基于轉錄組信息的甘松MADS-box 轉錄因子家族分析

崔 琪 ，俸明康 ，豐日落，王 濤，張紹山，李 瑩，陳 晨*，劉 圓*

1.西南民族大學藥學院，四川 成都 610041

2.西南民族大學青藏高原研究院，四川 成都 610225

3.四川省羌彝藥用資源保護與利用技術工程實驗室，四川 成都 610225

4.青藏高原民族藥用資源保護與利用國家民委重點實驗室，四川 成都 610225

敗醬科甘松屬植物甘松Nardostachys jatamansiDC.主要分布于四川省、甘肅省、青海省、云南省、西藏等地海拔2800～4500 m 的高山草甸區(qū)，歷版《中國藥典》均有收載，其藥用部位為干燥根及根莖，具有理氣止痛、開郁醒脾，外用祛濕消腫的功效；用于脘腹脹滿、食欲不振、嘔吐；外用治牙痛、腳氣腫毒[1]，是古印度阿育吠陀（Ayurveda）和尤納尼醫(yī)（Unani）學體系的常用藥材，在我國為藏、蒙、維、傈僳、納西等傳統(tǒng)民族醫(yī)學臨床常用品種[2]，也是藏香的主要原料之一[3]。另外，甘松在精油、日化品等領域也有較大的經濟價值。

MADS-box 蛋白家族是一類N 端存在1 個氨基酸數目為58～60 的保守結構域-MADS-box 結構域[4]的重要的轉錄因子，廣泛存在于真核生物中，其名稱源自釀酒酵母的 MCMI、擬南芥的AGAMOUS、金魚草的 DEFICIENS 和人類的SRF4 4 種類[5]。常被分為Type I 型和Type II 型，Type I 型包括Mα、Mβ、Mγ、Mδ 亞族，目前僅少數TypeI 型蛋白的生物學功能已被探明，且與植物胚和胚乳的發(fā)育有關[6]，TypeII 型包括MIKCc和 MIKC*亞族[7]，MIKC*通常參與調控雄配子的生長發(fā)育，MIKCc對花器官生長發(fā)育有重要作用[8]，在花育的ABCDE 模型中，TypeII型蛋白中所涉及的花四聚體能調節(jié)不同花序中的特定表達過程[9]。MADS-box 家族轉錄因子大多參與花器官的發(fā)育、開花時間和果實成熟等過程的調控[7]，少數參與調控植物側根的形成[10]。

甘松的藥用部位為營養(yǎng)器官-根莖，開花時間及側根的發(fā)育影響其產量及品質。因此，甘松花及側根發(fā)育分子調控機制的研究，可為其優(yōu)質高產及優(yōu)良種質資源的培育提供理論基礎和技術手段。MADS-box 家族基因對開花時間調控、花器官發(fā)育及側根發(fā)育至關重要，但甘松MADS-box 家族轉錄因子未見報道，因此，基于課題組前期的轉錄組數據，鑒定和分析甘松MADS-box 轉錄因子家族的生物信息學功能，為進一步探究甘松MADS-box 家族轉錄因子在花器官形成機制及側根發(fā)育的分子調控機制提供重要的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品與處理

甘松植株經西南民族大學青藏高原研究院劉圓教授鑒定為甘松Nardostachys jatamansiDC.，現蕾后套袋收集同一株的種子。

將采集的甘松種子播種于花盆中，共6 盆，在培養(yǎng)箱中（溫度20 ℃；相對濕度50%；8 h/16 h 光照/黑暗）培育至長出兩片真葉。3 盆噴灑50 mg/mL 吲哚乙酸溶液，另外3 盆噴灑同樣數量的清水作空白對照，24 h 后取處理后的甘松葉片，每份樣品采集3 個生物學重復，液氮速凍，-80 ℃保存，送至上海歐易生物醫(yī)學科技有限公司進行轉錄組測序。

1.2 甘松MADS-box 家族的來源、篩選及序列分析

甘松MADS-box 轉錄因子家族序列來源于課題組上傳于NCBI 的SRA 數據庫中的轉錄組數據，檢索號分別為SRR21656214、SRR21656215、SRR21656216、SRR21656217、SRR21656218、SRR21656219、SRR21656220、SRR21656221、SRR21656222、SRR21656223、SRR21656224、SRR21656225、SRR21656226、SRR21656227、SRR21656228、SRR21656229、SRR21656230、SRR21656231。利用數據中NR 和Swiss 注釋搜索甘松中潛在的MADS-box 轉錄因子，篩選的E值為1×10-5。利用數據在NCBI 查找其開放閱讀框（open reading frame，ORF），再利用CDD、pfam對保守結構域進行鑒定，篩選并剔除不完整的甘松MADS-box 轉錄因子，最終獲得20 條MADS-box轉錄因子序列，將其命名為 NcMADS01～NcMADS20。

1.3 甘松MADS-box 家族蛋白理化性質、二級結構、三級結構和保守基序（motif）分析

對篩選出的MADS-box 家族蛋白序列，利用Expasy（https://web.expasy.org/protparam/）分析甘松MADS-box轉錄因子家族成員的蛋白相對分子質量、理論等電點等基本理化性質，利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?pa ge=npsa_sopma.html）預測甘松MADS-box 蛋白二級結構，利用 MEME（https://memesuite.org/meme/tools/meme）分析甘松MADS-box 蛋白保守基序及其分布，利用SWISS MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）預測甘松MADS-box 蛋白的三維結構。

1.4 甘松MADS-box 家族蛋白亞細胞定位、導肽、信號肽、跨膜結構預測分析

利用Cello（http://cello.life.nctu.edu.tw/）進行亞細胞定位預測分析。利用TargetP-2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TargetP-2.0）預測導肽，利用SignalP-4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）預測信號肽，跨膜結構預測通過 TM-HMM Server.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）完成。

1.5 甘松MADS-box 家族蛋白系統(tǒng)進化樹構建

使用MEGA6 軟件以鄰位連接法（neighborjoining，NJ）構建甘松MADS-box 蛋白序列與TAIR擬南芥官網（https://www.arabidopsis.org/browse/genefamily/mads_tffamily.jsp）中下載的擬南芥MADS-box 蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，并用iTOL 軟件進行美化。

2 結果與分析

2.1 甘松MADS-box 家族蛋白的篩選

甘松相關數據來源于課題組前期的轉錄組測序數據。本研究在Swiss-Prot、NR 數據庫中篩選得到了 39 個 MADS-box 家族轉錄因子，再通過ORFfinder 對其開放閱讀框進行分析，進一步通過CDD 和Pfam 進行結構域預測分析，刪除沒有完整保守結構域以及重復的序列，最終得到 20 個MADS-box 蛋白，按照轉錄組數據編號從小到大的順序進行編號，分別編號為 NcMADS01～NcMADS20。

2.2 甘松MADS-box 蛋白序列理化性質分析

利用 Protparam 在線工具，對 20 條甘松MADS-box 蛋白序列進行理化性質分析，結果顯示，20 條NcMADS 蛋白序列長度在90～365 aa，相對分子質量在10 179.96～41 707.68。理論等電點（PI）在4.87～10.43，其中9 個蛋白等電點＜7 顯酸性，11 個蛋白等電點＞7 顯堿性。20 個NcMADS 蛋白中，3 個蛋白序列的不穩(wěn)定指數＜40，為穩(wěn)定蛋白，17 個蛋白序列的不穩(wěn)定指數＞40，為不穩(wěn)定蛋白。甘松MADS-box 蛋白脂肪系數在73.12～108.44，其中有2 個脂肪系數大于100。20 個甘松MADS-box蛋白的平均疏水指數-0.84～-0.15，均為負值，其中16 個小于-0.5，占比80%，可推出大部分甘松MADS-box 蛋白質是親水蛋白質，兩性蛋白質為4個，占比20%（表1）。

表1 甘松MADS-box 轉錄因子家族信息Table 1 Information of the MADS-box transcription factor family in N.jatamansi

2.3 甘松MADS-box 蛋白二級結構與三級結構分析

蛋白質的二級結構是蛋白質中有規(guī)則重復的構象，研究蛋白質二級結構是研究蛋白質結構和功能的基礎。甘松MADS-box 蛋白序列的二級結構均含有α-螺旋、β-轉角、無規(guī)則卷曲和延伸鏈，α-螺旋和無規(guī)則卷曲作為二級結構的主要構成元件，占二級結構的70%左右，這對蛋白質的特殊結構構象具有一定的作用，無規(guī)則卷曲和β-轉角占比相對較小（表2）。

表2 甘松MADS-box 轉錄因子家族二級結構Table 2 Secondary structure of the MADS-box transcription factor family in N.jatamansi

利用在線軟件SWISS-MODEL 對甘松的20 個MADS-box 家族基因進行結構預測（圖1），可從構建的模型中清楚地觀察到各家族蛋白的空間結構（α-螺旋、β-轉角、無規(guī)則卷曲、延伸鏈）。結果顯示甘松9 個亞族之間以及同一亞族不同蛋白之間的α-螺旋、β-轉角、無規(guī)則卷曲、延伸鏈的比例均不相同，從而導致其空間結構存也存在一定差異，結構的差異使得各自呈現不同的功能。

圖1 甘松MADS-box 轉錄因子家族三維結構預測Fig.1 Tertiary structures prediction of MADS-box transcription factor family in N.jatamansi

2.4 甘松MADS-box 蛋白基序分析

利用MEME 在線軟件分析了甘松MADS-box家族蛋白的保守基序，得到MADS-box 蛋白的10個保守基序，命名為motif1～motif10，長度為12～50 aa。

其中motif1 為MADS 結構域，motif2 和motif5為K-box結構域。通過分析發(fā)現，20個NcMADS-box蛋白序列含有2～7 個保守基序（圖2）。

圖2 甘松MADS-box 轉錄因子家族motif 分布Fig.2 Motif analysis of the MADS-box transcription factor family in N.jatamansi

2.5 甘松MADS-box 蛋白亞細胞定位

利用 Cello v.2.5 在線數據庫對 20 個甘松MADS-box 蛋白進行亞細胞定位預測分析，結果表明甘松大部分MADS-box 蛋白定位在細胞核，說明它們作為轉錄因子大部分能調控下游基因的表達[11]，而少數MADS-box 蛋白在細胞質、線粒體中也有定位，其中 2 個定位到細胞質，2 個定位到線粒體。NcMADS19 定位到細胞質中，NcMADS16 定位到線粒體中；其余轉錄因子均定位到細胞核內，說明大部分MADS-box 蛋白作為轉錄因子，不進行蛋白轉運，直接在細胞核中發(fā)揮轉錄調控作用（表3）。

表3 甘松MADS-box 轉錄因子家族亞細胞定位Table 3 Subcellular location prediction of the MADS-box transcription factor family in N.jatamansi

2.6 導肽、信號肽和跨膜結構域預測分析

導肽是將新合成的肽鏈引入不同細胞器的一段識別序列[12]。信號肽是導肽的一種，其位于蛋白質的N 端，具有指導分泌型蛋白到內質網上合成的作用。導肽和信號肽在蛋白定位過程中起重要作用。預測分析導肽和信號肽，利于進一步研究蛋白的功能和作用途徑。利用TargetP2.0 分析22 個甘松MADS-box 蛋白是否具有信號肽和導肽結果表明：20 個NcMADS 蛋白均不含信號肽和導肽，為非分泌蛋白。同時利用TM-HMM Server.2.0 在線軟件對其跨膜結構進行分析，發(fā)現20 個NcMADS 蛋白均無跨膜結構特征，這與親水性的分析結果是一致的。同時表明甘松22 個MADS-box 蛋白無法跨膜運輸或者作為轉錄因子通過核孔運輸（表4）。

表4 甘松MADS-box 轉錄因子導肽預測Table 4 Leader peptide prediction of MADS-box transcription factors in N.jatamansi

2.7 甘松MADS-box 家族成員系統(tǒng)進化樹構建

利用MEGA6 軟件，對篩選獲取的20 個甘松MADS-box 的蛋白序列和TAIR 數據庫查詢得到的97 個擬南芥MADS-box 蛋白序列進行同源對比，采用鄰接法，構建系統(tǒng)進化樹，在通過iTOL 進行美化處理。結果顯示（圖3），20 個甘松MADS 蛋白聚類可分為9 個亞族。其中4 個Type I 型NcMADS蛋白聚類到擬南芥Type I 型（Mα 與Mδ）中Mα 中僅包含NcMADS19，Mδ 中包含NcMADS02、NcMADS03、NcMADS08；其余16 個NcMADS 蛋白分別聚到擬南芥MICK 型蛋白的不同亞族。其中AP3、STK/SHP、FUL、SOC1 亞族各包含1 個成員，分別為NcMADS04、NcMADS05、NcMADS14、NcMADS16；SEP 亞族包含2 個成員，分別是NcMADS09、NcMADS20；SVP 亞族中包含4 個成員，分別是NcMADS06、NcMADS07、NcMADS13、NcMADS18；還有6 個成員歸屬到ANR1 亞族，分別是 NcMADS01、NcMADS10、NcMADS11、NcMADS12、NcMADS15 和NcMADS17。

圖3 甘松與擬南芥MADS-box 家族轉錄因子系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of MADS-box family transcription factors in N.jatamansi and Arabidopsis thaliana

3 討論

3.1 甘松MADS-box 家族轉錄因子是參與多項生理活動的重要調控因子

MADS-box 家族轉錄因子參與調控植物生長發(fā)育和生殖發(fā)育過程中的多種生物學功能，尤其在花序、花、果實的生長發(fā)育過程中起重要作用[13]。中藥火麻仁中共鑒定出39 個MADS-box 家族轉錄因子，其參與調控火麻仁的營養(yǎng)和生殖結構、開花時間、花器官形成[14]，茶樹中MADS-box 蛋白CsGLO1 和CsGLO2 可形成二聚體調控第2 輪花瓣和第3 輪雄蕊的發(fā)育[15]。馬鈴薯中XAL1 蛋白參與調控其塊莖的發(fā)育[16]。甘松MADS-box 家族轉錄因子尚未見報，本研究從甘松中鑒別出20 個功能未知的MADS-box 家族轉錄因子，首次全面分析了甘松的MADS-box 家族轉錄因子，有利于進一步對甘松MADS-box 家族轉錄因子進行功能分析及后續(xù)驗證。

與擬南芥相比，甘松MADS-box蛋白相對較少。一方面與所測轉錄組序列完整度有關，另一方面可能與甘松MADS-box家族轉錄因子的重復率較高或重復后拼接丟失率較高有關。這一結果表明，不同物種間MADS-box 家族轉錄因子的差異較大，導致不同物種間MADS-box 家族轉錄因子不同，各自的功能也差別較大，具有不同的進化限制[17]。

3.2 甘松MADS-box 家族轉錄因子與其藥用價值的息息相關

抽薹開花是植物從營養(yǎng)生長到生殖生長的關鍵環(huán)節(jié)，通常稱為成花轉變[18]。多數以根莖入藥的藥材抽薹開花后藥效顯著降低。如當歸抽薹過程中，多個生理指標發(fā)生變化，開花后，營養(yǎng)物質大量消耗，根部木質化，喪失藥用價值[19]。防風以干燥根入藥，抽薹前后，其主要有效成分人參炔醇含量逐漸自根部向地上部分轉移，隨后根部開始木質化并中空腐爛，藥用價值顯著降低[20]。研究表明，MADS-box 家族中轉錄因子較多與植物抽薹開花相關。模式植物擬南芥中MADS-box 家族中AP1 蛋白能調控與抽薹相關的結構基因，與擬南芥AP1 蛋白同源的的春甘藍AP1 蛋白也對植株抽薹有調控作用[21]，十字花科植物芥菜中SOC1 蛋白可直接作用于抽薹的決定基因LFY，此外SVP 蛋白結合SOC1 能調控AP1 蛋白從而影響其抽薹。MADS-box家族轉錄因子多參與調控植物抽薹過程以及開花時間[22]。萵苣LsRGL1 蛋白可通過調控赤霉素途徑控制抽薹開花時間[18]，LSMADS16 和LSMADS37 蛋白對萵苣高溫抽薹具有負調控作用。甘松以干燥根及根莖入藥，也面臨抽薹開花后有效成分含量降低的問題，本研究鑒定出20 個甘松MADS-box 家族轉錄因子，其中NcMADS14 與擬南芥SOC1 同源，NcMADS06、NcMADS07、NcMADS13、NcMADS18與擬南芥SVP 蛋白同源明，推測這5 個蛋白可能參與調控甘松抽薹開花過程，為晰甘松MADS-box 家族轉錄因子如何調控其抽薹開花時間，減慢甘松根莖木質化過程，保證藥材藥效提供理論基礎。

3.3 甘松MADS-box 家族轉錄因子參與調控花器官發(fā)育與藥用部位的優(yōu)質生產

MADS-box 家族轉錄因子在控制植物開花時間及花器官發(fā)育中起重要作用[23]，部分參與調控植物根的發(fā)育。2001 年，Theissen[24]提出了四聚體模型即ABCDE 模型：A 類和E 類基因控制花萼的形成，A 類、B 類和E 類基因共同控制花瓣的形成，B 類、C 類和E 類基因共同控制雄蕊的形成，而心皮由C類和E 類基因共同控制，胚珠由C 類、D 類和E 類基因共同控制。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現，NcMADS04與擬南芥A 類基因FUL同源性高，其可能與甘松花萼形成相關，NcMADS16與擬南芥B 類基因AP3同源性高，推測NcMADS16可能參與調控甘松花瓣與雄蕊的形成過程。NcMADS05與擬南芥D 類基因SHP同源性高，可能參與甘松心皮的形成過程。NcMADS09、NcMADS20與擬南芥E 類基因SEP聚為一類，則二者可能為甘松的E 類基因，與ABCD類基因共同參與調控花器官的形成過程。本研究通過同源比對發(fā)現，甘松20 個MADS-box 家族中未有與擬南芥同源的C 類基因，可能是轉錄組拼接錯誤導致甘松C 類基因缺失，需繼續(xù)試驗驗證。

SOC1 為開花整合因子，可通過整合光周期途徑、春化途徑、赤霉素途徑、自主途徑、溫度途徑和年齡途徑等相關開花信號來控制開花時間[25]，已有研究表明臍橙中CsSOC1基因能響應低溫信號，表達量上調，促進臍橙成花[26]，胡蘿卜DcSOC1-1是光周期成花途徑的整合因子，長日照使胡蘿卜抽薹延遲[27]。本研究發(fā)現NcMADS14 與擬南芥SOC1同源，推測其具有與SOC1 類似的功能。

NcMADS06、NcMADS07、NcMADS13、NcMADS18 與擬南芥SVP 蛋白同源，SVP 為開花抑制因子[28]，可直接結合在開花途徑整合因子SOC1 的啟動子上，從而調節(jié)SOC1的轉錄，抑制其表達，延遲抽薹開花[29]。若將甘松中與擬南芥SOC1、SVP同源的基因合理地通過基因工程手段改造植株，則可獲得晚開花的植株。以延長甘松采收時期，加大生產。

甘松以根及根莖入藥，本課題組前期研究表明，仿野生栽培甘松須根根尖數明顯多于野生品，且主根變細，嚴重影響仿野生栽培甘松的品質[30]，ANR1是在根中特異性表達的基因，也是MADS-box 家族基因中第一個被鑒定的唯一通過NO3-對信號調控側根形成[31]。研究表明，ANR1在擬南芥根中特異性表達，菊花中CmANR1 通過同源/異源二聚體調節(jié)側根發(fā)育[32]。ANR1在水稻中的同源基因OsMADS25在NO3-存在時過表達，能顯著促進水稻主根和側根生長[10]。系統(tǒng)發(fā)育分析結果顯示，甘松MADS-box 家族基因轉錄因子中NcMADS01、NcMADS10、NcMADS11、NcMADS12、NcMADS15、NcMADS17 與擬南芥ANR1 同蛋白源性高，可能參與調控甘松根的生長發(fā)育過程。后期可通過探明其如何參與根發(fā)育調控，從而減少須根數，保持主根粗壯，從而獲得根及根莖性狀符合藥用規(guī)定且統(tǒng)一的優(yōu)良甘松品種。

4 結論

甘松MADS-box家族轉錄因子的鑒定和挖掘有待進一步完善。本研究通過了解甘松MADS-box 家族轉錄因子的生物信息學，預測其生物學功能及參與的生理過程，為后續(xù)試驗奠定基礎，也為甘松的分子生物學研究提供一定的支持。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突