肺癌的液體活檢

張驍 馬麗芳 王佳誼

肺癌是當(dāng)今社會(huì)發(fā)病率最大的惡性癌癥之一。據(jù)美國癌癥學(xué)會(huì)數(shù)據(jù)，2020年全球肺癌發(fā)病人數(shù)為220萬，居惡性腫瘤第二位，死亡人數(shù)為180萬，居惡性腫瘤第一位。肺癌按照組織病理學(xué)類型可分為小細(xì)胞肺癌（SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）。液體活檢算是臨床上病人經(jīng)?？匆妳s不太了解的檢查之一。我國惡性腫瘤發(fā)生率不斷增加，但受限于當(dāng)前檢驗(yàn)設(shè)備的多種原因，腫瘤篩選與檢測(cè)的敏感性、特異性不理想。隨著液體活檢技術(shù)的進(jìn)展，癌癥的早篩、早診獲得了諸多突破性進(jìn)展。液體活檢具有高特異度、高靈敏度、高性價(jià)比的特點(diǎn)，可以同時(shí)檢測(cè)多種癌癥，并提供準(zhǔn)確的組織溯源結(jié)果，被認(rèn)為是下一代癌癥早篩技術(shù)的突破口，得以不斷發(fā)展和推廣使用。

肺癌與液體活檢

什么是液體活檢

液體活檢（liquid biopsy），也稱液態(tài)活檢或液相活檢，是一個(gè)相對(duì)于組織活檢的概念，是指以體液為檢材獲得腫瘤生物信息的體外診斷技術(shù)?？捎糜谝后w活檢的體液包括血液、尿液、腦脊液、胸腔或腹盆腔積液等。目前醫(yī)學(xué)與科研工作中較常用的血液活檢測(cè)試項(xiàng)目根據(jù)檢測(cè)對(duì)象一般分為循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）、循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）及外泌體等。

其實(shí)，液體活檢的前身由來已久，早在1869年CTC便在癌癥患者的血液中被第一次發(fā)現(xiàn)。但是由于技術(shù)的限制，液體活檢進(jìn)入商業(yè)應(yīng)用卻是在一個(gè)世紀(jì)之后。 液體活檢于1994年由一個(gè)叫作Immunicon的公司創(chuàng)造，很快該公司被強(qiáng)生子公司——Veridex收購，隨后Veridex公司在2000年首推一款名為CellSearch的商業(yè)液體活檢測(cè)試。2004年，一款叫作CellSearch循環(huán)癌癥細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)的產(chǎn)品得到美國食品藥品管理局（FDA）許可，用于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、乳腺癌和前列腺癌的CTC篩查。2011 年基于 CTC 檢測(cè)的液體活檢概念被提出來，此后利用循環(huán)腫瘤 DNA檢測(cè)基因突變獲取腫瘤生物學(xué)信息的技術(shù)被引入液體活檢技術(shù)。2014年，歐盟批準(zhǔn)利用 ctDNA 檢測(cè) EGFR 突變可用于肺癌靶向治療（易瑞沙）的伴隨診斷。同年，可用于早期大腸癌血液檢測(cè)的Septin 9基因甲基化檢測(cè)試劑盒通過中國國家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）審核，獲得中國進(jìn)口醫(yī)療器械產(chǎn)品注冊(cè)證，將液體活檢的應(yīng)用拓展至腫瘤早篩領(lǐng)域。2015 年，液體活檢被《麻省理工科技評(píng)論》評(píng)為年度十大突破技術(shù)。在這以后，液體活檢技術(shù)開始高速發(fā)展。外泌體和腫瘤誘導(dǎo)血小板等的檢測(cè)也納入液體活檢范疇。2016年，美國FDA批準(zhǔn)了基于熒光定量 PCR（qPCR）技術(shù)的用于肺癌 ctDNA 突變檢測(cè)試劑盒。2018年中國國家藥品監(jiān)督管理局首次批準(zhǔn)血漿 EGFR 基因突變檢測(cè)用于非小細(xì)胞肺癌患者的臨床評(píng)估，標(biāo)志著我國液體活檢進(jìn)入了新的發(fā)展階段。2019年一種用于檢測(cè)前列腺癌篩查的外泌體液體活檢技術(shù)獲得美國突破性醫(yī)療器械認(rèn)定。2020 年，首個(gè)基于二代測(cè)序（NGS）的液體活檢產(chǎn)品獲得美國 FDA 批準(zhǔn)，用于實(shí)體瘤綜合基因組分析和肺癌伴隨診斷，進(jìn)一步指導(dǎo)臨床治療決策。2021年ctDNA 液體活檢獲得紐約州衛(wèi)生部臨床實(shí)驗(yàn)室評(píng)估項(xiàng)目的許可， 可用于實(shí)體瘤微小殘留病變（MRD）的檢測(cè)，拓展了液體活檢的臨床應(yīng)用范圍，標(biāo)志著液體活檢技術(shù)的發(fā)展進(jìn)入了一個(gè)新階段。2021年 7 月，中國國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)了 CytoSorter?循環(huán)上皮細(xì)胞分離儀獲得三類醫(yī)療器械注冊(cè)證，該產(chǎn)品基于微流控和免疫捕獲技術(shù)，通過對(duì)肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等多中心臨床試驗(yàn)驗(yàn)證，在臨床上用于人外周血中的循環(huán)上皮源腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分離富集。這在中國 CTC 領(lǐng)域，具有標(biāo)志性意義。與此同時(shí)，伴隨液體活檢檢測(cè)對(duì)象和臨床應(yīng)用領(lǐng)域的不斷擴(kuò)展，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR、數(shù)字 PCR、高通量測(cè)序、微流控芯片等多種檢測(cè)和分析手段也逐漸進(jìn)入臨床應(yīng)用。

液體活檢的發(fā)展歷程

液體活檢與傳統(tǒng)的組織活檢相比具有不少優(yōu)點(diǎn)。組織活檢可能引起病人出現(xiàn)氣胸、腦出血等并發(fā)癥，液體活檢對(duì)就醫(yī)患者的傷害較小，可以實(shí)時(shí)得到結(jié)果，并且可以在疾病的早期發(fā)現(xiàn)問題。如患者做普通穿刺活檢損傷大，而液體活檢則對(duì)患者的損傷更小，會(huì)較大的程度地減輕病人的痛苦。同時(shí)，在做液體活檢的過程中臨床醫(yī)生可以用其來監(jiān)測(cè)腫瘤對(duì)治療的反應(yīng)，預(yù)測(cè)預(yù)后、腫瘤復(fù)發(fā)及藥物療效。在一定時(shí)間內(nèi)采集多個(gè)血液樣本的可操作性使得醫(yī)生能更好了解腫瘤在分子生物學(xué)層面的發(fā)生發(fā)展情況。另外，大約25%的肺癌活檢由于獲取的組織樣品過少而影響患者診斷和病情評(píng)估，組織活檢難以重復(fù)，獲取的腫瘤信息受樣本異質(zhì)性影響較大，只能反映取材部位信息，而液體活檢獲取較為輕松，可以提供準(zhǔn)確的組織溯源結(jié)果。但是液體活檢對(duì)檢測(cè)技術(shù)靈敏度和特異性要求高，質(zhì)量控制難度大，在早期腫瘤患者檢測(cè)結(jié)果與組織活檢結(jié)果會(huì)存在不一致。目前組織活檢仍是腫瘤分子診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，在能獲取組織樣本的情況下，組織檢測(cè)仍為首選，液體活檢還不能全面取代組織活檢，但是二者相互補(bǔ)充可為臨床提供更可靠的結(jié)果。

液體活檢的取材

液體活檢的開展依賴于體液。體液是人體的重要組成部分，在成年男性和女性的所占比重分別為60%和55%。人體各種組織和器官通過體液不斷進(jìn)行物質(zhì)和能量交換，維持機(jī)體功能正常運(yùn)轉(zhuǎn)，腫瘤來源的相關(guān)物質(zhì)可進(jìn)入體液中，為液體活檢的開展提供了可能。

血液血液是目前在液體活檢中應(yīng)用最廣泛的樣本類型，更重要的是作為人體進(jìn)行物質(zhì)和能量交換的樞紐，其中匯集了腫瘤細(xì)胞生長、代謝及凋亡（死亡）所釋放的能夠反映腫瘤生物學(xué)特征的物質(zhì)。

尿液尿液是除血液外可匯集全身代謝產(chǎn)物和各種組織相關(guān)物質(zhì)的樣本類型，尿液來源的脫落腫瘤細(xì)胞還可作為泌尿系統(tǒng)腫瘤檢測(cè)對(duì)象。尿液收集時(shí)已在膀胱中儲(chǔ)存過一段時(shí)間，成分相對(duì)穩(wěn)定，質(zhì)控相對(duì)容易。更重要的是尿液不像血液那樣被內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的機(jī)制控制在一個(gè)穩(wěn)定的范圍之內(nèi)，尿液收集更早期的變化，是早期標(biāo)志物的更好來源。吸附干燥真空技術(shù)可用于在膜上保存尿液中的大分子成分，做到長期保存，為早期腫瘤標(biāo)志物探索和鑒定提供重要的生物樣本支持。

腫瘤局部體液在腫瘤的原發(fā)部位或轉(zhuǎn)移部位，腫瘤的侵襲會(huì)導(dǎo)致體液的滲（漏）出，包括胸水、腹水、腦脊液等。這些體液靠近腫瘤組織，含大量腫瘤來源的細(xì)胞及其他腫瘤相關(guān)成分，十分適合用來液體活檢。胸腹水和腦脊液的獲取一般需要通過穿刺引流，雖然有創(chuàng)，但可在治療性引流同時(shí)獲取，患者更好接受。在液體活檢標(biāo)本的選擇上，這類樣本的優(yōu)先級(jí)更高，優(yōu)于血液樣本。

唾液正常人每天分泌唾液大約為1.0～1.5 L。唾液中的有機(jī)物質(zhì)一般是黏蛋白、淀粉酶等，含有游離核酸，可用于檢測(cè)基因變異。目前的研究已經(jīng)證實(shí)采用唾液樣本進(jìn)行液體活檢的可行性。

其他體液除了上述的體液類型之外，痰液、淚液、淋巴液、汗液、痰液以外的黏液、乳汁以及精液等也都是常見的體液標(biāo)本，但是這些標(biāo)本用于液體活檢的報(bào)道少見。

液體活檢的檢測(cè)對(duì)象

液體活檢的檢測(cè)對(duì)象主要有游離核酸、腫瘤細(xì)胞、細(xì)胞外囊泡、血小板等。

循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）在體內(nèi)環(huán)境中，包括血漿、腦脊液、尿等，可以檢查到一種游離的DNA片斷，被稱之為循環(huán)游離DNA。人體細(xì)胞在生理和病理情況下的凋亡和壞死會(huì)釋放片段化 DNA，成為游離DNA。它們既有來源于正常細(xì)胞的DNA，又有來源于癌癥細(xì)菌的DNA，而它們又稱之為循環(huán)腫瘤DNA，因?yàn)榫哂蟹纸饪斓奶攸c(diǎn)，其濃度的改變能夠更精準(zhǔn)地表達(dá)腫瘤負(fù)荷，為癌癥檢測(cè)、微小殘留病灶預(yù)后研究、轉(zhuǎn)移控制等帶來關(guān)鍵數(shù)據(jù)。

循環(huán)腫瘤 RNA（ctRNA）游離的長片段 RNA（mRNA、rRNA、tRNA、lncRNA）在體液中很易降解，循環(huán)腫瘤 RNA 主要指 microRNA（miRNA），負(fù)責(zé)調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)。人類目前已發(fā)現(xiàn)超過2 500種不同的 miRNA。每一種可直接或間接調(diào)節(jié)關(guān)鍵細(xì)胞進(jìn)程，例如增殖、分化，DNA 修復(fù)和凋亡，發(fā)揮癌基因/抑癌基因的功能，因此可通過對(duì)其的檢測(cè)補(bǔ)充腫瘤診斷。有指南提出tRNA可以作為腫瘤標(biāo)志物，但個(gè)人觀點(diǎn)，tRNA 因?yàn)闊o法區(qū)別來自正常細(xì)胞還是腫瘤細(xì)胞，較難作為腫瘤標(biāo)志物。miRNA 在體液中較為穩(wěn)定。血清 miRNA置于各種極端苛刻環(huán)境下，仍可保持穩(wěn)定，且能長期儲(chǔ)存。這些優(yōu)勢(shì)使循環(huán) miRNA 成了非常有前景的生物標(biāo)志物，但 miRNA檢測(cè)的特異性和重復(fù)性是臨床轉(zhuǎn)化需要解決的問題。多數(shù) miRNA并不特異針對(duì)某一種腫瘤類型，因此，以單個(gè) miRNA 作為某種腫瘤診斷或預(yù)后的生物標(biāo)志物并不可行，多個(gè)miRNA 的組合（miRNA 表達(dá)譜）的定量檢測(cè)可能更有應(yīng)用潛力。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC） 1869年，病理學(xué)家從腫瘤死亡病人血液中發(fā)現(xiàn)有一種細(xì)胞，其形狀和癌細(xì)胞形態(tài)類似，將它命名為循環(huán)腫瘤細(xì)胞，它的主要來源為實(shí)體腫瘤病灶。原發(fā)或繼發(fā)的實(shí)體腫瘤病灶自動(dòng)脫離或受外科手術(shù)、切片取出等外部影響而被動(dòng)脫離，使CTC作為腫瘤轉(zhuǎn)移的“種子”進(jìn)入外周血。CTC以不同形態(tài)存在于外周血中，既有游離的單個(gè)CTC，也有聚集成團(tuán)的細(xì)胞團(tuán)， 通過循環(huán)系統(tǒng)完成轉(zhuǎn)移播散。腫瘤細(xì)胞突破基底膜進(jìn)入血流形成循環(huán)腫瘤細(xì)胞是腫瘤進(jìn)展的重要標(biāo)志。這個(gè)細(xì)胞群體有異質(zhì)性，彼此間在細(xì)胞大小和形狀、分子表型、活力程度、轉(zhuǎn)移潛力、繁殖潛力等各方面可能均有差異。作為惡性腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的“種子”，CTC 在患者血液中出現(xiàn)與否及其數(shù)量多少，一方面代表著原發(fā)惡性腫瘤浸潤入血液中的時(shí)間，另一方面預(yù)示著在較遠(yuǎn)端器官形成轉(zhuǎn)移灶的可能性。CTC 在外周血中數(shù)量稀少，其稀有性和異質(zhì)性為檢測(cè)提出了極大挑戰(zhàn)。獲得數(shù)量和質(zhì)量都能滿足下游分析要求的 CTC 是開展相關(guān)檢測(cè)和研究的先決條件。除外周血的 CTC 外，腫瘤局部體液也會(huì)含有大量腫瘤脫落細(xì)胞，這些細(xì)胞在數(shù)量上比 CTC 更多，收集相對(duì)方便，也是非常理想的液體活檢材料。

外泌體（EVs）外泌體為外表呈凹半球狀的類囊泡小體，帶有立體膜構(gòu)造 ，口徑大約為30～150 nm。外泌體廣泛分布于各種體內(nèi)環(huán)境，外泌體可以對(duì)其內(nèi)含物質(zhì)進(jìn)行較好保存，使外泌體成為液體活檢的重要潛在目標(biāo)。腫瘤微環(huán)境能增加外泌體的異質(zhì)化，改變外泌體大小及內(nèi)容物的功能，促進(jìn)外泌體釋放，不同的癌癥衍生的外泌體差異很大。外泌體的分離和純化仍是一個(gè)技術(shù)挑戰(zhàn)，目前耗時(shí)費(fèi)力難以質(zhì)控的分離純化步驟仍然是外泌體液體活檢臨床應(yīng)用的主要限制因素。

液體活檢的取材和檢測(cè)對(duì)象

腫瘤誘導(dǎo)血小板（TEP）血小板細(xì)胞指直徑為2～4 μm的無核人血細(xì)胞，取自人骨髓內(nèi)的巨核細(xì)胞，半衰期短，僅為7～10天，在人體血液循環(huán)中數(shù)量僅次于紅細(xì)胞。除了參與止血和血栓形成，血小板在癌癥發(fā)展的全過程中有著至關(guān)重要的地位。在血液中，循環(huán)腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致血小板凝聚，產(chǎn)生血小板細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞復(fù)合體，幫助腫瘤細(xì)胞抵抗因血液剪接力造成的機(jī)械傷害和保護(hù)腫瘤細(xì)胞逃脫免疫系統(tǒng)的攻擊。循環(huán)血小板在其整個(gè)生命周期內(nèi)一方面與腫瘤細(xì)胞相互作用，獲取腫瘤相關(guān)的生物分子；另一方面還可以不斷攝取并富集循環(huán)中游離的蛋白質(zhì)、核酸以及囊泡、顆粒等。經(jīng)此，血小板如同被“教育”了一般，其蛋白質(zhì)組和 RNA 表達(dá)譜發(fā)生顯著變化，因此被稱為"腫瘤誘導(dǎo)血小板"。同時(shí)得益于其封閉的膜結(jié)構(gòu)，其獲得腫瘤相關(guān)的生物學(xué)信息得以完整保存，成為腫瘤來源的生物活性分子的大而濃縮的生物儲(chǔ)存庫?；谝陨线@些原因，腫瘤誘導(dǎo)血小板成為腫瘤液體活檢的新型檢測(cè)對(duì)象。

小結(jié)

由于非小細(xì)胞肺癌靶向與免疫治療的廣泛應(yīng)用，液體活檢的相對(duì)非侵入方法對(duì)血漿或體液中癌癥細(xì)胞和相應(yīng)癌癥分子標(biāo)志進(jìn)行檢測(cè)成為最活躍的應(yīng)用領(lǐng)域。CTC、ctDNA 以及外泌體是腫瘤液體活檢最主要的三個(gè)檢測(cè)對(duì)象。三者提供的檢測(cè)內(nèi)容不同，互為補(bǔ)充。液體活檢的意義在于可對(duì)腫瘤的治療過程進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)，如治療反應(yīng)、進(jìn)展、耐藥確定。液體活檢在即時(shí)性、準(zhǔn)確度、無創(chuàng)性等方面都有著巨大的優(yōu)越性。液體活檢的無創(chuàng)性能夠減少肺癌病人的恢復(fù)期，利用ctDNA、CTC和外泌體的探測(cè)方法能獲得組織活檢不能獲得的動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)，可以即時(shí)觀察病人診斷后的癥狀改變以及推測(cè)病人的預(yù)后情況。醫(yī)學(xué)上還無法把液體活檢獲得的數(shù)據(jù)當(dāng)作唯一的依據(jù)，但是可以把液體活檢和組織活檢、影像技術(shù)及其他檢驗(yàn)技術(shù)結(jié)合到一起進(jìn)行病人的醫(yī)學(xué)診斷。