超聲波協(xié)同離子液體預處理對酒糟纖維素酶解的影響

雷玉立，曾凱，龍艷，范春泉，金建*，陳文浩

1. 西南科技大學生命科學與工程學院（綿陽 621010）；2. 固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室（宜賓 644000）；3. 西南科技大學經(jīng)濟管理學院（綿陽 621010）

酒糟是固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)白酒的主要副產(chǎn)物[1]*，富含各種營養(yǎng)物質(zhì)，其中纖維素干基含量高達20%～30%，如果不及時處理，就會腐爛、惡化環(huán)境[2]*。酒糟纖維素對于動物來說適口性不佳，營養(yǎng)成分很難被消化吸收[3]*。此外，纖維素具有復雜緊密結(jié)構(gòu)，很難被降解。因此，探究如何高效降解酒糟中纖維素，開辟酒糟利用的新途徑，對于人類生產(chǎn)、環(huán)境保護、資源利用等具有積極作用。

關(guān)于酒糟的研究主要集中在蛋白飼料開發(fā)，制取沼氣、生物乙醇，造紙和化工原料和提取纖維素等[4-5]*。國內(nèi)相關(guān)研究已取得一定成效。離子液體預處理可以破壞纖維素的晶體結(jié)構(gòu)[6]*、降低纖維素的結(jié)晶度和聚合度[7]*。超聲波可以強化傳質(zhì)。柯巧媚等[8]*研究發(fā)現(xiàn)超聲波預處理能促進酒糟纖維素酶解，纖維素轉(zhuǎn)化率較未處理的提高35.4%。Yu等[9]*研究發(fā)現(xiàn)超聲可以破壞稻殼的表面結(jié)構(gòu)，從而提高酶解效率。這些方法在一定程度上可以促進纖維素的降解，但效果有待改進。因此，此次試驗擬探尋酒糟纖維的高效酶解方法，助力“雙碳”目標的實現(xiàn)。

以纖維素轉(zhuǎn)化率作為考察指標，研究超聲波處理溫度、超聲波功率密度、超聲波處理時間、超聲波工作間歇比對酒糟纖維素轉(zhuǎn)化率的影響，并采用正交試驗優(yōu)化得出最佳參數(shù)，以期為酒糟纖維的高效酶解提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酒糟丟糟（水分4.86%、總灰分10.3%、粗纖維31.96%、可溶性糖5.82%、粗脂肪10.95%、粗蛋白26.45%，四川沱牌集團有限公司）；纖維素酶（50 000 U/g，上海源葉生物科技有限公司）；1-丁基，3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（[BMIM]PF6，上海成捷化學有限公司）；葡萄糖（CP，成都市金山化學試劑有限公司）；檸檬酸、磷酸氫二鈉（均為AR，成都市金山化學試劑有限公司）；酒石酸鉀鈉、3, 5-二硝基水楊酸（均為AR，成都市科隆化學有限公司）。

FA2004N分析天平（上海菁海儀器有限公司）；BILON-1000CT多用途恒溫超聲波提取機（上海比朗儀器制造有限公司）；Eppendorf離心機（艾本德中國有限公司）；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市金壇華特實驗儀器有限公司）；725紫外可見分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程與試驗步驟

鮮酒糟→前處理→超聲波協(xié)同離子液體處理→離子液體回收→殘渣→添加緩沖溶液→纖維素酶解→沸水浴滅酶→離心→上清液定容→DNS比色法測定還原糖含量→計算纖維素轉(zhuǎn)化率

稱取0.1 g酒糟至真空包裝袋中，按料液比1∶50（g/mL）加入離子液體[BMIM]PF6，封口后在設(shè)定的參數(shù)下進行超聲波協(xié)同離子液體預處理。預處理完成后，將離子液體和酒糟混合物轉(zhuǎn)移至離心管中，以5 000 r/min離心10 min，回收上層離子液體，水洗沉淀2次，按料液比1∶20（g/mL）用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液（pH 5.4）將酒糟轉(zhuǎn)移至試管中并置于50 ℃恒溫水浴鍋中，預熱至50 ℃后，按酶底比990 U/g加入纖維素酶，振蕩酶解140 min，酶解結(jié)束后立即放入沸水浴中煮沸10 min，滅酶結(jié)束后，冷卻，以5 000 r/min離心10 min，將上清液定容至10 mL。取5 mL上清液于比色管中，加入2 mL DNS試劑，用蒸餾水補齊至10 mL，振蕩搖勻，沸水浴反應(yīng)5 min后立即冰浴冷卻至室溫，并在540 nm測定吸光度，根據(jù)葡萄糖含量標準曲線得出還原糖含量，并計算纖維素轉(zhuǎn)化率。

1.2.2 單因素試驗設(shè)計

1.2.2.1 超聲波功率密度對酒糟纖維素酶解效果的影響

按照1.2.1的步驟對酒糟纖維素進行超聲波預處理和酶解，固定超聲波工作間歇比5∶3（s/s）、超聲波處理溫度60 ℃、超聲波處理時間5 min，研究超聲波功率密度（167，333，500，1 000，1 500和2 000 W/L）對酒糟纖維素轉(zhuǎn)化率的影響。

1.2.2.2 超聲波處理溫度對酒糟纖維素酶解效果的影響

基于1.2.2.1的結(jié)果，固定超聲波功率密度500 W/L、超聲波工作間歇比5∶3（s/s）、超聲波處理時間5 min，研究超聲波處理溫度（40，50，60，70和80℃）對酒糟纖維素轉(zhuǎn)化率的影響。

1.2.2.3 超聲波工作間歇比對酒糟纖維素酶解效果的影響

基于1.2.2.2的結(jié)果，固定超聲波功率密度500 W/L、超聲波處理溫度50 ℃、超聲波處理時間5 min，研究超聲波工作間歇比（5∶1，5∶2，5∶3，5∶4和5∶5 s/s）對酒糟纖維素轉(zhuǎn)化率的影響。

1.2.2.4 超聲波處理時間對酒糟纖維素酶解效果的影響

基于1.2.2.3的結(jié)果，固定超聲波功率密度500 W/L、超聲波處理溫度50 ℃、超聲波工作間歇比5∶2（s/s），研究超聲波處理時間（5，10，15，20和30 min）對酒糟纖維素轉(zhuǎn)化率的影響。

1.2.3 正交試驗

由單因素試驗得到單因素的優(yōu)水平，選取影響比較顯著的因素進行正交試驗設(shè)計L9(33*)。

表1 正交試驗設(shè)計表

1.2.4 對照試驗

用正交試驗得到的最優(yōu)組合條件進行試驗，以單一超聲波預處理、單一離子液體預處理、不做任何處理作為對照組，對比分析4種不同酶解方法的纖維素轉(zhuǎn)化率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個試驗重復3次，每次平行測定3次，結(jié)果以“平均值±標準差”表示。采用Excel軟件進行各個因素試驗的數(shù)據(jù)分析及作圖；采用SPSS 22.0對各因素水平結(jié)果進行顯著性分析，設(shè)定顯著性水平α=0.05（n=9）。

2 結(jié)果與分析

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 超聲波功率密度對酒糟纖維素酶解效果的影響

由圖1可知，酒糟纖維素轉(zhuǎn)化率先隨超聲波功率密度上升而上升，功率密度達到500 W/L，纖維素轉(zhuǎn)化率開始下降，500 W/L時纖維素轉(zhuǎn)化率最大。空化效應(yīng)是超聲波作用的主效應(yīng)，空化導致的微射流使快速移動的水分子、固體顆粒之間不停地相互撞擊，纖維素分子含有晶體缺陷的晶區(qū)快速變?yōu)樾【^(qū)[10]*，從而對纖維素形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響[11]*。超聲波功率密度較高時，超聲波探頭附近會產(chǎn)生并聚集大量氣泡，不利于傳遞能量[12]*；超聲波功率密度較低時，又無法產(chǎn)生足夠能量破壞纖維素結(jié)構(gòu)[13]*。綜上所述，選擇500 W/L為超聲波處理的最優(yōu)功率密度。

圖1 超聲波功率密度對酒糟纖維素酶解效果的影響

2.2.2 超聲波處理溫度對酒糟纖維素酶解效果的影響

由圖2可知，不同超聲波處理溫度下，酒糟纖維素轉(zhuǎn)化率總體呈先上升后下降趨勢，纖維素轉(zhuǎn)化率在超聲波處理溫度50 ℃時達到最高。超聲波功率恒定時，溫度越低，越難發(fā)生空化，而隨著溫度提高，蒸汽壓力也相應(yīng)增大，從而削弱空化作用[12]*。溫度上升時，液相表面張力下降，而液相蒸汽壓力隨溫度增加而迅速上升，空化閾值也相應(yīng)地下降，在超聲波強度較低的情況下，就會出現(xiàn)空化現(xiàn)象[14]*。一方面，空化閾隨溫度的下降而上升，因為溫度會影響液體介質(zhì)的黏滯性，液體介質(zhì)黏度增大時，產(chǎn)生空化作用則需要更大的超聲波聲壓，空化閾也越高[14]*；但是，溫度升高，液體介質(zhì)氣體含量越少，空化泡核越少，空化閾就越高。綜上，選擇50 ℃為超聲波處理的最優(yōu)溫度。

圖2 超聲波處理溫度對酒糟纖維素酶解效果的影響

2.2.3 超聲波工作間歇比對酒糟纖維素酶解效果的影響

由圖3可知，不同超聲波工作間歇比下，酒糟纖維素轉(zhuǎn)化率總體呈下降趨勢。不同工作間歇比對酒糟纖維素轉(zhuǎn)化率的影響差異不顯著（P＞0.05）。工作間歇比5∶1（s/s）時，相同超聲波時間內(nèi)，超聲波發(fā)出的次數(shù)最多，空化效應(yīng)增強；間歇時間過長，超聲波體系的空化泡核有足夠的時間成長，以致潰散，空化效應(yīng)減弱[14]*。綜合實際考慮，選擇5∶2（s/s）作為超聲波處理的最優(yōu)間歇比。

圖3 超聲波工作間歇比對酒糟纖維素酶解效果的影響

2.2.4 超聲波處理時間對酒糟纖維素酶解效果的影響

由圖4可知，不同超聲波處理時間下，酒糟纖維素轉(zhuǎn)化率總體呈先上升后平緩趨勢，超聲波處理時間達到20 min時，酒糟纖維素轉(zhuǎn)化率基本達到最大值，之后酒糟纖維素轉(zhuǎn)化率趨近平緩。超聲波處理時間較短時，半纖維素和木質(zhì)素不能很好地被釋放出來，從而纖維素轉(zhuǎn)化率隨時間延長而增大[15]*。超聲波處理時間20和30 min之間差異不顯著（P＞0.05），從實際出發(fā)，選擇20 min為超聲波處理的最優(yōu)時間。

圖4 超聲波處理時間對酒糟纖維素酶解效果的影響

2.3 正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果和顯著性分析，由于超聲波工作間歇比對酒糟纖維素酶解效果的影響差異不顯著（P＞0.05），將間歇比固定為5∶2（s/s），故選取超聲波溫度（A）、超聲波功率密度（B）、超聲波時間（C）3個因素進行正交試驗，正交試驗結(jié)果如表2所示。

表2 正交試驗結(jié)果表

如表2所示：3個因素的主次效應(yīng)為B＞C＞A，即不同超聲波功率密度對酒糟纖維素酶解效果的影響最顯著，超聲波處理時間的影響次之，超聲波處理溫度的影響最小，確定B1C1A3是最優(yōu)的組合，即最優(yōu)工藝參數(shù)為超聲波功率密度B1（333 W/L）、超聲波處理時間C1（15 min）、超聲波處理溫度A3（55 ℃）。

如表3所示：超聲波功率密度、超聲波處理溫度、超聲波處理時間3個因素均對酒糟纖維素的酶解效果有顯著影響（P＜0.05），其中超聲波處理溫度和超聲波處理時間對纖維素的轉(zhuǎn)化率存在極顯著差異（P＜0.01）。根據(jù)正交試驗選出的最優(yōu)組合為B1C1A3，正交試驗設(shè)計表中并未出現(xiàn)此組合，需對最優(yōu)組合的條件參數(shù)進行驗證試驗。驗證結(jié)果表明，采用離子液體[BMIM]PF6、料液比1∶50（g/mL）、超聲波功率密度333 W/L、超聲波處理溫度55 ℃、超聲波處理時間15 min、超聲波工作間歇比5∶2（s/s）、酶解時間140 min、酶解溫度50 ℃、纖維素酶底比990 U/g、酶解pH 5.4進行試驗，酒糟纖維素的轉(zhuǎn)化率為12.05%。

表3 方差分析表

2.4 對照試驗結(jié)果

由圖5可知，4種不同處理方法對酒糟纖維素酶解效果的影響差異顯著（P＜0.05），其中以超聲波協(xié)同離子液體處理組的纖維素轉(zhuǎn)化率為最高，其值為12.05%。未進行預處理的纖維素轉(zhuǎn)化率為4.15%；單獨超聲波預處理的纖維素轉(zhuǎn)化率為5.62%，與未進行任何處理（4.15%）相比，提高了35.4%，故超聲波預處理對提高酒糟纖維素轉(zhuǎn)化率具有較好的效果，表現(xiàn)為促進作用；單獨離子液體預處理的纖維素轉(zhuǎn)化率為10.84%，與未進行任何處理的相比，提高了161.2%，離子液體預處理能促進酒糟纖維素的酶解。

圖5 對照試驗結(jié)果

3 結(jié)論

試驗以纖維素轉(zhuǎn)化率為指標，研究超聲波協(xié)同離子液體預處理對酒糟纖維素酶解效果的影響，并對工藝參數(shù)進行了優(yōu)化。結(jié)果表明：酒糟纖維素經(jīng)最優(yōu)的超聲波協(xié)同離子液體工藝條件處理后再進行酶解，其纖維素轉(zhuǎn)化率為12.05%，與不做任何處理、單一超聲波處理、單一離子液體處理相比，纖維素轉(zhuǎn)化率分別提高了190.4%，114.4%和11.2%，表明超聲波協(xié)同離子液體預處理對酒糟纖維素的酶解具有促進作用，可為酒糟纖維素的高效降解提供新思路。