植物精油微膠囊的制備及其抑菌性能研究

孟一，張玉華 *，陳東杰 ，王琪

1. 國家農(nóng)產(chǎn)品現(xiàn)代物流工程技術(shù)研究中心（濟(jì)南 250103）；2. 山東商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院山東省農(nóng)產(chǎn)品貯運(yùn)保鮮技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（濟(jì)南 250103）；3. 山東國農(nóng)物流科技有限公司（濟(jì)南 250103）

植物精油作為一種無毒、無害、純天然成分，具有較好的抑菌作用和抗氧化作用，在食品保鮮領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。但植物精油性質(zhì)不穩(wěn)定，易揮發(fā)，水溶性差且有刺激性氣味，在一定程度上限制了其開發(fā)應(yīng)用[1-2]*。微膠囊技術(shù)可以減少外界環(huán)境對精油中活性成分的影響，提高其穩(wěn)定性，達(dá)到緩釋、持久的抑菌作用[3-5]*。β-環(huán)糊精借助其獨(dú)特的外親水內(nèi)疏水空腔化學(xué)結(jié)構(gòu)，與精油小分子形成包合物，起到保護(hù)和緩釋作用，并使精油的水溶性增加[6-7]*。有學(xué)者對β-環(huán)糊精-植物精油微膠囊制備開展廣泛研究，并取得一系列成果[8-10]*?；羯荷旱萚11]*以β-環(huán)糊精為壁材、肉桂-山蒼子復(fù)合精油為芯材，采用分子包埋法制備微膠囊，通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到的微膠囊包埋率為67.12%。殷誠等[12]*采用正交試驗(yàn)優(yōu)化得到β-環(huán)糊精-牛至精油微膠囊的工藝：攪拌時(shí)間3 h、牛至精油與乙醇體積比1∶5、攪拌溫度60 ℃，包埋率為55.14%。王冰清等[13]*以獼猴桃籽油為芯材、β-環(huán)糊精為壁材，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化制備條件，產(chǎn)率為79.33%，經(jīng)微膠囊化處理的獼猴桃籽油過氧化值上升幅度緩慢，貯藏穩(wěn)定性明顯提升。趙保堂等[14]*通過響應(yīng)面法制備β-環(huán)糊精-棗花精油微膠囊，包埋得率為75.15%±0.24%，與預(yù)測值接近。

對于β-環(huán)糊精-百里香精油微膠囊的研究鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。試驗(yàn)以假單胞菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌為目標(biāo)菌，測定14種植物精油的抑菌圈，篩選出抑菌性最強(qiáng)的百里香精油為芯材，以β-環(huán)糊精為壁材，通過響應(yīng)面法優(yōu)化微膠囊制備條件，并測定微膠囊的抑菌性能，以期為植物精油的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦茶油、甘草油、橘子油、廣藿香油、姜花油、大蒜油、肉桂油、百里香精油、丁香精油、沙棘籽油、洋蔥油、高良姜油、依蘭油、山雞椒油（吉安市中香天然植物有限公司）；β-環(huán)糊精、無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC25922、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC27853、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC6538（上海保藏生物技術(shù)中心）；假單胞菌（Pseudomonas）ACCC 01056：中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心；MHA培養(yǎng)基（Mueller-Hinton Agar）、MHB培養(yǎng)基（Mueller-Hinton Broth）：青島海博生物技術(shù)有限公司。

T9S紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；K9840自動凱氏定氮儀（北京海能泰克商貿(mào)有限公司）；CR-400色差計(jì)（杭州柯盛行儀器有限公司）；Scientz-04z均質(zhì)器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DL-CJ-2N型超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；YXQ-LS-30S11高壓滅菌鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液的制備

按照陳悅等[15]*的方法制備。在無菌條件下，取4個(gè)菌株分別接種至MHB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，在MHA培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)24 h后，挑取典型單個(gè)菌落接種至MHB培養(yǎng)基中培養(yǎng)18～24 h后，菌液于5 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集菌體后棄去上清液，用0.9%無菌生理鹽水重懸，調(diào)節(jié)菌懸液濃度至106*CFU/mL，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 植物精油稀釋液的制備

將14種植物精油用無水乙醇稀釋配制成質(zhì)量濃度為500 mL/L的樣品溶液，以溶劑無水乙醇為空白對照，試驗(yàn)前所有樣品均用0.22 μm濾膜過濾除菌，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 抑菌圈的測定

采用濾紙片瓊脂平板擴(kuò)散法，在無菌條件下，將已滅菌并冷卻至45 ℃左右的MHA培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，水平放置凝固后，分別吸取200 μL菌懸液均勻涂布于平板上。分別吸取20 μL各種精油滴于無菌濾紙片上（d=6 mm），充分吸收后，將其貼在已涂布菌液的培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24 h后，采用十字交叉法量取抑菌圈直徑，取其平均值作為測定結(jié)果。按照抑菌圈直徑判斷精油抑菌性：抑菌圈直徑＞20 mm，高度敏感；10～20 mm，中度敏感；6～10 mm，低度敏感。

1.2.4 百里香精油標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將百里香精油用無水乙醇稀釋至不同濃度，進(jìn)行全波長掃描，確定百里香精油的最大吸收波長。準(zhǔn)確量取25 mL百里香精油至250 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，搖勻后得到100 mL/L的百里香精油-乙醇標(biāo)準(zhǔn)稀釋液。從容量瓶中分別精確量取10，20，30，40和50 mL溶液于100 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，搖勻后得到10，20，30，40和50 mL/L的百里香精油-乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。以無水乙醇為空白對照，在最大吸收波長處測定不同濃度百里香精油溶液的吸光度，重復(fù)3次，取平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得百里香精油濃度（c）與吸光度（A）的線性回歸方程。

1.2.5 微膠囊的制備

按照Huang等[16]*的方法制備，略有改動。取適量β-環(huán)糊精，在60 ℃下用蒸餾水溶解，邊溶解邊攪拌直至形成β-環(huán)糊精飽和溶液；取適量百里香精油，溶于無水乙醇中。按照一定壁材芯材質(zhì)量比例（壁芯比）逐滴加至β-環(huán)糊精飽和溶液中；不斷攪拌使精油與β-環(huán)糊精混合均勻，加入2～3滴吐溫-80乳化劑，分散20 min后混合液在一定溫度下攪拌一定時(shí)間；待溶液冷卻至室溫后，于0～4 ℃冰箱靜置，固化24 h；用真空泵減壓抽濾，得到的濾渣用無水乙醇洗滌3次，洗去未包合的β-環(huán)糊精和精油，得到濕態(tài)微膠囊。將濕態(tài)微膠囊置于表面皿上，在50 ℃烘箱中干燥至恒重，得到干態(tài)微膠囊。

1.2.6 包埋率的測定

參考石春韜等[17]*的方法測定，略有改動。包埋率按式（1）計(jì)算。

微膠囊表面精油（g）的測定：取一定量的微膠囊，用無水乙醇充分洗滌過濾，濾液用無水乙醇定容，在最大吸收波長下測定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出微膠囊表面精油的含量。平行做3組，計(jì)算平均值。

微膠囊總精油（g）的測定：取適量的微膠囊，用少量水溶解后，加入過量無水硫酸鈉吸去水分，冷卻至常溫，用無水乙醇萃取精油、過濾，濾液用無水乙醇定容，在最大吸收波長下測定其吸光度并計(jì)算精油含量。平行做3組，計(jì)算平均值。

1.2.7 單因素試驗(yàn)

分別考察壁芯比、包合時(shí)間、包合溫度對微膠囊包埋率的影響，通過單因素試驗(yàn)確定各因素的最佳水平范圍。

1.2.7.1 壁芯比的確定

壁芯比分別為2∶1，4∶1，6∶1，8∶1和10∶1（g/g），包合時(shí)間2 h，包合溫度40 ℃。

1.2.7.2 包合時(shí)間的確定

包合時(shí)間分別為0.5，1.0，2.0，3.0和4.0 h，壁芯比6∶1（g/g），包合溫度40 ℃。

1.2.7.3 包合溫度的確定

包合溫度分別為20，30，40，50和60 ℃，壁芯比6∶1（g/g），包合時(shí)間2 h。

1.2.8 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken模型設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以壁芯比（A）、包合時(shí)間（B）和包合溫度（C）3個(gè)影響因素為自變量，以精油包埋率為響應(yīng)值（Y），Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平

1.2.9 微膠囊抑菌性的測定

按照微膠囊中百里香精油凈含量相同，分別取0.2 g濕態(tài)微膠囊、0.09 g干態(tài)微膠囊。將0.2 g濕態(tài)微膠囊與1 mL濃度約106*CFU/mL的菌懸液一起加入10 mL無菌水中，于恒溫?fù)u床150 r/min培養(yǎng)24 h，并通過2倍稀釋法得到不同濃度梯度，取1 mL均勻涂布于平板，培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)，同時(shí)以不含微膠囊的無菌水為空白對照，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行。將106*CFU/mL菌懸液按照相同方法稀釋并涂布平板，將干態(tài)微膠囊組裝入無菌透氣聚酯纖維袋中，并將袋子固定在平板蓋內(nèi)側(cè)，使其不與固體培養(yǎng)基接觸，培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。抑菌率按式（2）計(jì)算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design-ExpertV 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面分析，采用OriginPro 8.5軟件繪圖，采用SPSS Statistics 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Duncan多重比較法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物精油抑菌性的篩選

14種精油對4種菌的抑菌圈如表2所示。不同植物精油對4種菌的敏感性不同，百里香精油對4種菌高度敏感，根據(jù)抑菌圈直徑，其對4種菌的敏感性依次為金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞假單胞菌＞銅綠假單胞菌。肉桂油對大腸桿菌高度敏感，對其余3種菌中度敏感；丁香精油、高良姜油對4種菌中度敏感；大蒜油對金黃色葡萄球菌高度敏感，對銅綠假單胞菌中度敏感；姜花油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌中度敏感；苦茶油對金黃色葡萄球菌中度敏感。根據(jù)精油對4種菌的敏感程度，選擇抑菌作用最強(qiáng)的百里香精油作為芯材，制備微膠囊。

表2 植物精油對4種菌的抑菌圈直徑（x±s，n=3）單位：mm

2.2 百里香精油標(biāo)準(zhǔn)曲線

經(jīng)紫外-可見光全波長掃描，確定百里香精油最大吸收波長276 nm，以百里香精油濃度為橫坐標(biāo)，276 nm處對應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。通過線性擬合得到10～50 mL/L范圍內(nèi)百里香精油濃度與吸光度之間的線性回歸方程：y=0.109 5x-0.019 3，R2*=0.996 4，線性關(guān)系良好，可用于預(yù)測百里香精油濃度。

圖1 百里香精油標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 壁芯比對包埋率的影響

壁芯比對百里香精油微膠囊包埋率的影響如圖2所示。隨壁芯比增加，包埋率上升，壁芯比8∶1（g/g）時(shí)，包埋率較高（71.3%），繼續(xù)增加壁芯比至10∶1（g/g），包埋率無顯著變化。原因可能是壁材對芯材的包合是一個(gè)動態(tài)過程，壁材分子越多，能為芯材分子提供的空腔越多，成功包合的概率越大，但當(dāng)壁材分子過多時(shí)，導(dǎo)致包合空間的擁擠反而不利于包合，使包埋率下降[18]*。因此，選擇壁芯比6∶1，8∶1和10∶1（g/g）進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖2 壁芯比對包埋率的影響

2.3.2 包合時(shí)間對包埋率的影響

由于微膠囊的形成過程是百里香精油分子進(jìn)入β-環(huán)糊精空腔內(nèi)，兩者借助疏水鍵及范德華力等作用形成包合物，因此，包合時(shí)間影響包合物的形成[19]*。由圖3可見，包合0.5 h時(shí)包埋率很低，為48.5%。隨包合時(shí)間延長，包埋率升高，1～2 h時(shí)包埋率達(dá)67.7%～71.2%，1 h和2 h間無顯著差異。再延長包合時(shí)間，包埋率反而下降，3～4 h時(shí)包埋率61.0%～62.4%，且3 h和4 h間無顯著差異。這是由于包合過程為動態(tài)過程，達(dá)到動態(tài)平衡時(shí)，包合與解離速率相等，繼續(xù)攪拌，解離速率大于包合速率，包合率下降[20]*，因此，選擇包合時(shí)間1，2和3 h為響應(yīng)面試驗(yàn)的3個(gè)水平。

圖3 包合時(shí)間對包埋率的影響

2.3.3 包合溫度對包埋率的影響

包合溫度對包埋率的影響結(jié)果見圖4，隨著包合溫度升高，包埋率先增大后減小，30～50 ℃時(shí)包埋率較高，為66.4%～71.3%，且無顯著差異。繼續(xù)升高溫度，包埋率下降，這與石春韜等[17]*研究的肉桂油-β-環(huán)糊精微膠囊結(jié)果相似，原因可能是精油-β-環(huán)糊精微膠囊形成過程為放熱反應(yīng)[21-22]*，過高的溫度會導(dǎo)致該反應(yīng)逆向進(jìn)行，另外高溫造成百里香精油揮發(fā)加快，包埋率下降。因此，包合溫度選擇30，40和50 ℃作為響應(yīng)面試驗(yàn)的3個(gè)水平。

圖4 包合溫度對包埋率的影響

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗(yàn)結(jié)果（表3）進(jìn)行回歸分析，并進(jìn)行二項(xiàng)式擬合和多元線性回歸法處理，得到百里香精油-β-環(huán)糊精微膠囊各考察因素的一次效應(yīng)、二次效應(yīng)及其交互效應(yīng)的實(shí)際因素關(guān)聯(lián)方程：Y=-397.28+48.42A+87.16B+8.62C-5.00AB+0.27AC-0.16BC-2.84A2*-11.73B2*-0.13C2*。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果

為驗(yàn)證方程的有效性，對回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。二次多項(xiàng)式擬合模型的P值為0.000 4＜0.01，差異性極顯著，表明方程可能由于外界原因?qū)е屡c實(shí)際結(jié)果有差異的概率為0.05%。失擬項(xiàng)F值為5.22，P值為0.072 2，失擬項(xiàng)不顯著，表明在試驗(yàn)范圍內(nèi)，該模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合性較好。調(diào)整決定系數(shù)Radj2*為0.909 1，表明微膠囊包埋率的變化源于壁芯比、包合時(shí)間、包合溫度的可能性為90.91%。因此，該回歸方程可以很好地描述各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系。

表4 微膠囊包埋率回歸模型的方差分析

根據(jù)一次項(xiàng)的F值可知：各試驗(yàn)因素對響應(yīng)值影響的主次順序?yàn)锳＞B＞C，即壁芯比＞包合時(shí)間＞包合溫度，其中，一次項(xiàng)A、B對響應(yīng)值影響均極顯著（P＜0.01）。交互項(xiàng)中AB項(xiàng)對響應(yīng)值影響極顯著（P＜0.01），AC項(xiàng)對響應(yīng)值影響顯著（P＜0.05），BC項(xiàng)對響應(yīng)值影響不顯著，表明A、B間有極強(qiáng)交互作用，A、C間有交互作用，B、C間無交互作用，二次項(xiàng)A2*、B2*和C2*對響應(yīng)值影響均極顯著（P＜0.01）。

2.4.2 響應(yīng)面圖形分析

壁芯比、包合時(shí)間和包合溫度各因素交互作用對百里香精油-β-環(huán)糊精微膠囊包埋率影響的等高線與響應(yīng)面圖如圖5所示。等高線圖與響應(yīng)面圖能直觀地反映試驗(yàn)因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系及兩因素間的交互作用，等高線的形狀可反映兩因素間交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用較強(qiáng)，圓形表示交互作用較弱。圖5（a1和b1）中的等高線接近橢圓形，說明壁芯比-包合時(shí)間、壁芯比-包合溫度交互作用顯著，圖5（c1）中的等高線接近圓形，說明包合時(shí)間-包合溫度交互作用不顯著。響應(yīng)面圖的坡度反映因素對響應(yīng)值的影響，坡度越大，說明因素的變化對響應(yīng)值影響越大，兩因素交互作用越顯著。圖5（a2和b2）中曲面坡度大，說明壁芯比、包合時(shí)間，以及壁芯比、包合溫度兩因素對包埋率影響大，且兩者交互作用顯著。圖5c2中包合溫度對包埋率影響不大，包合時(shí)間-包合溫度交互作用不顯著。圖形反映的結(jié)果與2.4.1的分析結(jié)果一致。

圖5 壁芯比、包合時(shí)間與包合溫度的交互作用對微膠囊包埋率影響的等高線與響應(yīng)面圖

2.4.3 參數(shù)優(yōu)化與驗(yàn)證

根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件分析和數(shù)據(jù)優(yōu)化，得到百里香精油-β-環(huán)糊精微膠囊制備最優(yōu)條件：壁芯比9.26∶1（g/g）、包合時(shí)間1.45 h、包合溫度42.16℃，包埋率預(yù)測值為72.86%±2.01%。考慮到實(shí)際的可操作性，將參數(shù)修正為壁芯比9.3∶1（g/g）、包合時(shí)間1.5 h、包合溫度42 ℃。為進(jìn)一步驗(yàn)證響應(yīng)面模型的可靠性，采用上述最優(yōu)參數(shù)進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，包埋率實(shí)測值為71.01%±1.21%，兩者相對誤差2.61%，說明響應(yīng)面法建立的模型可靠。

2.5 微膠囊抑菌率測定結(jié)果

由表5可見，百里香精油凈含量相同的干態(tài)與濕態(tài)微膠囊對4種菌的抑菌率不同，對金黃色葡萄球菌抑菌率最高，其次是大腸桿菌，抑菌率最低的是假單胞菌和銅綠假單胞菌，且兩者無顯著差異，該結(jié)果與百里香精油對4種菌的抑菌圈大小一致。干態(tài)微膠囊抑菌率均極顯著低于濕態(tài)（P＜0.01），原因可能是干態(tài)微膠囊未與細(xì)菌充分接觸，依靠緩慢釋放出的精油抑制細(xì)菌生長繁殖，被包合的百里香精油在短時(shí)間內(nèi)不能完全釋放。

表5 微膠囊對4種菌的抑菌率 單位：%

3 結(jié)論

以抑菌性較強(qiáng)的百里香精油作為芯材，以β-環(huán)糊精為壁材制備微膠囊。響應(yīng)面法優(yōu)化的最佳條件為壁芯比9.3∶1（g/g）、包合時(shí)間1.5 h、包合溫度42 ℃，此條件下微膠囊包埋率為71.01%±1.21%，方差分析表明模型擬合良好，驗(yàn)證試驗(yàn)證明百里香精油-β-環(huán)糊精微膠囊制備工藝可行。精油凈含量相同的干態(tài)與濕態(tài)微膠囊對金黃色葡萄球菌抑菌率最高，其次是大腸桿菌，最低的是假單胞菌和銅綠假單胞菌，且干態(tài)微膠囊抑菌率均極顯著低于濕態(tài)（P＜0.01）。試驗(yàn)結(jié)果為精油微膠囊的研制提供一定理論依據(jù)，對促進(jìn)植物精油的開發(fā)利用具有重要意義。