利用CRISPR/Cas9技術構建基因編輯大鼠模型

劉梅珍，王立人，李詠梅，馬雪云，韓紅輝，李大力

利用CRISPR/Cas9技術構建基因編輯大鼠模型

劉梅珍，王立人，李詠梅，馬雪云，韓紅輝，李大力

華東師范大學生命科學學院，上海 200241

RNA介導的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)由單鏈引導RNA(sgRNA)與核酸酶Cas9構成。在細胞內，sgRNA能夠按照堿基互補配對的原則引導Cas9與靶點結合，由Cas9切割目標DNA，造成雙鏈DNA斷裂(double stranded break, DSB)。在隨后的DNA修復過程中，細胞主要進行非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)或在有修復模板存在的情況下進行重組修復(homology directed repair, HDR)。如果將CRISPR/Cas9系統(tǒng)以及修復模板通過顯微注射的方式導入大鼠的胚胎內，就能借助細胞的修復機制實現大鼠胚胎的基因編輯，由此構建各種基因修飾大鼠模型。本文詳細介紹了利用CRISPR/Cas9基因編輯技術構建大鼠模型的具體操作步驟，以期為相關領域的科研人員提供一種大鼠基因修飾模型的構建方法。

大鼠；CRISPR/Cas9；基因編輯；基因敲除

小鼠()和大鼠()是生物學研究中最為常見的模式動物。兩者都具有易飼養(yǎng)、遺傳譜系清晰、品系種類豐富等優(yōu)點。小鼠ES細胞打靶技術在20世紀80年代末崛起并逐步走向成熟。在相當長的時間內逐步累積了各種不同的疾病模型品系，成為各類科研工作者的首選模式動物[1]。相反，由于大鼠的ES細胞培養(yǎng)和打靶技術遲遲未能普及，使其漸漸失去了與小鼠相當的模式動物地位。但是，大鼠作為疾病動物模型有許多小鼠無法替代的優(yōu)勢。首先，大鼠的體型大于小鼠，能夠提供更多的組織與血液標本，這一點在藥理學、代謝類疾病的研究上尤其重要；其次，大鼠在臟器比例上與人類更接近，相對更大的個體也降低了各種手術操作的難度，使其成為諸如心血管研究、神經生物學等領域的理想模式動物。大鼠的智力遠高于小鼠，在行為學上也比小鼠更加接近人類，適合進行各類腦功能與認知領域疾病的硏究。同時研究發(fā)現，一些大鼠疾病模型能夠很好地模擬環(huán)境因素帶來的影響。如大鼠糖尿病模型能夠模擬壓力、毒素、飲食、等對于疾病進展的影響[2]。隨著人工核酸酶技術尤其是CRISPR/Cas9技術的發(fā)展，大鼠模型的構建變得非常高效和便捷[3]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在大鼠胚胎細胞中有著與小鼠相當的高編輯效率，使進一步開發(fā)大量大鼠疾病動物模型成為可能[4]。

CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種RNA介導的適應性免疫系統(tǒng)，主要存在于細菌或古細菌中[5,6]，可以保護菌株免受病毒或外源質粒的入侵。源自化膿性鏈球菌(sp.yCas9)的II型CRISPR/Cas9系統(tǒng)已被改造并廣泛用于基因編輯[4～7]，該系統(tǒng)的主要組成部分是crRNA、tracrRNA和Cas9核酸酶。在細菌體內，Cas9能夠與crRNA:tracRNA形成復合物，而crRNA上帶有與靶序列互補配對的RNA序列，稱為protospacer[5,6]。不同的Cas9蛋白能夠識別并結合靶序列上的PAM(protospacer adjacent motif)序列，對于sp.yCas9而言，PAM序列為NGG。結合PAM序列后，引導RNA便開始了與靶序列的互補配對過程，靶序列與protospacer完全互補后，便會促進Cas9發(fā)生構象變化，切割靶序列DNA造成雙鏈DNA斷裂(double stranded breaks, DSBs)。由于DSBs具有細胞毒性，細胞探測到DNA損傷后，修復反應隨即被啟動。在哺乳動物細胞中，主要通過兩種途徑進行修復：非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)和同源介導的修復(homology directed repair, HDR)。NHEJ以一種容易出錯的方式促進DSB末端的直接連接，通常會導致隨機的插入、缺失和替換。HDR修復則需要一個同源序列作為模板進行高保真修復，可用于在大鼠基因組中制造點突變、精準缺失、條件性敲除或報告基因敲入等。一般來說，雙鏈DNA或單鏈寡核苷酸(ssODNs)都可以用作供體模板。本文以構建B型血友病大鼠模型為例，詳細介紹了利用CRISPR/Cas9技術構建大鼠疾病動物模型的具體操作步驟(圖1)。

1 材料、試劑及設備

1.1 實驗所需材料與試劑

詳見表1。

圖1 利用CRISPR/Cas9技術構建大鼠模型流程圖

表1 實驗相關材料及試劑

1.2 溶液配方

詳見表2。

表2 實驗所需溶液配方

2 實驗步驟

2.1 sgRNA與Cas9 mRNA的制備

(1)在設計靶基因的sgRNA前，建議對野生型大鼠的靶基因區(qū)段進行測序，或通過在線數據庫(如NCBI)得到靶基因的序列。可利用在線sgRNA設計平臺(https://design.synthego.com/#/)分析得到目的基因的靶點序列(20 bp)的信息，從中選擇編輯效率評分高，脫靶評分低的靶點。以大鼠F9基因為例，選取的sgRNA序列為：5′-GAGATATAAC-TCAGG-GAAAC-3′。sgRNA的骨架序列為：5′-GTTTT-AG-AGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTC-CGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCG-GTGC-3′。以化學合成的方式獲得sgRNA全長序列。雖然也可以通過PCR結合體外轉錄的方式獲得sgRNA全長序列，但根據經驗化學合成的sgRNA具有更高的動物模型構建成功率。

(2)以px260質粒為模板，以5′-CAATGGG-TGGAGTATTTACGG-3′為正向引物，5′-GGAAA-GGACAGTGGGAGTG-3′為反向引物進行PCR，獲得NLS-Cas9-NLS的DNA轉錄模板。利用sp6轉錄試劑盒并按照說明書流程進行轉錄和純化。Cas9 mRNA也可以在美國Thermo fisher公司(A29378)購買。

(3)顯微注射液的配置：利用無RNA酶TE-buffer配置Cas9/sgRNA注射緩沖液(Cas9：25 ng/μL；sgRNA：12.5 ng/μL)。

2.2 移卵管、顯微注射針以及固定吸管的制備

2.2.1 制備移卵管

兩手捏著微毛細管兩端，管中間放在酒精燈外焰灼燒3～5 s后，離火快速向兩邊拉，使微毛細管均勻變細，變細的長度為6～7 cm，總長為10～12 cm為宜(圖2)。細管中間用砂輪劃斷，切口平整，斷端在火焰中來回使切口邊緣圓潤。移卵管口大小為比受精卵稍大一點點即可。連接吸氣軟管等附件即可。

2.2.2 制備注射針

取一根玻璃管放置在拉針儀(美國Sutter Instru-ment公司, Flaming/Brown Micropipette Puller, P-97) 上，固定兩端后打開電源，設置參數如下，點擊“PULL”鍵待程序完成，取出其中一邊的玻璃針制作固定吸管(見2.2.3)，另一邊玻璃針作為顯微注射針。拉針儀設置參數如表3所示。

圖2 移卵管的制作示意圖

2.2.3 制備固定吸管

按照上述制備注射針方法拉針后，取出拉針儀一側的玻璃針固定在煅針儀固定夾上，針尖朝下，使其于煅針儀(日本NARISHIGE SCIENTIFIC INSTRUMENT公司, MF-830)的顯微視野內，上下移動到適當孔徑大小，腳踏加熱源控制器，進行固定吸管的制作(圖3)。固定吸管的內外徑分別為30 μm、80 μm較為合適。

2.3 結扎公鼠的制備(腹部切開法)

(1) 選取7～8周的SD雄鼠。應選擇毛色具有光澤、機警、行動靈活的健康個體。

(2) 異氟烷吸入性(5%)麻醉大鼠。此后操作均在異氟烷維持麻醉(3%)的情況下進行。

表3 利用拉針儀制作固定吸管與纖維注射針的參數設置

*每一列的數值為Sutter P-97拉針儀所顯示數值，單位的儀器內部單位。

(3) 將雄鼠腹部朝上放在手術臺上，用70%乙醇噴灑雄鼠腹部，用棉球擦凈。用剪刀剪開下肢上緣水平線位置的皮膚沿腹中線切口1.5 cm (圖4)，在腹壁肌肉切口，并鈍性分離肌肉層約1 cm的口，暴露腹腔。

(4) 用11 cm無齒鑷子輕輕夾住肌肉固定，用另一鑷子探測脂肪墊右側位置(必要時將脂肪墊夾出)，輸精管位于脂肪墊側緣，一小部分游離，伴行血管易于識別，夾住稍微拖拉下，分離系膜后用加熱的煅熔筆(Gutta cutter, 佛山市御田醫(yī)療科技有限公司，VT-06)燒掉一段輸精管；若有夾出脂肪墊睪丸等組織，將其一一送回腹腔內(圖5)。重復以上步驟，處理另一側輸精管。最好將燒斷一段的輸精管放在一張紙上，以便檢查和確認每只鼠的兩側輸精管都結扎過。依次結節(jié)縫合腹壁肌和皮膚。

圖3 利用煅針儀煅針制作固定吸管

圖4 術口位置

陰莖海綿體上方1.5 cm處腹中線位置，切口長度以1.5 cm為宜。

(5) 術后將鼠放置于干凈的鼠籠內，籠盒放在保溫臺上，直到其蘇醒為止。術后兩周即可與母鼠交配制備假孕母鼠?？梢允褂靡荒曛烈荒臧朐偬蕴?。

圖5 利用熔斷筆進行大鼠輸精管切除手術

2.4 準備假孕母鼠

(1) 購買7～8周齡的SD雌鼠，觀察3天后備用。

(2) 制備假孕大鼠的前一天下午，挑選健康活潑、腹部飽滿的雌鼠與結扎公鼠合籠，按1只雄鼠與1只雌鼠的比例合籠。

(3) 次日早晨8:00～10:00檢栓：左手拇指和食指向上提起鼠尾巴中部，手外緣頂住尾骨，露出陰道，右手用一個鈍頭彎鑷撥開陰道口，可見有乳白色的栓塞，即為假孕母鼠，檢出備用(圖6)。

2.5 胚胎供體雌鼠超排卵(以SD大鼠為例)

(1) 購買所需品系大鼠，周齡6～7周為宜；觀察3天后備用。

(2) 第一天中午13:00～14:00 注射PMSG，劑量為20 IU/只，注射方式為腹腔注射。

(3) 48 h后腹腔注射HCG，劑量為30 IU/只。與成年雄鼠按1∶1比例合籠。

(4) 次日早晨8:00檢栓，同檢測假孕鼠方法，檢出備用。未觀察到栓塞的鼠按照3只/籠飼養(yǎng)，一周后可再次使用。

2.6 受精卵獲3取

(1) 有栓的大鼠，用異氟烷(5%)麻醉后取出，脫頸安樂死，腹部朝上，噴灑70%酒精消毒后切開腹部皮膚及肌肉層，暴露腹腔，找到左右兩側的輸卵管并剪下。

圖6 檢查母鼠陰栓操作圖示

(2) 輸卵管放置在有透明質酸酶的M2溶液中，顯微鏡下用精細鑷子撕開輸卵管的膨大部，受精卵在壓力下自動留出管腔外，移除取完后的輸卵管。

(3) 受精卵脫顆粒：由于大鼠受精卵表面的顆粒細胞較難脫去(區(qū)別于小鼠受精卵)，作用時間較小鼠受精卵脫顆粒長，一般需要3～5 min甚至更長時間。用移卵管多次吸吹受精卵將有利于脫顆粒。

(4) 受精卵脫顆粒后用移卵管移到無透明質酸酶的M2培養(yǎng)液中，洗滌3～4次以清除殘留的透明質酸酶后，移到KSOM培養(yǎng)滴(每個液滴約25 μL，一個皿可滴3～5個液滴，上面覆蓋礦物油放置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)待注射)。

2.7 顯微注射

(1) 將固定吸管安裝在倒置顯微鏡左邊的顯微操作系統(tǒng)的固定臂上，旋緊，調整合適的角度。用微量上樣針(德國Eppendorf公司, micro-loaderTM)吸取5～10 μL待注射樣品，將樣品推入制備好的注射針針尖端位置。

(2) 將顯微注射針安裝在倒置顯微鏡右邊顯微操作系統(tǒng)的注射臂上，旋緊，調整合適的角度。利用同側的顯微操作儀(德國Eppendorf公司, TransferMan NK 2 micromanipulator, 92000001)將其調到合適的顯微視野內，與固定吸管相對。顯微注射針自針尖起20 μm處的外徑為4 μm時，可以獲得較好的注射效果。針尖太粗會導致插入透明帶及原核的阻力增加，且DNA流量過多，受精卵易于裂解。針尖太細則導致針內DNA流速過慢，且易阻塞，使DNA無法順利流入，影響最終的整合效率。

(3) 將一硅化載玻片放在倒置顯微鏡載物臺上，取25 μL的M2培養(yǎng)液形成豎形液滴，用礦物油將其全部覆蓋，防止液體蒸發(fā)。

(4) 將受精卵移到玻片的液滴內，依次排列成一直線。首視野為受精卵線的下面，注射時依次上移視野。

(5) 固定吸管位置由左側顯微操作儀調節(jié)固定臂實現，使固定吸管前端口調到合適的顯微視野內。固定吸管的壓力由右手調節(jié)右側固定泵來固定受精卵。

(6) 注射針位置由右側顯微操作儀調節(jié)注射臂實現，使注射針尖在合適的顯微視野內。注射流量大小由左側注射泵調節(jié)。

(7) 調整顯微鏡倍數，由低倍數到高倍數。注射物鏡鏡頭用RC鏡頭，可以清晰可見受精卵的形態(tài)及原核。

(8) 注射：左邊的固定吸管吸取一個受精卵，右邊的顯微注射針依次扎入透明帶和卵膜內(圖7)，見有微量液流進入胞漿內后，抽離受精卵；固定吸管釋壓，受精卵推到視野下方。非受精、畸形等無效卵吹移到右邊。

(9) 注射滴內的受精卵注射完成后，吸取良好的受精卵移到KSOM培養(yǎng)滴中，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min左右，待移植。

2.8 受精卵移植

(1) 檢測出來有栓的假孕大鼠放在麻醉箱內，異氟烷吸入性麻醉大鼠(5%)；此后操作均在異氟烷維持麻醉(3%)情況下操作。

(2) 吸入受精卵前先在移植管中吸入少量M2培養(yǎng)液，再吸入一個小的氣泡，然后再吸入M2培養(yǎng)液，之后再吸入第二個小氣泡，如此重復直到降低虹吸作用能夠很好的控制液體的進出為止。

(3) 將受精卵(10～15枚)及盡可能少的M2培養(yǎng)液吸入移植管(高度大約為5～7 mm)，在移植管的末端再吸入一個小氣泡。

(4) 將連接嘴控制管的移植管搭在體式顯微鏡目鏡架上備用，直到輸卵管胚胎移植。

(5) 用寵物推子去掉大鼠右側大腿前沿上2～3 cm周圍的毛，用70%酒精棉球消毒剃毛過的皮膚并擦去殘留的毛發(fā)(圖8)。

(6) 觀察背中線從最后肋骨附近透過皮膚可見背腹部內有白色的脂肪墊的位置(左右兩側都有)，用帶鉤鑷子小心夾起皮膚用剪刀在皮膚上剪一個小口，鈍性分離該切口約1.5 cm，再用帶鉤鑷子避開血管夾取肌肉，避開血管剪一個小口并鈍性分離，切口只要能拉出脂肪墊(白色)和卵巢(粉色)即可(圖9)。

圖7 大鼠受精卵顯微注射

圖8 假孕大鼠進行胚胎移植手術切口位置

(7) 將鼠放到體式顯微鏡基座上(型號szx10)。大鼠的頭朝左側，尾朝右側橫放(左右輸卵管移植體位一致)。

(8) 動脈夾夾住卵巢上的脂肪墊，搭在脊背上起固定作用，在顯微鏡下找到輸卵管的開口(輸卵管傘)和卵巢囊之下膨大的輸卵管壺腹部位置。卵巢囊是輸卵管和卵巢周圍的一層有血管分布透明的膜。調整好大鼠及輸卵管的位置，以便于很容易將移植管進入輸卵管。用精密手術鑷子在輸卵管傘部的卵巢囊上撕開一個小口(要注意避開血管，否則影響操作視野)，找到輸卵管口。

(9) 左手用直鑷子小心固定輸卵管傘，右手用彎鑷探測輸卵管口的位置后，將移植管插入輸卵管開口，將胚胎吹入輸卵管壺腹部。若在輸卵管內看到氣泡就說明移植成功。也可選擇精細手術剪于輸卵管膨大部和輸卵管口之間合適位置剪個斜切口，將受精卵吹入膨大部內?？蛇M行單側輸卵管移植(15～ 20枚受精卵)，也可雙側移植(每側10枚左右為宜)。

(10) 松開動脈夾，將大鼠從顯微鏡臺上取下，用普通手術鑷子(不帶鉤的)夾取脂肪墊，將子宮、輸卵管、卵巢等放回腹腔。分別結節(jié)縫合肌肉層和皮膚。

(11) 術后將大鼠放置于干凈的鼠籠里，鼠籠放置于37℃的恒溫加熱臺上，直至蘇醒。

圖9 術口曳出卵巢及脂肪墊

A：紅色箭頭所示為卵巢，藍色箭頭所示為脂肪墊組織；B：卵巢囊相對位置示意圖。

2.9 基因型鑒定

(1) 設計基因鑒定PCR引物。靶點的兩側與正反向引物的3′端保留50 bp以上的距離以便后續(xù)通過一代測序結果進行初步分析。以構建的B型血友病大鼠模型為例。PCR正向引物(P1)：5′-TCA-TT-ATTGACACTCAACCGAT-3′；反向引物(P2)：5′- GATGTGGACTCCTTTCCTTTT-3′。PCR擴增產物長度為747 bp (圖10)。

(2)實驗組和對照組樣品收集。胚胎移植后在新生大鼠出生的第5～7天，剪取其尾尖組織或腳趾。同時收集1～2組野生型大鼠尾尖組織或腳趾作為對照組。每份組織分別放入1.5 mL離心管中，加入500 μL消化液和1 μL 蛋白酶K母液。在55℃水浴消化約8 h。

(3) 利用酚氯仿-乙醇沉淀法抽提大鼠的基因組DNA并將其溶解在30～50 μL無核酸酶的水中。

(4) PCR反應體系見表4。在PCR儀上于98℃預加熱30 s，使模板DNA充分變性，然后進入擴增循環(huán)。在每一個循環(huán)中，先于98℃保持15 s使模板變性然后將溫度降到復性溫度(合適的退火溫度)，一般保持30 s，使引物與模板充分退火；在72℃保持20 s，使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一個循環(huán)。重復這樣的循環(huán)30次，使擴增的DNA片段大量累積。最后，在72℃保持3～7 min，使產物延伸完整，4℃保存。取5 μL PCR產物點樣觀測，如產物特異則可以進行后續(xù)Sanger測序。

表4 基因型鑒定的PCR反應體系

(5) F0(Founder)代大鼠基因型分析。PCR產物純化后可進行Sanger測序。F0代大鼠可能是嵌合子通過Sanger測序時序列在接近靶點處會出現套峰，為便于分析可通過在線網站(https://ice.synthego.com)分析該嵌合子中可能存在的基因型(圖11)。

(6) 通過Founder大鼠與野生型大鼠交配可得到F1代雜合子。利用上述基因鑒定的方法再次鑒定F1代大鼠的基因型。利用相同基因型的F1代大鼠之間交配可以得到F2純合大鼠。

(7) 表型鑒定。對于不同基因編輯的大鼠模型，還需要建立相應的表型鑒定方法。以本文構建的B型血友病大鼠模型為例。F9基因參與體內的凝血級聯反應，F9基因缺失的大鼠將表現為凝血功能異常，并伴有關節(jié)腫大。我們對8周左右F2代純合型大鼠進行觀察，可明顯觀察到F9敲除大鼠的關節(jié)腫大(圖12A)。眼眶取血后檢測大鼠的凝血酶原時間(prothrombin time, PT)與活化部分凝血活酶時間aPTT)，B型血友病大鼠模型的表型PT時間正常(表示外源性凝血途徑正常)，aPTT時間延長(圖12B)。

3 結語

長久以來，大鼠一直是實驗室中很有價值的模式動物，其較大的體型使其一度受到生理與藥理學研究者的青睞。然而由于早期缺乏大鼠胚胎干細胞的培養(yǎng)手段以支持相應的ES細胞打靶技術，使得大鼠的基因編輯動物模型構建在起步時落后于小鼠。直到ZFN、TALEN這兩種核酸酶技術出現之后，大鼠的胚胎編輯才得到了一定程度的改觀。但由于這兩種技術在載體構建上都較為繁瑣，所以直到CRISPR/Cas9技術出現以后，才真正實現了在大鼠胚胎內進行高效、靈活地進行基因編輯。利用CRISPR/Cas9技術，對于不同的基因靶點只需合成相應的引導RNA便能夠靈活地切換靶點，甚至實現同時編輯多個基因位點[7]。本實驗室曾利用該技術構建了多種大鼠基因編輯疾病模型，包括高草酸尿癥模型[8]、酪氨酸血癥模型[9]、血友病模型等[10]。綜上所述，本文詳細介紹了如何利用CRISPR/Cas9技術構建基因編輯大鼠模型，以及如何進行常規(guī)表型的鑒定等步驟，為大鼠疾病動物模型的構建提供了一種簡易且高效的方法，同時也讓大鼠這一經典的模式動物重新回到研究人員的視野，成為候選模式動物。在實驗顯微注射與胚胎移植的操作方面，大鼠的操作基本與小鼠一致，大鼠的體型更能從一定程度上降低了實驗的難度。需要注意的是，大鼠受精卵脫顆粒需要較長時間；另外輸卵管口位置的囊膜上多數會有較粗的血管，需要小心避開。

圖10 鑒定B型血友病大鼠模型的引物設計示意圖

P1為正向引物，P2為反向引物。

圖11 利用Sanger測序結果分析F0代B型血友病大鼠基因型

通過在線網站(https://ice.synthego.com)分析得出的F0代大鼠靶點區(qū)域所包含的基因型。

圖12 B型血友病大鼠模型表型鑒定

A：紅色箭頭所示位置為B型血友病大鼠自發(fā)性關節(jié)腫大；B：F9–/–大鼠PT與aPTT時間。n.s.：無顯著差異；***<0.001。

[1] Geurts AM, Moreno C. Zinc-finger nucleases: new strategies to target the rat genome., 2010, 119(8): 303–311.

[2] Kottaisamy CPD, Raj DS, Prasanth Kumar V, Sankaran U. Experimental animal models for diabetes and its related complications-a review., 2021, 37(1): 23.

[3] Qiu Z, Liu M, Chen Z, Shao Y, Pan H, Wei G, Yu C, Zhang L, Li X, Wang P, Fan HY, Du B, Liu B, Liu M, Li D. High-efficiency and heritable gene targeting in mouse by transcription activator-like effector nucleases., 2013, 41(11): e120–e120.

[4] Li D, Qiu Z, Shao Y, Chen Y, Guan Y, Liu M, Li Y, Gao N, Wang L, Lu X, Zhao Y, Liu M. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system., 2013, 31(8): 681–683.

[5] Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity., 2012 , 337(6096): 816–821.

[6] Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, Zhang F. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems., 2013, 339(6121): 819–823.

[7] Wang H, Yang H, Shivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zhang F, Jaenisch R. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering., 2013, 153(4): 910–918.

[8] Zheng R, Li Y, Wang L, Fang X, Zhang J, He L, Yang L, Li D, Geng H. CRISPR/Cas9–mediated metabolic pathway reprogramming in a novel humanized rat model ame-liorates primary hyperoxaluria type 1., 2020, 98(4): 947–957.

[9] Shao Y, Guan Y, Wang L, Qiu Z, Liu M, Chen Y, Wu L, Li Y, Ma X, Liu M, Li D. CRISPR/Cas-mediated genome editing in the rat via direct injection of one-cell embryos., 2014, 9(10): 2493–2512.

[10] Guan Y, Ma Y, Li Q, Sun Z, Ma L, Wu L, Wang L, Zeng L, Shao Y, Chen Y, Ma N, Lu W, Hu K, Han H, Yu Y, Huang Y, Liu M, Li D. CRISPR/Cas9-mediated somatic correction of a novel coagulator factor IX gene mutation ameliorates hemophilia in mouse., 2016, 8(5): 477–488.

Generation of genetically modified rat models via the CRISPR/Cas9 technology

Meizhen Liu, Liren Wang, Yongmei Li, Xueyun Ma, Honghui Han, Dali Li

The RNA-guided CRISPR/Cas9 genomic editing system consists of a single guide RNA (sgRNA) and a Cas9 nuclease. The two components form a complex in cells and target the genomic loci complementary to the sgRNA. The Cas9 nuclease cleaves the target site creating a double stranded DNA break (DSB). In mammalian cells, DSBs are often repaired via error prone non-homologous end joining (NHEJ) or via homology directed repair (HDR) with the presence of donor DNA templates. Micro-injection of the CRISPR/Cas9 system into the rat embryos enables generation of genetically modified rat models. Here, we describe a detailed protocol for creating gene knockout or knockin rat models via the CRISPR/Cas9 technology.

rat; CRISPR/Cas9; genome editing; gene knockout

2022-11-10;

2022-12-23;

2023-01-01

國家自然科學基金杰出青年基金項目(編號：32025023 )，國家自然科學基金面上項目(編號：81873685，31971366)，國家重點研發(fā)計劃項目(編號：2019YFA0110802, 2019YFA0802802)，上海市科技創(chuàng)新行動計劃實驗項目(編號：20140900200)和華東師范大學閔行實驗動物中心平臺(011)項目資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos.32025023, 81873685, 31971366), the National Key Research and Development Program of China (Nos.2019YFA0110802, 2019YFA0802802), the Shanghai Municipal Commission for Science and Technology (No.20140900200) and the Animal Center of East China Normal University (011)]

劉梅珍，碩士，工程師，研究方向：動物模型構建。E-mail: mzliu@bio.ecnu.edu.cn

王立人，博士，副研究員，研究方向：基因編輯。E-mail: lrwang@bio.ecnu.edu.cn

劉梅珍和王立人并列第一作者。

李大力，博士，教授，研究方向：基因編輯開發(fā)及基因治療。E-mail: dlli@bio.ecnu.edu.cn

10.16288/j.yczz.22-354

(責任編委: 谷峰)