar（version 0.1.5）（https：//github.com/iferres/MLSTar）。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥敏試驗(yàn)

47株菌株對AMP、PEN、SXT、VAN、GEN、CFZ、MER 100%敏感，對CXT 100%耐藥。對OXA耐藥率87.23%（41/47）；ERY耐藥率4.25%（2/47）；CLI中介率74.46%（35/47）；CIP耐藥率6.38%（3/47），中介率8.51%（4/47）；DAP中介率2.12%（1/47）；TET耐藥率2.12%（1/47）；CHL耐藥率10.63%（5/47），中介率12.76%（6/47）。

對CHL耐藥的5株菌株（LM78、LM79、LM80、LM82、LM83），均分離自大西洋鮭魚，4株來源于智利，另一株LM82來源于加拿大；此外LM80、LM83對ERY耐藥。對CHL中介的6株菌株，LM2、LM65分別為美國及巴西的雞翅，LM3、LM75為美國的薯?xiàng)l及雞腿，LM69為英國的豬肋骨，LM72為新西蘭的大西洋鮭魚。對CIP耐藥的3株菌株，LM2及LM65分別來自于美國和巴西的雞翅，LM76來自于越南的巴氏魚柳；對CIP中介的4株菌株，LM3、LM7來自于美國的薯?xiàng)l、雞翅，LM1803、A248則分別來自于越南巴沙魚柳及上海的雞蛋餡料。47株菌株中，2株四重耐藥，6株三重耐藥。多重耐藥菌株6株來自于大西洋鮭魚（LM77、LM78、LM79、LM80、LM82、LM83），1株三重耐藥菌來自于巴沙魚柳（LM76），1株三重耐藥株來自于雞翅（LM2）。

2.2 MLST分析

根據(jù)組裝得到的47株單增李斯特菌的序列，選擇Listeria monocytogenes https：//bigsdb.pasteur.fr/listeria/這個方案進(jìn)行分析，用于MLST分型的7個管家基因?yàn)椋篴bcZ（537 bp）、bglA（399 bp）、cat（486 bp）、dapE（462 bp）、dat（471 bp）、ldh（453 bp）和lhkA（480 bp）。47株單增李斯特菌分析結(jié)果：ST：17個，ST new：1個，CC：17個。包括：ST 2（9株）、ST 3（2株）、ST 4（2株）、ST 5（3株）、ST 9（5株）、ST 31（2株）、ST 37（1株）、ST 87（7株）、ST 91（1株）、ST 101（3株）、ST 121（3株）、ST 155（2株）、ST 296（1株）、ST 297（1株）、ST 403（1株）、ST 426（2株）、ST 648（1株）；另外還有一株新ST型（LM63），該菌株的dat是一個新的等位基因。

從食品來源看，巴氏魚柳分離到的單增李斯特菌均為ST2型；大西洋鮭魚分離菌株為ST31、ST87、ST91、ST121、ST296、ST426，另有一株來自煙熏三文魚為新ST型；豬肉產(chǎn)品中分離株為ST3、ST4、ST9、ST37、ST403；雞肉產(chǎn)品中分離株為ST3、ST5、ST9、ST121、ST155、ST297，上述菌株均從進(jìn)口食品中分離。從上海食品生產(chǎn)環(huán)節(jié)中取樣的菌株為ST9、ST87、ST101、ST155。

從地區(qū)來源看，來自歐洲與美洲的菌株，ST型比較多樣化；而來自越南的菌株皆為ST2，來自中國的菌株，主要為ST9、ST87和ST101，其中ST101均為中國上海株（表1）。

表1 47株單增李斯特菌MLST分析

3 討論與結(jié)論

單增李斯特菌耐藥譜在近些年有所增長擴(kuò)散，在畜禽養(yǎng)殖場及食品中均能分離到耐藥株，但同時不同地區(qū)耐藥情況又有所差異。Gianluca等[3]*檢測了98株從2個養(yǎng)豬場中分離到的單增李斯特菌，發(fā)現(xiàn)對克林霉素的耐藥率非常高，達(dá)到了57%；對環(huán)丙沙星、苯唑西林、左氧氟沙星和達(dá)托霉素的耐藥率也超過20%～50%。共有93株（94.9%）對至少一種抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥性，11株（11.2%）為多重耐藥性。Fernanda等[4]*檢測雞肉加工廠分離到的37株單增李斯特菌，表明對氨芐西林和磺胺類等藥物存在高耐藥率。Wu等[5]*通過檢測80株中國零售即食食品中分離的單增李斯特菌，發(fā)現(xiàn)對青霉素和美洛西林均敏感，耐藥率最高的是克林霉素（51.25%），其次是頭孢噻吩（23.75%）和氨芐西林（12.5%）。27株菌株對所有14種受試抗生素敏感；17株菌株對2種以上抗生素耐藥，其中6株多重耐藥菌株對10種以上抗生素耐藥。Krzysztof等[6]*采用紙片擴(kuò)散法評估237株從魚類加工廠中分離到的單增李斯特菌對青霉素、氨芐西林、美羅培南、紅霉素、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑的敏感性，發(fā)現(xiàn)對紅霉素和甲氧芐啶/磺胺甲惡唑的耐藥率均達(dá)到47.1%。表明單增李斯特菌對多種抗菌藥物存在有耐藥趨勢。研究中，47株單增李斯特菌對大多數(shù)抗菌藥敏感，對臨床首選藥青霉素及氨芐西林均敏感，故不影響臨床用藥。整體檢測中，苯唑西林耐藥率高，達(dá)到87.23%，對克林霉素中介率也達(dá)到74.46%，這與其他研究有很大的相似[3,*5]*。對頭孢西丁100%耐藥可能與單增李斯特菌對頭孢菌素具有內(nèi)在耐藥性相關(guān)，新一代的頭孢唑林則是100%敏感。值得注意的是，本次四重耐藥的2株LM80、LM83及三重耐藥LM77、LM78、LM79、LM82均分離自大西洋鮭魚，而大西洋鮭魚則通常被用來做刺身生食，污染多重耐藥菌加大了食品安全風(fēng)險?？傮w而言，研究中，水產(chǎn)品中分離到的耐藥菌株要高于畜禽中的菌株。

MLST是一種基于核酸序列測定的細(xì)菌分型方法，通過比較ST可以發(fā)現(xiàn)菌株的相關(guān)性，即密切相關(guān)菌株具有相同的ST。據(jù)報道，東亞優(yōu)勢株為ST2、ST1、ST121、ST155[7]*，有研究者分析了上海食源性86株單增李斯特菌，結(jié)果ST8、ST87、ST121及ST155分布最廣泛[8]*。研究發(fā)現(xiàn)，ST具有很明顯的地區(qū)聚集性。例如來自越南的8株，時間跨度從2013至2018年，均屬于ST2型；來源于歐洲與美洲的菌株，盡管ST型表現(xiàn)多樣性，但相同國家或地區(qū)的菌株ST型還是具有一定的相似性。例如來自美國的LM7、LM75，分離時間分別為2005年至2015年，均屬ST5型；來自智利的LM80、LM83屬于ST31，LM78、LM79屬于ST426型；來自中國及上海的LM103、A195、A198屬于ST9，LM60、A189、A224、A248屬于ST87；上海的另外三株A213、A216、A277屬于ST101。對于在其他報道中東亞及上海地區(qū)比較常見的ST121及ST155，在本研究中發(fā)現(xiàn)同樣存在于巴西、挪威、加拿大及美國，遍及了歐洲和南美、北美國家。表明隨著國際貿(mào)易的發(fā)展及流通，各類型的菌株會傳及世界各地。

不同來源菌株分子分型及比較對于單增李斯特菌溯源具有重要意義，而耐藥性分析則對食品流通鏈上的安全風(fēng)險監(jiān)控不可或缺。因而需進(jìn)一步關(guān)注及加強(qiáng)口岸中單增李斯特菌的生物防控措施，提高監(jiān)管力度，切實(shí)保障入境食品安全及人民大眾的生命健康。