白藜蘆醇對(duì)酒精依賴大鼠肝臟的影響

劉洪鳳，鄭天翼，王瑞媛，劉 勇 ，楊 勇，關(guān)利新*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，哈爾濱 150040；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011）

酒精依賴可以導(dǎo)致多種器官損傷，尤以肝臟損傷為主，具有較高的發(fā)病率和病死率。白藜蘆醇（resveratrol，Res）屬于二苯乙烯多酚化合物，是一種天然的非黃酮類多酚化合物，可從自然界多種常見植物及中藥材藜蘆、虎杖中提取[1]。白藜蘆醇具有多種藥理活性，可以預(yù)防多種慢性疾病[2]。白藜蘆醇具有優(yōu)秀的抗氧化、降糖、抗炎等作用[3-4]，已成為目前中藥單體研究的熱點(diǎn)。本研究旨在探討白藜蘆醇對(duì)酒精依賴大鼠肝損傷的保護(hù)作用，以期為臨床有效治療酒精依賴患者肝損傷尋找有效的中藥單體成分并提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品 白藜蘆醇（solarbio），批號(hào)R8350。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)6 周齡雄性SD 大鼠54 只，體質(zhì)量170～220 g。許可證號(hào)：SYXK（黑）2019-003，于SPF 級(jí)鼠類實(shí)驗(yàn)室牡丹江醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行動(dòng)物模型構(gòu)建。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)牡丹江醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理要求。

1.3 模型制備 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組10 只和20%酒精依賴模型組44 只，進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，單籠飼養(yǎng)，開始實(shí)驗(yàn)。正常組為雙瓶100 mL 蒸餾水，模型組為1 瓶100 mL 蒸餾水和1瓶100 mL 20%酒精。正常組放置雙瓶蒸餾水，模型組大鼠第1 天放置水瓶和酒精瓶，24 h 后記錄大鼠的飲酒量、飲水量，同時(shí)將酒精瓶替換為水瓶，形成一個(gè)循環(huán)，每次更換水瓶和酒精瓶的左右位置、更新水和酒精，每周檢測(cè)體質(zhì)量變化，連續(xù)造模4 周，共28 d。飲酒組大鼠的酒精攝入量[＞3.15 g/（kg·24 h）]和酒精偏好（飲酒量占總液體攝入量的百分比）逐漸穩(wěn)定時(shí)，即成功制備SD 大鼠酒精依賴模型[5]。建模過(guò)程中由于大鼠飲酒量不足和體質(zhì)量原因剔除4只大鼠，然后將建模成功的酒精依賴模型大鼠每組10 只，隨機(jī)分為4 組，酒精依賴模型組、白藜蘆醇高、中、低劑量治療組。白藜蘆醇高、中、低劑量治療組灌胃[100、50、25 mg/（kg·d）]白藜蘆醇，正常組、酒精依賴模型組給予等體積的生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃14 d。用藥結(jié)束后，取血，分離血清備用，取肝臟組織備用。

1.4 樣本采集與指標(biāo)檢測(cè) 白藜蘆醇治療結(jié)束后，禁食不禁水 12 h，采集血液后3 000 r/min 離心 15 min，分離血清備用。測(cè)定血清中 TC、TG、LDL、HDL、ALT、AST、γ-GT 含量。

1.5 光鏡觀察肝細(xì)胞形態(tài)變化 將大鼠麻醉后灌注固定，快速切取肝組織，應(yīng)用4%甲醛固定備用，HE 染色觀察肝臟病理形態(tài)變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用EXCEL 表錄入，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，方差分析進(jìn)行組間比較，LSD進(jìn)行多重比較。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)酒精依賴大鼠血清 TC、TG、LDL、HDL 水平影響 見表 1。

表1 各組大鼠血清 LDL、HDL、TC、TG 水平比較（，n =10） mmol/L

表1 各組大鼠血清 LDL、HDL、TC、TG 水平比較（，n =10） mmol/L

注：與正常組比較，### P ＜0.001；與模型組比較，△△△ P ＜0.001

2.2 白藜蘆醇對(duì)酒精依賴大鼠血清中 ALT、AST、γ-GT影響 見表 2 。

表2 各組大鼠血清 ALT、AST、γ-GT 水平比較（，n =10） U/L

表2 各組大鼠血清 ALT、AST、γ-GT 水平比較（，n =10） U/L

注：與正常組比較，### P ＜0.001；與模型組比較，△△△ P ＜0.001

2.3 白藜蘆醇對(duì)酒精依賴大鼠的肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響 正常組大鼠在光鏡下可見多個(gè)肝小葉且肝小葉的結(jié)構(gòu)清晰，肝索及肝竇排列整齊，呈放射狀，匯管區(qū)結(jié)構(gòu)清楚，肝細(xì)胞形態(tài)規(guī)則完整，胞漿豐富，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰，未見擴(kuò)張、脂變及細(xì)胞壞死等病變。酒精依賴模型組大鼠可見肝小葉肝索紊亂，肝竇受壓。匯管區(qū)可見輕微炎細(xì)胞浸潤(rùn)。肝細(xì)胞可見明顯胞漿疏松變性改變，肝組織可見有明顯的空泡樣變性，有部分肝細(xì)胞核由于受到脂滴擠壓而引起細(xì)胞核移位，細(xì)胞體腫大呈球形，胞漿嗜酸性增強(qiáng)。白藜蘆醇治療組可見肝組織的損傷均有不同程度改善，可見肝組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，肝細(xì)胞層次較規(guī)則排列，肝小葉結(jié)構(gòu)較清晰，肝細(xì)胞水腫基本改善，仍可見散在浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞及脂滴。白藜蘆醇高劑量組可見肝細(xì)胞組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)改善明顯，肝細(xì)胞接近正常，肝細(xì)胞水腫現(xiàn)象顯著減輕，小葉間結(jié)構(gòu)明顯恢復(fù)，仍可見小葉間少量脂滴。白藜蘆醇中劑量組可見肝細(xì)胞組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)，肝細(xì)胞排列層次較規(guī)則，有少量脂滴。白藜蘆醇低劑量治療組有改善但不明顯。見圖1。

圖1 白藜蘆醇對(duì)酒精依賴大鼠肝臟損傷后肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響（HE 染色，×200）

3 結(jié)語(yǔ)

酒精誘導(dǎo)的肝組織損傷發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，肝細(xì)胞可見輕微脂肪病理改變。長(zhǎng)期飲酒會(huì)使乙醛的生成量增加，改變了線粒體內(nèi)NADH/NAD 平衡，引起脂肪代謝異常。酒精在體內(nèi)可加速脂肪動(dòng)員，產(chǎn)生大量脂肪酸，促進(jìn)肝臟 TG 的合成[6]，酒精代謝過(guò)程中產(chǎn)生大量產(chǎn)物堆積，加重了肝毒性[7]，引起肝細(xì)胞脂肪堆積，導(dǎo)致脂肪肝。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組肝細(xì)胞表現(xiàn)出脂肪變性的病理改變，白藜蘆醇可降低乙醇對(duì)肝細(xì)胞的病理?yè)p傷程度，酒精依賴模型組大鼠脂質(zhì)代謝發(fā)生紊亂程度明顯加重，白藜蘆醇治療組大鼠血脂有不同程度改善，白藜蘆醇高劑量治療組療效最好，白藜蘆醇中劑量治療組療效沒有高劑量組顯著。白藜蘆醇對(duì)酒精依賴大鼠脂質(zhì)代謝紊亂具有一定調(diào)節(jié)作用。酒精依賴模型組大鼠血清中 ALT 和 AST 較正常組顯著升高，說(shuō)明酒精對(duì)大鼠肝臟有顯著損害。白藜蘆醇對(duì)酒精依賴大鼠肝功相關(guān)指標(biāo)具有改善作用。

本研究證實(shí)，白藜蘆醇對(duì)肝損傷具有保護(hù)作用，為白藜蘆醇的臨床應(yīng)用提供了初步依據(jù)，具體分子生物學(xué)機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。