醇酶法提取苦杏仁油工藝優(yōu)化及微膠囊的制備

韓金承，孟鑫*，吳慎威，閆伊狄

錦州醫(yī)科大學(xué)食品與健康學(xué)院（錦州 121000）

苦杏仁為薔薇科植物山杏成熟的種仁，因其含有3%～5%的苦杏仁苷而得名。脫苦后的苦杏仁除含有蛋白質(zhì)、糖等營養(yǎng)物質(zhì)外，還含有約50%的脂肪[1]*?？嘈尤视途哂斜Ｗo(hù)心血管等功效，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。常用油脂提取方法有溶劑萃取法、酶法和超臨界CO2法[2-4]*。溶劑萃取法易造成溶劑殘留；超臨界CO2法對設(shè)備要求高；酶法是利用酶分解包裹油脂的成分，再通過離心得到油脂，該法條件溫和，但易受底物影響；醇酶法是在酶解液中加入適量乙醇，從而促進(jìn)物質(zhì)間的通透性，提高提取率。因此，采用效率更高的醇酶法是苦杏仁油開發(fā)需解決的核心問題。

此外，苦杏仁油在儲存過程中易受光、熱、氧等影響，因此解決苦杏仁油氧化穩(wěn)定性具有實(shí)際應(yīng)用價值。油脂微膠囊是指利用某些兩親物質(zhì)為壁材包埋油脂，再經(jīng)過干燥技術(shù)，得到結(jié)構(gòu)類似膠囊的粉末。研究表明，微膠囊化可以延緩油脂的氧化進(jìn)程[5-6]*。

試驗(yàn)采用醇酶法為提取工藝，以油脂得率為評價指標(biāo)，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、酶添加量、酶解時間、料液比對油脂得率的影響，利用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝并驗(yàn)證結(jié)果；以所得苦杏仁油為芯材，大豆分離蛋白和環(huán)狀糊精為壁材，采用真空冷凍干燥技術(shù)制得苦杏仁油微膠囊，對所得微膠囊進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)掃描，以鑒定包埋效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦杏仁（錦州中藥材市場）；堿性蛋白酶（酶活20萬 U/g，南寧龐博生物工程有限公司）；β-環(huán)狀糊精（食品級，河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司）；大豆分離蛋白（食品級，河南興源化工產(chǎn)品有限公司）；改性大豆磷脂（食品級，武漢曙爾生物科技有限公司）；無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

UC-9600型超聲波清洗機(jī)（深圳市朗杰超聲電器有限公司）；PHS-3C型pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；H01-2A型磁力攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司）；TDL-5-A型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；GJB2000-25型均質(zhì)機(jī)（常州市超力均質(zhì)泵廠）；TF-FD-27S普通型真空冷凍干燥機(jī)（上海田楓實(shí)業(yè)有限公司）；DHG-9140型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；Sigma300型掃描電子顯微鏡（德國卡爾蔡司公司）；XSP-BM-13CS型數(shù)碼落射熒光顯微鏡（德國徠卡公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 苦杏仁的預(yù)處理

將苦杏仁投入沸水中保溫10 min后取出脫皮，按照料液比1∶12（g/mL）加入蒸餾水后進(jìn)行超聲處理60 min（55 ℃，300 W），取出后在100 ℃鼓風(fēng)干燥機(jī)中干燥至恒重[7-8]*。

1.3.2 苦杏仁油的提取

將預(yù)處理過的苦杏仁粉碎后，用網(wǎng)眼直徑0.425 mm的網(wǎng)篩篩選，按照料液比1∶7（g/mL）加入體積分?jǐn)?shù)20%的乙醇溶液混勻，調(diào)溶液pH 9.5，向溶液中加入3.5%的堿性蛋白酶并混勻，在45 ℃，750 r/min條件下磁力攪拌酶解130 min，結(jié)束后將溶液置于90 ℃水浴鍋中水浴滅酶并揮發(fā)乙醇10 min，滅酶后的溶液在4 000 r/min條件下離心15 min，吸出油層，得到苦杏仁油[9]*?？嘈尤视偷寐视?jì)算方法見式（1）。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

以苦杏仁油得率為評價指標(biāo)，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、酶添加量、酶解時間、料液比之間不同配比對苦杏仁油得率的影響，各因素具體變量見表1。固定條件：苦杏仁粉直徑≤0.425 mm、酶解pH 9.5、磁力攪拌條件750 r/min（45 ℃）、滅酶條件90 ℃（10 min）、離心條件4 000 r/min（15 min）。

表1 苦杏仁油提取單因素試驗(yàn)條件

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8.0.6.1軟件的Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原則，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上以苦杏仁油得率為評價指標(biāo)進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化分析，試驗(yàn)因素水平見表2。

表2 苦杏仁油提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平

1.3.5 苦杏仁油微膠囊的制備

壁材溶液：將β-環(huán)狀糊精與大豆分離蛋白按照3∶1（m/m）比例混合后加入16倍的蒸餾水，在60℃，800 r/min條件下磁力攪拌至壁材溶解均勻。

芯材溶液：苦杏仁油中加入2%的改性大豆磷脂，攪拌均勻后在60 ℃水浴鍋中烊化20 min。

微膠囊制備：將芯材按照1∶80（g/mL）比例加入到壁材溶液中，在60 ℃，300 W條件下超聲乳化處理20 min，在60 ℃，1 000 r/min條件下磁力攪拌30 min，結(jié)束后在25 MPa的條件下高壓均質(zhì)，得微膠囊乳狀液；將所得乳狀液倒入冷凍干燥物料盤中，高度≤1 cm，在-18 ℃條件下保存12 h，取出后在-80 ℃，1 Pa條件下冷凍干燥12 h，得苦杏仁油微膠囊[10-11]*。

1.3.6 微膠囊包埋率計(jì)算

稱取微膠囊粉末于漏斗中，用石油醚反復(fù)濾洗3次洗去表面油，烘干至恒重，采用索氏提取法抽提濾洗后的微膠囊中油脂。按照式（2）計(jì)算苦杏仁油微膠囊的包埋率。

式中：m1為微膠囊制備前苦杏仁油質(zhì)量，g；m2為微膠囊提取得到的苦杏仁油質(zhì)量，g。

1.3.7 苦杏仁油微膠囊微觀結(jié)構(gòu)觀察

取適量的微膠囊置導(dǎo)電膠上，在真空鍍膜機(jī)中噴金后固定在樣品臺上，放入顯微鏡腔室中觀察不同倍數(shù)下微膠囊的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察[12]*。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)類的試驗(yàn)均作3次，數(shù)據(jù)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，結(jié)果表現(xiàn)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式；折線圖采用Origin Pro 9制作；響應(yīng)面法分析采用Design-Expert 8.0.6.1軟件的Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

乙醇體積分?jǐn)?shù)、酶添加量、酶解時間、料液比4個條件對于苦杏仁油的得率具有直接的影響作用。乙醇可以影響細(xì)胞壁的通透性，酶添加量是反應(yīng)發(fā)生的主要條件，酶解時間決定反應(yīng)是否完全，料液比的不同決定整個反應(yīng)體系物質(zhì)間接觸發(fā)生反應(yīng)的速率[13]*。因此選取這4個條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)，為響應(yīng)面優(yōu)化作基礎(chǔ)。苦杏仁油提取單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 單因素條件下苦杏仁油得率對比

結(jié)果表明，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，苦杏仁油得率呈現(xiàn)先升高再降低的變化趨勢，乙醇體積分?jǐn)?shù)20%時，苦杏仁油得率達(dá)到最高值37.07%。體積分?jǐn)?shù)適宜的乙醇溶液有助于提高酶分解蛋白的能力，但高體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液會降低酶活力，使得酶解能力降低，降低油脂得率。隨著酶添加量的增加，苦杏仁油得率呈現(xiàn)先升高再降低的變化趨勢，酶添加量3.5%時，苦杏仁油得率達(dá)到最高值24.43%。酶添加量越高，分解蛋白的含量越多，但分解過多的蛋白也會乳化得到的苦杏仁油，使得油脂得率降低。隨著酶解時間的延長，苦杏仁油得率呈現(xiàn)先升高再略降低的變化趨勢，酶解時間150 min時，苦杏仁油得率達(dá)到最高值35.94%。酶解反應(yīng)充分發(fā)生后，進(jìn)一步延長反應(yīng)時間對油脂得率無促進(jìn)作用，甚至游離的蛋白質(zhì)會乳化部分苦杏仁油，使得油脂得率略降低。隨著料液比中液體占比的增加，苦杏仁油得率呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，料液比1∶8（g/mL）時，苦杏仁油得率達(dá)到最高值30%。料液比影響底物之間接觸概率，溶液含量過多時，底物之間的接觸概率低，影響反應(yīng)發(fā)生，使得苦杏仁油得率降低[14-15]*。綜上，將乙醇體積分?jǐn)?shù)、酶添加量、酶解時間、料液比分別控制為20%，3.5%，150 min和1∶8（g/mL）。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 模型的建立與結(jié)果

結(jié)合單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以苦杏仁油得率（Y）作為響應(yīng)值，將乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、酶添加量（B）、酶解時間（C）、料液比（D）作為自變量，采用Design-Expert 8.0.6.1軟件的Box-Behnken中心組合進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，苦杏仁油得油率結(jié)果分別見表3。對表3中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到當(dāng)前條件下苦杏仁油得油率與各因素間的二次多項(xiàng)回歸方程式：Y=38.43+1.89A+0.18B-1.81C+0.84D+2.03AB+2.84AC-0.47AD-0.38BC-0.23BD-1.59CD-5.4A2*-5.99B2*-5.22C2*-9.15D2*。

表3 苦杏仁油提取響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

方差分析結(jié)果見表4。模型P值小于0.000 1，說明模型極顯著，P值的大小是衡量所建立模型中各個因素顯著的指標(biāo)，P值越小表明試驗(yàn)?zāi)Ｐ统霈F(xiàn)極端結(jié)果的概率越低，試驗(yàn)方法可靠；模型失擬項(xiàng)的P值為0.123 0（＞0.05），說明模型差異不顯著，證明該方程與試驗(yàn)失擬較小，結(jié)果能更好地反映試驗(yàn)的真實(shí)性；回歸模型的R2*和Radj2*為0.979 6和0.959 2，R2*和Radj2*的值越接近1，表明模型呈線性回歸，擬合效果好，可用于分析與計(jì)算[16]*；由F值可知，單因素對苦杏仁油得率的影響順序?yàn)锳＞C＞D＞B。

表4 苦杏仁油得率二次模型方差分析

2.2.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面曲線圖反映2個因素之間交互作用的變化幅度，如果2個因素之間交互作用明顯，則曲面越陡；等高線反映2個因素之間交互作用的顯著情況，如果2個因素之間交互作用顯著，則越趨近橢圓形[17]*。苦杏仁油得率A、B、C、D因素之間兩兩組合相互作用的響應(yīng)面分析見圖2。

圖2 兩兩組合相互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖

根據(jù)各因素相互影響的曲面圖可以看出，各因素兩兩組合之間均產(chǎn)生較明顯的交互影響，2個因素之間其中一個因素條件變化均會對另一個條件產(chǎn)生影響；根據(jù)等高線圖可以看出，各因素兩兩組合之間的等高線呈現(xiàn)出橢圓形，說明2個因素之間交互影響顯著。與P值結(jié)合可以看出，兩兩因素交互作用顯著程度從大到小的順序?yàn)锳C＞AB＞CD＞AD＞BC＞BD。

2.2.3 最優(yōu)條件的預(yù)測與驗(yàn)證

結(jié)合回歸模型優(yōu)化后得到醇酶法提取苦杏仁油最佳工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)20.71%、酶添加量3.52%、酶解時間147.11 min、料液比1∶8.05（g/mL），預(yù)測結(jié)果為38.717 2%。結(jié)合預(yù)測結(jié)果采用條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)20.5%、酶添加量3.5%、酶解時間147 min、料液比1∶8（g/mL），進(jìn)行3次平行試驗(yàn)驗(yàn)證模型準(zhǔn)確性，最終苦杏仁油平均得率為39.11%±0.21%，結(jié)果符合預(yù)測值。

2.3 微膠囊包埋率及微觀結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 微膠囊包埋率評價

以β-環(huán)狀糊精和大豆分離蛋白為壁材進(jìn)行苦杏仁油微膠囊制備，經(jīng)過試驗(yàn)測得微膠囊平均包埋率達(dá)到82.89%±0.37%，說明微膠囊在制備過程中制備效率高，所浪費(fèi)苦杏仁油較少，可應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中。

2.3.2 微膠囊電子顯微鏡掃描結(jié)果

顆粒立體結(jié)構(gòu)大小適宜且分散均勻的微膠囊有利于貯存及消化過程中控釋；壁材表面完整性和致密性的顆粒對于芯材具有重要的保護(hù)作用。不同倍數(shù)下微膠囊結(jié)構(gòu)見圖3。

圖3 不同分辨率微膠囊形貌

由掃描結(jié)果可以看到，干燥后物質(zhì)整體呈現(xiàn)出干燥且分散的狀態(tài)，此種狀態(tài)下的顆粒有利于長時間貯藏。主要有2種大小的顆粒，小顆粒可能是部分被超聲波空化后產(chǎn)生的壁材碎屑和乳化劑干燥后產(chǎn)生的；觀察較大顆?？梢钥吹筋w粒呈現(xiàn)明顯且完整的立體結(jié)構(gòu)，初步判斷微膠囊包埋成功。在微膠囊表面呈現(xiàn)細(xì)微裂痕，這可能是由于水分子在冷凍時形成冰晶體，不規(guī)則的冰晶體升華時刺破微膠囊表面后形成。除此之外微膠囊表面較為致密，說明微膠囊對于苦杏仁油可以起到隔絕氧氣、光照等不利條件；顆粒大小均勻，表明微膠囊在消化吸收過程中，其中的苦杏仁油可以呈現(xiàn)勻速的釋放[18]*。

2.3.3 熒光顯微鏡掃描結(jié)果

熒光顯微鏡觀察是指通過發(fā)射特定波長來使有機(jī)物質(zhì)產(chǎn)生熒光反應(yīng)，從而觀察物質(zhì)的形態(tài)及分散情況[19]*。熒光顯微鏡掃描結(jié)果見圖4。

圖4 熒光顯微鏡掃描結(jié)果

根據(jù)掃描結(jié)果可以看到，微膠囊顆粒中呈現(xiàn)一定的熒光反應(yīng)，表明苦杏仁油被成功包埋進(jìn)了壁材中。微膠囊表面呈現(xiàn)較好的密封性，顆粒與顆粒之間較為分散，無粘連、漏油等不良情況，每個顆粒相當(dāng)于一個獨(dú)立個體，使得微膠囊在儲存過程中顆粒之間相互影響較小，有利于延長儲存期。芯材與壁材貼合度較高，說明包埋的苦杏仁油含量較為豐富。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化苦杏仁油的制備工藝，最佳條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)20.5%、酶添加量3.5%、酶解時間147 min、料液比1∶8（g/mL），苦杏仁油平均得率為39.11%±0.21%，符合預(yù)測值。采用真空冷凍干燥法制備苦杏仁油微膠囊，微觀結(jié)構(gòu)掃描發(fā)現(xiàn)呈現(xiàn)較好的立體結(jié)構(gòu)并存在熒光反映，表明苦杏仁油成功被包埋成微膠囊。該試驗(yàn)為苦杏仁油的提取及利用提供一定數(shù)據(jù)支撐，從而在提高苦杏仁資源利用率提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。