分子標記輔助選擇Pi9基因改良水稻不育系桃農(nóng)1A稻瘟病抗性

李博文 雷權強 黃俊 張婷 鄒玉瑩 車凡昊 鄧吉奇 劉金靈,2,3 劉雄倫,2,3*

（1 湖南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，長沙 410128；2 作物基因工程湖南省重點實驗室，長沙 410128；3 水稻油菜抗病育種湖南省重點實驗室，長沙 410128；4 湖南農(nóng)業(yè)大學教育學院，長沙410128；*通訊作者：xionglun@hunau.edu.cn）

水稻是世界上最主要的糧食作物之一。由Magnaporthe oryzae 引起的稻瘟病是水稻生產(chǎn)中最嚴重的病害之一，在全球廣泛發(fā)生，對水稻的產(chǎn)量和品質造成嚴重影響，其以葉瘟、穗頸瘟最為常見，嚴重時可導致水稻減產(chǎn)50%～80%，甚至顆粒無收[1]。實踐表明，培育和推廣抗稻瘟病水稻新品種[2-3]是防治稻瘟病最有效的方法之一。來源于小粒野生稻（Oryza minuta）的Pi9 基因是第1 個被成功克隆的廣譜持久抗稻瘟病基因，對來源于不同國家的多數(shù)稻瘟菌生理小種（菌株）均具有抗性[4-7]。

分子標記輔助選擇（Marker-assisted Selection，MAS）育種可定向改良目的性狀，且不受外界環(huán)境影響，大大提高育種選擇效率、縮短育種年限，是現(xiàn)代分子育種的重要手段[8]。75-1-127 是通過小粒野生稻與秈稻品系IR31917 遠緣雜交再連續(xù)回交獲得的高抗稻瘟病秈稻品系[9]。桃農(nóng)1A 是湖南省桃源縣農(nóng)業(yè)科學研究所選育的優(yōu)質秈型三系不育系，具有不育性好、遺傳性狀穩(wěn)定、高柱頭外露率、易制種、高配合力、米質優(yōu)、抗倒能力強等優(yōu)點，至今還一直在生產(chǎn)上廣泛應用[10]。然而，桃農(nóng)1A 的稻瘟病抗性較差，葉瘟與穗瘟均達到5 級[11]，使其推廣應用受到嚴重限制，因此，改良桃農(nóng)1A 的稻瘟病抗性將大大提高其應用價值。本研究利用75-1-127 作為Pi9 基因的供體親本，先后以保持系桃農(nóng)1B 及其不育系桃農(nóng)1A 為受體親本，利用基于Pi9基因內序列開發(fā)的共顯性InDel 標記，通過MAS 連續(xù)回交育種定向改良桃農(nóng)1B 與桃農(nóng)1A 的稻瘟病抗性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水稻材料：高抗稻瘟病秈稻品系75-1-127（Pi9 基因供體親本、抗病對照）；三系不育系桃農(nóng)1A 及其保持系桃農(nóng)1B（Pi9 基因受體親本）；感病對照品系CO39。

稻瘟菌菌株：15 份來自國內外不同稻區(qū)的稻瘟菌菌株，用于室內接種抗菌譜分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 標記基因型分析

DNA 模板提?。河? mL 滅菌離心管取候選水稻單株小分蘗葉片約0.2 g，加液氮研磨后用CTAB 法提取總DNA[12]。

PCR 體系（10 μL）：模板DNA 1.0 μL，5 U/μLTaq 酶0.1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.2 μL，2 pmol/μL primer pairs 1.0 μL，10×Buffer 1.0 μL，ddH2O6.7 μL。PCR 熱循環(huán)參數(shù)：94 ℃5 min；94 ℃30 s；55 ℃30 s；72 ℃30 s；30 cycles；72 ℃10 min。用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR 產(chǎn)物，分析單株標記基因型。

1.2.2 分子標記輔助選擇育種實踐

自2015年夏季開始，用桃農(nóng)1B 作母本及輪回親本，75-1-127 作父本，連續(xù)多年在湖南長沙與海南三亞兩地開展分子標記輔助選擇回交育種實踐，用CoInDF1R2標記在各回交群體中進行Pi9 基因前景選擇，用田間主要農(nóng)藝產(chǎn)量性狀作為單株基因組背景選擇，于2018年冬季在海南獲得穩(wěn)定、整齊、高抗稻瘟病的桃農(nóng)1B-Pi9 的BC5F3代群體（株系）。同時，以桃農(nóng)1A 為母本，從改良保持系桃農(nóng)1B-Pi9 群體中選擇高抗稻瘟病且農(nóng)藝產(chǎn)量性狀優(yōu)良的株系作父本及輪回親本，利用MAS 技術，于2020年冬季在海南獲得改良不育系桃農(nóng)1A-Pi9 的BC3F1代群體（株系）。2021年5—6月份在湖南瀏陽大圍山病圃經(jīng)苗瘟抗性鑒定后，對改良抗病不育系桃農(nóng)1A-Pi9 進行田間綜合調查分析，最后遴選高抗稻瘟病且不育特性好、農(nóng)藝產(chǎn)量性狀表現(xiàn)優(yōu)良的新不育系。

1.2.3 稻瘟病抗性鑒定與抗菌譜分析

田間病圃苗瘟抗性鑒定：試驗于2019—2021年的5月中旬至6月中旬在湖南瀏陽大圍山稻瘟病天然病圃進行，具體參考廖花等人的方法[13]。

稻瘟菌室內人工接種：分別用15 份稻瘟菌菌株接種水稻第3 片完整葉片，接種孢子懸浮液濃度為1.5×105個/mL 左右。接種后調查苗瘟抗性表型、分析抗菌譜。接種方法為打孔接種法或噴霧接種法，其中打孔接種后于10～15 d 調查發(fā)病情況，噴霧接種后于7 d 后調查發(fā)病情況。

稻瘟病分級標準參照Bonman 的0～5 級標準[14]。

1.2.4 不育特性調查

調查桃農(nóng)1A 與其改良系的不育特性，包括柱頭外露率、包頸粒率、自交結實率、不育度、不育株率、花粉育性及其敗育類型、不育花粉率，具體操作參考文獻[15-17]。

柱頭外露率與包頸粒率：待不育系抽穗揚花結束后，隨機選取30 穗，調查總穎花數(shù)和柱頭外露穎花數(shù)（包括柱頭單邊外露穎花數(shù)和柱頭雙邊外露穎花數(shù)），計算柱頭外露率；同時調查終花后的每穗抽出穎花數(shù)和包頸穎花數(shù)，計算包頸粒率。

自交結實率、不育度與不育株率：不育系于孕穗末期隨機取10 株，用羊皮紙袋套袋，于20 d 后調查自交結實率、不育株率及不育度。

花粉育性及敗育類型：不育系開花盛期，隨機取10 個剛開始開花的稻穗進行鏡檢，在每個稻穗的上、中、下三個部位分別取即將開花的3 朵穎花，將其花藥用干凈的鑷子夾出至蓋玻片上并搗碎，用1% I2-KI 溶液染色，在光學顯微鏡下觀察花粉育性及敗育類型。

不育花粉率：鏡檢時取10 個干凈清晰的視野，統(tǒng)計每個視野下的不育花粉率。

1.2.5 農(nóng)藝產(chǎn)量性狀調查

調查桃農(nóng)1B、桃農(nóng)1A 及其改良群體的播始歷期、株高、劍葉長和劍葉寬、穗長、分蘗數(shù)、有效穗數(shù)、單穗穎花數(shù)、著粒密度、千粒重、結實率等主要農(nóng)藝產(chǎn)量性狀，方法見參考文獻[18-19]。

每個水稻材料為1 個小區(qū)，每個小區(qū)7 行，每行7株，株距20 cm，行距25 cm，正常肥水管理，在分蘗期曬田以抑制無效分蘗生長。水稻分蘗末期，調查每個小區(qū)第3、4 行共14 株植株的分蘗數(shù)；在水稻始穗期調查每個材料的播始歷期；待水稻成熟后，同樣以每個小區(qū)第3、4 行共14 株作為樣本，調查每株株高、劍葉長和劍葉寬、穗長、有效穗數(shù)、單穗穎花數(shù)、實粒數(shù)，計算每穗著粒密度與結實率；水稻種子收割后經(jīng)曬干水分、室內脫粒后測量千粒重，3 次重復。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010、Statistix 8.0 與GraphPad Prism 8.3.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析；采用最小顯著性差異法（LSD）進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 Pi9 基因多態(tài)分子標記篩選

用本實驗室開發(fā)的Pi9 基因內分子標記對供體親本75-1-127 與受體親本桃農(nóng)1B 和桃農(nóng)1A 做基因型分析，篩選多態(tài)標記用于MAS 育種實踐。獲得供體/受體親本間多態(tài)性穩(wěn)定的共顯性InDel 標記CoInDF1R2（Pi9 基因內元序列；正向引物：5'-ATCCACGAAACATCCACCATCC -3',反向引物 ：5' -TGAGCTAGCTCTTGCCTCCGAG-3'），該標記在75-1-127 基因組中擴增出1 條大小為354 bp 的穩(wěn)定條帶，而在桃農(nóng)1B 或桃農(nóng)1A 基因組中的PCR 產(chǎn)物大小約為470 bp，2 條擴增產(chǎn)物可以用瓊脂糖凝膠電泳簡便區(qū)分（圖1）。

2.2 CoInDF1R2 輔助選擇育成高抗稻瘟病不育系桃農(nóng)1A-Pi9 及其保持系桃農(nóng)1B-Pi9

利用共顯性標記CoInDF1R2連續(xù)多年開展MAS 育種實踐，2015年夏季至2018年冬季獲得26 個改良保持系桃農(nóng)1B-Pi9，從中遴選出3 個高抗稻瘟病、農(nóng)藝產(chǎn)量性狀較好的改良系作為父本與輪回親本，繼續(xù)與桃農(nóng)1A 雜交并連續(xù)回交，于2020年冬季在海南三亞獲得3 個對應改良不育系桃農(nóng)1A-Pi9。標記基因型鑒定結果（圖1）表明，改良不育系及其配套保持系的Pi9 基因位點均已純合。

圖1 桃農(nóng)1A-Pi9、桃農(nóng)1B-Pi9 標記基因型鑒定和人工接種表型1B-Pi9

2.3 親本及改良株系病圃苗瘟抗性表型及抗菌譜

田間病圃苗瘟抗性鑒定結果表明，供體親本75-1-127 苗瘟為0 級，表現(xiàn)為高度抗病；受體親本桃農(nóng)1B與桃農(nóng)1A 苗瘟均達到4 級，表現(xiàn)為高度感病；3 份改良不育系桃農(nóng)1A-Pi9（BC3F1群體）及其配套改良保持系桃農(nóng)1B-Pi9（BC5F6群體）苗瘟抗性表型均為0 級，表現(xiàn)為高度抗病，且均未出現(xiàn)感病分離株；感病對照材料CO39 苗瘟為5 級，表現(xiàn)為高度感病。室內人工接種抗菌譜結果（表1）顯示，75-1-127 對15 份稻瘟菌菌株中的13 份表現(xiàn)抗病，但對X2007A-7 和ROR1 表現(xiàn)感病，抗性頻率為86.67%；CO39 對15 份菌株均表現(xiàn)感病，抗性頻率為0；桃農(nóng)1B 和桃農(nóng)1A 均對X2007A-1表現(xiàn)抗病，而對其余14 份菌株表現(xiàn)感病，抗性頻率為6.67%；改良不育系桃農(nóng)1A-Pi9-1 及其保持系桃農(nóng)1B-Pi9-1 的抗病表型與供體親本75-1-127 一致，均對X2007A-7 和ROR1 表現(xiàn)感病，而對其余13 份菌株表現(xiàn)抗病，抗性頻率均為86.67%。上述結果表明，Pi9基因抗性水平高、抗譜廣，已被成功應用于改良桃農(nóng)1B 和桃農(nóng)1A 的稻瘟病抗性。

表1 親本及改良材料對15 份供試稻瘟菌菌株的抗菌譜

2.4 桃農(nóng)1A-Pi9 不育特性

受體親本桃農(nóng)1A 與3 個改良抗病不育系桃農(nóng)1A-Pi9 的柱頭肥大且均為黑色。調查結果（圖2）表明，3 個改良不育系的柱頭總外露率均有提高，其中桃農(nóng)1A-Pi9-1 柱頭外露率最高（74.82%）且顯著高于桃農(nóng)1A（62.79%），異交習性獲得改良。自然狀態(tài)下桃農(nóng)1A包頸嚴重，桃農(nóng)1A-Pi9-1 和桃農(nóng)1A-Pi9-3 的包頸粒率（分別為29.92%、24.48%）均低于桃農(nóng)1A（33.97%），而桃農(nóng)1A-Pi9-2 包頸粒率（48.21%）顯著高于桃農(nóng)1A。經(jīng)田間調查統(tǒng)計，桃農(nóng)1A 與3 個改良不育系的自交結實率均為0，不育株率與不育度均為100%，不育性徹底且穩(wěn)定?；ǚ坨R檢結果顯示，桃農(nóng)1A 與3 個改良不育系的花粉敗育率均為100%，圓敗花粉和典敗花粉率各約50%?？梢姡牧疾挥堤肄r(nóng)1A-Pi9-1 和桃農(nóng)1A-Pi9-3 不育性徹底且穩(wěn)定，柱頭外露率高，包頸粒率低，不育特性進一步提升。

圖2 不育系主要不育特性

2.5 桃農(nóng)1B-Pi9 與桃農(nóng)1A-Pi9 主要農(nóng)藝產(chǎn)量性狀

3 個改良保持系的播始歷期為72～73 d，比桃農(nóng)1B長1～2 d；3 個改良不育系的播始歷期為74～75 d，比桃農(nóng)1A 長1～2 d。與2 個受體親本一樣，3 個改良不育系及其保持系株型緊湊，葉片上舉，抗倒伏性好。調查結果（表2、表3）表明，桃農(nóng)1B-Pi9-1 株高最低，但仍顯著高于桃農(nóng)1B；桃農(nóng)1A-Pi9-1 在3 個改良不育系中最矮，略高于桃農(nóng)1A。3 個改良不育系分蘗力、單穗穎花數(shù)相對于桃農(nóng)1A 均有所提高；3 個改良保持系單穗穎花數(shù)、著粒密度、千粒重和結實率相對于桃農(nóng)1B 也均有提高?？梢?，3 個改良不育系及其保持系的不同性狀表現(xiàn)各有優(yōu)劣，但桃農(nóng)1A-Pi9-1 的株高明顯低于其他2 個改良不育系，且其柱頭外露率在3 個改良系中最高，包頸粒率也比較低。綜合農(nóng)藝產(chǎn)量性狀與不育特性，桃農(nóng)1A-Pi9-1 是今后生產(chǎn)上應用的首選。

表2 不育系與保持系主要農(nóng)藝性狀

表3 不育系與保持系主要產(chǎn)量結構

3 討論

水稻稻瘟病抗性是典型的質量-數(shù)量性狀，不僅受到單個或主效R 基因的控制，還與多種環(huán)境因素尤其是與病原菌的互作有著密切聯(lián)系[20-22]。稻瘟病抗性育種中，僅通過田間表型選擇的常規(guī)育種方法效率低，且不利于開展多基因聚合育種，選育出來的新品種很難實現(xiàn)廣譜持久抗性[23]。MAS 育種是對標記基因型的直接鑒定和選擇，不受外界環(huán)境因素影響，大大提高了選擇準確性與效率，是現(xiàn)代分子育種的主要方式[24]。MAS 育種改良稻瘟病抗性已有較多報道，如R153 的選育[25]、龍黑198 的選育[26]、M630 的改良[27]等。本實驗室10 多年來通過MAS 技術改良了一批水稻品系的稻瘟病抗性，包括常規(guī)稻如湘晚秈13 號[28]、恢復系如R747[13]、三系不育系如豐源A[29]。

本研究利用基于Pi9 基因內元序列開發(fā)的共顯性InDel 標記CoInDF1R2，連續(xù)多年開展MAS 回交育種實踐，最后育成了高抗稻瘟病且綜合性狀優(yōu)良的三系不育系桃農(nóng)1A-Pi9-1 及其配套保持系桃農(nóng)1B-Pi9-1，為三系雜交水稻育種創(chuàng)制了新的親本材料。在此基礎上，我們將繼續(xù)開展以下工作：使用更多不同稻區(qū)的稻瘟菌小種（菌株）接種，進一步明確受體親本與改良系的抗菌譜；將改良系引入不同生態(tài)稻區(qū)做苗瘟和穗瘟抗性鑒定，明確桃農(nóng)1A-Pi9-1 及其雜交種的適宜種植區(qū)；用桃農(nóng)1A-Pi9-1 廣泛配組，選配廣譜高抗稻瘟病、優(yōu)質、高產(chǎn)、廣適的強優(yōu)勢雜交組合F1代應用于生產(chǎn)，同時分析桃農(nóng)1A-Pi9-1 的恢復源相對于桃農(nóng)1A 是否發(fā)生改變。

本研究中我們注意到，桃農(nóng)1A 剛育成時花粉敗育類型主要為典敗型，典敗率達99.86%[11]，與實驗室往年鏡檢結果相符。然而，2021年桃農(nóng)1A 圓敗花粉比例大大增加，達50%左右，出現(xiàn)這種現(xiàn)象很可能是由于2021年開花期持續(xù)高溫所致，前人有過相關報道[30]。