葡萄籽中原花青素提取工藝優(yōu)化

崔長偉，馬彤彤*，束廷廷，李洋，張夢婷，王艷君

楚雄師范學(xué)院資源環(huán)境與化學(xué)學(xué)院（楚雄 675000）

葡萄作為世界上產(chǎn)量最大、種植面積最廣的水果之一，葡萄種植主要以歐洲種（Vtis vinifera）和美國種（Vitis labrusca）為主，我國葡萄產(chǎn)量豐富，年鮮果產(chǎn)量可達(dá)千萬噸。葡萄在加工時會產(chǎn)生葡萄籽副產(chǎn)物，葡萄籽一般用作飼料、肥料，其中含有的多種物質(zhì)未被利用，葡萄酒生產(chǎn)會產(chǎn)生大量廢棄物，如處理不當(dāng)，會造成環(huán)境污染和資源浪費。在葡萄籽中，原花青素含量在5%～8%之內(nèi)，原花青素是一種多酚化合物，由不同數(shù)量的（+）-兒茶素[（+）-catechin]和表兒茶素[（-）-Epicatechin][1]*單體縮合而成的聚合物[2]*，其抗氧化功效是維生素C的20倍、維生素E的50倍，具有抗輻射、抗腫瘤、抗衰老、治療心血管疾病、提高免疫功能、預(yù)防神經(jīng)退行性改變等作用[3-5]*。

原花青素的親水性較好，易溶于多種有機溶劑中，如甲醇、乙醇、丙酮等。越來越多的科學(xué)家對原花青素的提取進(jìn)行探究，他們對各種各樣植物中的原花青素進(jìn)行提取，將其利用在其他產(chǎn)品中。原花青素的提取方法主要包括溶劑提取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、超聲-微波協(xié)同提取法、超臨界CO2提取法及酶輔助提取法，這些方法各有優(yōu)缺點，根據(jù)實際條件選用合適的提取方法，或?qū)追N方法配合使用，以達(dá)到最佳提取效果[7]*。王文君等[7]*利用索氏提取法、熱回流法、超聲波提取法提取紫番薯原花青素，其中超聲波提取法提取效果好。李俊儒等[8]*對比有機溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法和酶提取法在提取條件和提取率等方面的異同。

結(jié)合試驗條件，有機溶劑提取法、超聲波提取法、酶提取法進(jìn)行試驗可行性較高。方法相互結(jié)合的試驗也有研究，但是幾種方法同時對比的研究較少。俞騰飛等[9]*對葡萄籽采用纖維素酶-超聲波輔助法提取原花青素的工藝研究，并且與超聲波提取法形成對比，但是該試驗存在一定局限性，其并未探究其他結(jié)合的方法。鑒于此，開展單一方法及復(fù)合方法提取原花青素的對比試驗，綜合考慮試驗成本、試驗環(huán)境、提取效果等，選擇理想的試驗方法。結(jié)合單因素試驗和正交試驗，得出葡萄籽原花青素提取的最佳工藝條件，以期提高產(chǎn)業(yè)的綜合加工能力和原料利用率，改善環(huán)境，實現(xiàn)變廢為寶，帶動農(nóng)產(chǎn)品發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器及試劑

1.1.1 試驗材料

紫葡萄籽（新疆市售）。

1.1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平[SQP，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9070A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；超微粉碎機（800Y，武義海納電器有限公司）；循環(huán)水式多用真空泵（SHZ-DⅢ，上海力辰邦西儀器科技有限公司）；超聲波清洗器（SK8210HP，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（HWS-26，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；紫外可見分光光度計（UV-5500，上海元析儀器有限公司）；酸度計[Sartorius PB-10，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]。

1.1.3 主要分析試劑

石油醚（沸程30～60 ℃，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；正丁醇（含量≥99.5%，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；六水合硫酸鐵（Ⅱ）銨（硫酸亞鐵銨，含量≥99.5%，汕頭市西隴化工有限公司）；無水乙醇（含量≥99.7%，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；鹽酸（含量36.0%～38.0%，成都市科龍化工試劑廠）；三氯化鐵（含量≥99.00%，重慶吉元化學(xué)有限公司）；檸檬酸（含量≥99.5%，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；磷酸氫二鈉（含量≥99.00%，天津市鳳船化學(xué)試劑有限公司）；原花青素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%，北京索萊寶科技有限公司）。試驗所用試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程圖

工藝流程如圖1所示，葡萄籽中提取原花色素研究成熟完善的工藝為超聲波提取法、有機溶劑提取法、酶提取法3種，但是各種方法結(jié)合文獻(xiàn)分析各有其缺點，此次試驗通過葡萄籽原料的預(yù)處理、催化劑的選擇等將3種方法兩兩結(jié)合進(jìn)行優(yōu)勢互補，從而結(jié)合正交試驗的結(jié)果，從提取率、成本投入、環(huán)保等角度進(jìn)行評價，從而篩選更有利于葡萄籽中原花色素的提取工藝方法。

圖1 原花青素提取工藝流程圖

1.2.2 葡萄籽的預(yù)處理

將市售葡萄籽在鼓風(fēng)烘干箱中烘至恒重，使用粉碎機進(jìn)行葡萄籽的破碎，并用0.425 mm孔徑（40目）篩進(jìn)行篩選，將過篩的葡萄籽粉使用石油醚進(jìn)行脫脂，其比例1∶4，在0 ℃下脫脂48 h，脫脂結(jié)束使用真空泵進(jìn)行抽濾，抽濾結(jié)束后在鼓風(fēng)烘干箱中將葡萄籽粉烘至恒重。

1.2.3 催化劑選擇

采用超聲波提取法、有機溶劑提取法、酶提取法的工藝，分別使用硫酸亞鐵銨和三氯化鐵作為催化劑，根據(jù)其提取率，研究催化劑對于葡萄籽中原花青素提取的影響。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按郗艷麗等[10]*方法稍作修改。

精密稱取10 mg原花青素標(biāo)準(zhǔn)品，放在10 mL容量瓶中，加入50%乙醇溶解且定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的原花青素標(biāo)準(zhǔn)品，分別取0，0.05，0.1，0.15，0.2和0.25 mL標(biāo)準(zhǔn)品置于25 mL比色管中，加入50%乙醇至1 mL，加入6.0 mL的正丁醇-鹽酸溶液（體積比為95∶5）和0.2 mL 2%硫酸亞鐵銨溶液（2 mol/L的鹽酸溶液溶解），搖勻并用正丁醇定容至10 mL，沸水浴加熱40 min，顯色后立即使用冰水冷卻20 min，在550 nm處比色測定。

1.2.5 原花青素提取率的計算

取1 mL粗提取液進(jìn)行稀釋定容，然后進(jìn)行原花青素含量的測定，根據(jù)式（1）計算原花青素提取率[11]*。

原花青素提取率=c×m×v/（1 000×ω） （1）式中：c為回歸方程得到的質(zhì)量濃度，mg/mL；m為稀釋倍數(shù)，v為待測液體積，mL；ω為稱取葡萄籽質(zhì)量，g。

1.2.6 提取方法探究

1.2.6.1 超聲波輔助酶提取法

稱取2.000 g脫脂葡萄籽粉放在錐形瓶中，按照料液比1∶20 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，使用緩沖液調(diào)節(jié)pH 4.0，加入100 U/mg 0.4%的纖維素酶，在45 ℃、超聲功率200 W條件下，超聲10 min，酶解1.0 h后，抽濾后，對粗提取液進(jìn)行稀釋定容，待用。按照1.2.4及1.2.5小節(jié)進(jìn)行原花青素含量的測定并計算提取率。

1.2.6.2 超聲波輔助有機溶劑提取法

稱取2.000 g泡過石油醚的葡萄籽粉放在錐形瓶中，據(jù)料液比1∶20 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，在45 ℃，使用超聲波清洗機，其功率200 W，時間10 min，在水浴鍋提取54 min后，抽濾后，對粗提取液進(jìn)行稀釋定容，待用。按照1.2.4及1.2.5小節(jié)進(jìn)行原花青素含量的測定及提取率的計算。

1.2.6.3 酶輔助有機溶劑提取法

稱取2.000 g脫脂葡萄籽粉放置于錐形瓶中，在料液比1∶20 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%情況下，使用緩沖液調(diào)節(jié)pH 4.0，加入100 U/mg 0.4%的纖維素酶，在提取溫度55 ℃情況下，提取54 min，抽濾后，對粗提取液進(jìn)行稀釋定容，待用。按照1.2.4及1.2.5小節(jié)進(jìn)行原花青素含量的測定及提取率的計算。

1.2.7 單因素試驗

1.2.7.1 加酶量對原花青素提取率的影響

按照料液比1∶20 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，使用緩沖液調(diào)節(jié)pH 4.0，在溫度45 ℃、超聲功率200 W條件下，超聲10 min，酶解1.0 h后，探究加酶量（0.8%，1.0%，1.2%，1.4%和1.6%）對原花青素提取率的影響。

1.2.7.2 超聲功率對原花青素提取率的影響

按照料液比1∶20 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，使用緩沖液調(diào)節(jié)pH 4.0，加入100 U/mg 0.4%的纖維素酶，在45 ℃溫度下，超聲10 min，酶解1.0 h后，探究超聲功率（200，250，300，350和400 W）對原花青素提取率的影響。

1.2.7.3 超聲時間對原花青素提取率的影響

按照料液比1∶20 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，使用緩沖液調(diào)節(jié)pH 4.0，加入100 U/mg 0.4%的纖維素酶，在溫度45 ℃、超聲功率200 W條件下，酶解1.0 h后，探究超聲時間（10，20，30，40和50 min）對原花青素提取率的影響。

1.2.7.4 料液比對原花青素提取率的影響

按照乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，使用緩沖液調(diào)節(jié)pH 4.0，加入100 U/mg 0.4%的纖維素酶，在溫度45 ℃、超聲功率200 W情況下，超聲10 min，酶解1.0 h后，探究料液比（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50 g/mL）對原花青素提取率的影響。

1.2.8 正交試驗

據(jù)單因素試驗結(jié)果，設(shè)計正交試驗，并進(jìn)行平行試驗，測定原花青素含量，進(jìn)行計算分析。

表1 正交因素水平表

1.2.9 驗證試驗

通過正交試驗進(jìn)行極差分析與方差分析，經(jīng)過驗證確定出提取原花青素的最優(yōu)工藝。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理

試驗運用Excel 2016，SPSS 26.0進(jìn)行試驗數(shù)據(jù)的匯總與統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 催化劑選擇

根據(jù)圖2，通過3種提取方法發(fā)現(xiàn)硫酸亞鐵銨溶液作為催化劑的提取率比三氯化鐵溶液硫酸亞鐵銨溶液要高，因此硫酸亞鐵銨溶液的顯色效果比三氯化鐵溶液的顯色效果好。一定量的過渡金屬離子如Mn2+*、Cu2+*、Fe2+*、Fe3+*等能促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行，但過量的醌類及Mn2+*、Cu2+*會降低吸光度，采用3價鐵鹽較為適合，如硫酸亞鐵銨[14]*。因此選擇硫酸亞鐵銨溶液作為顯色劑。

圖2 原花青素提取催化劑的選擇

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)1.2.4小節(jié)的試驗方法，繪制原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到回歸方程y=1.191 4x+0.040 9（x為原花青素標(biāo)準(zhǔn)品濃度，mg/mL；y為吸光度），R2*=0.999 6，接近于1，表明原花青素標(biāo)準(zhǔn)品濃度與吸光度有良好線性關(guān)系，該方程具有可靠性。

圖3 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 提取方法探究結(jié)果分析

2.3.1 研究葡萄籽中原花青素的提取方法

2.3.1.1 研究單一方法提取葡萄籽中原花青素

單一方法提取葡萄籽中原花青素的濃度與提取率結(jié)果見表2。

表2 單一方法提取葡萄籽中原花青素的濃度與提取率

2.3.1.2 研究復(fù)合方法提取葡萄籽中原花青素

為探究提取原花青素更優(yōu)的試驗方法，在3種單一試驗方法的基礎(chǔ)上將其進(jìn)行方法融合，進(jìn)行優(yōu)勢互補，且3種復(fù)合方法與最好單一方法存在顯著性差異（P＜0.05），原花青素提取率順序為酶輔助有機溶劑提取法＞超聲波輔助酶提取法＞超聲波輔助有機溶劑提取法＞超聲波提取法。雖然酶-有機溶劑提取法提取效果比超聲波-有機溶劑提取法好，但其時間長，有機溶劑易揮發(fā)，導(dǎo)致有機溶劑含量減少，造成的試驗誤差大。而超聲波輔助酶提取法，其操作方便，用時相對短，提取效果相對超聲波輔助有機溶劑提取法來說較好。復(fù)合方法提取葡萄籽中原花青素的濃度與提取率結(jié)果見表3。

表3 復(fù)合方法提取葡萄籽中原花青素的濃度與提取率

2.4 單因素試驗

2.4.1 超聲時間對原花青素提取率的影響

由圖4可知，在10～20 min，隨著超聲時間延長，原花青素提取率不斷上升，在20 min后，略有降低，其變動起伏不大，可能是系統(tǒng)誤差造成的，30～40 min時出現(xiàn)明顯上升，隨著超聲時間延長至50 min，提取率呈下降趨勢，此時提取率下降與原花青素的穩(wěn)定性有關(guān)，隨著超聲時間的延長，原花青素的氧化程度增高，導(dǎo)致其提取量下降[16]*，從而導(dǎo)致原花青素提取率降低，故原花青素提取時最佳超聲時間為40 min。

圖4 超聲時間對原花青素提取率的影響

2.4.2 超聲功率對原花青素提取率的影響

由圖5可知，在200～250 W間超聲功率變大時原花青素浸提率上升，在250 W時提取率最高，250 W后提取率下降并在300 W后維持基本不變。超聲清洗機功率變大，有物質(zhì)溶出，與提取物質(zhì)反應(yīng)，導(dǎo)致其降低。故原花青素提取的最適合的超聲功率為250 W。

圖5 超聲功率對原花青素提取率的影響

2.4.3 加酶量對原花青素提取率的影響

由圖6可知，初始隨著加酶量增加，原花青素提取率緩慢上升，當(dāng)加酶量增加至1.2%～1.4%時，原花青素提取率明顯上升，說明纖維素酶濃度增大，植物細(xì)胞壁被破壞的作用變大；酶解完全后，加酶量繼續(xù)增大，溶液不飽和，酶解效果不佳，因此提取率降低。故原花青素提取時最佳加酶量為1.4%。

圖6 加酶量對原花青素提取率的影響

2.4.4 料液比對原花青素提取率的影響

由圖7可知，料液比1∶10 g/mL的提取率明顯高于1∶20 g/mL，這是因為乙醇溶液與葡萄籽粉相互混合，其濃度較高，提取過程中乙醇具有揮發(fā)性，溶劑降低，溶質(zhì)不變，導(dǎo)致提取率高，料液比1∶30 g/mL時提取率最高，隨后呈下降趨勢，并趨于平緩。在一定范圍內(nèi)，提取劑量越大，原花青素提取量越大，但提取劑量過大時反而會影響纖維素酶的催化作用，導(dǎo)致原花青素提取量下降[17]*，故原花青素提取時最佳料液比為1∶30 g/mL。

圖7 料液比對原花青素提取率的影響

2.5 正交試驗

通過上述試驗，選擇對葡萄籽中原花青素浸提率影響較明顯的4個因素（超聲功率、超聲時間、料液比、加酶量），選擇其最優(yōu)的3個水平進(jìn)行正交試驗。

根據(jù)表4，通過極差分析，各因素的順序為C＞B＞A＞D，由此可得出，影響葡萄籽中原花青素提取率的4個因素先后順序為料液比＞超聲時間＞超聲功率＞加酶量，最佳提取工藝是A2B3C3D1或A3B3C3D1。

表4 L9(34*)正交試驗優(yōu)化葡萄籽中原花青素的提取

2.5.1 方差分析

由表5可知，R2*=0.934（調(diào)整后R2*=0.926），其越接近1，試驗越具有可靠性，并且試驗誤差均方為0.002，誤差小，該試驗具有可行性。經(jīng)F檢驗，A、B、C、D這4個單因素都對原花青素提取率的影響極顯著。

表5 正交試驗方差分析結(jié)果

2.5.2 驗證試驗

A2B3C3D1的平均提取率為1.62%，A3B3C3D1的平均提取率為1.38%，P＜0.05，兩者存在顯著差異，因此，最佳的提取工藝為A2B3C3D1，即超聲功率250 W、超聲時間45 min、料液比1∶35 g/mL、加酶量1.3%、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、酶解溫度50 ℃。

3 結(jié)論

通過對比單一方法與復(fù)合方法，復(fù)合方法的提取率要比單一方法提取率高，并且結(jié)合試驗環(huán)境、試驗成本、提取率，選擇超聲波輔助酶提取法提取原花青素，試驗時間短，可節(jié)約試驗成本，提取率較高。由正交試驗可知：影響葡萄籽中原花青素提取率的4個因素先后順序為料液比＞超聲時間＞超聲功率＞加酶量，最佳提取工藝為A2B3C3D1，即超聲功率250 W、超聲時間45 min、料液比1∶35 g/mL、加酶量1.3%、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、酶解溫度50 ℃。進(jìn)行驗證試驗，試驗平行3次求得平均值，原花青素的平均提取率為1.62%，比正交表中最佳提取率提高0.25%。葡萄酒廠廢棄的葡萄籽含有豐富的可利用資源，可用于提取酚類物質(zhì)，并開發(fā)產(chǎn)業(yè)副產(chǎn)品，通過這種方法解決葡萄籽的再利用問題，對葡萄籽的綜合利用具有一定指導(dǎo)意義。