燕山礦區(qū)苜?；謴?fù)過程中土壤養(yǎng)分與微生物的演變特征

馬建軍，姚虹，劉輝，田美榮,3*

1.廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院

2.廊坊澤通林業(yè)工程設(shè)計有限公司

3.環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險評估國家重點(diǎn)實驗室, 中國環(huán)境科學(xué)研究院

礦區(qū)是在人為因素嚴(yán)重干擾下形成的一種極度退化的生態(tài)系統(tǒng)，礦產(chǎn)資源開采時會因原有的表土及植被剝離而導(dǎo)致水土流失加劇、生態(tài)系統(tǒng)功能降低。植被恢復(fù)是控制水土流失和恢復(fù)生態(tài)系統(tǒng)功能的唯一策略，是礦區(qū)土壤生態(tài)系統(tǒng)重新發(fā)育和演替的基礎(chǔ)。自然恢復(fù)通常需要較長時間，生態(tài)威脅將可能長期存在。因此，在礦區(qū)建立一個高效、可持續(xù)的人工植被恢復(fù)系統(tǒng)已逐漸引起人們的重視和廣泛關(guān)注[1-2]。

植被恢復(fù)對土壤生態(tài)系統(tǒng)具有深遠(yuǎn)影響，而土壤對植被恢復(fù)的響應(yīng)存在滯后效應(yīng)[3]。因此，有必要評估植被恢復(fù)對土壤養(yǎng)分及微生物的長期影響[4]。苜蓿（Medicago sativa）是京津冀地區(qū)分布廣泛的人工植被類型，其抗堿能力強(qiáng)、生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)，具有增加生態(tài)系統(tǒng)氮輸入的潛力，同時可促進(jìn)植被和土壤中碳、氮的積累[5-6]。苜蓿的土壤改良效果尤其明顯，在加速植被恢復(fù)[7]、防止水土流失[8]、修復(fù)退化土壤等方面效果顯著[9]。然而，種植年限直接影響著苜蓿的生長情況，在北方干旱、半干旱地區(qū)，苜蓿生長盛期持續(xù)時間一般為5～6年，6～7年產(chǎn)量迅速下降，10年后逐漸退化演變?yōu)樽匀恢参锶郝鋄10]，苜蓿的這種階段性生長對土壤水分、理化性質(zhì)、養(yǎng)分變化和土壤酶等方面造成影響。

目前，苜蓿對土壤的影響研究多集中在土壤理化性質(zhì)[11-12]、修復(fù)重金屬污染[13]、土壤微生物[14-15]等方面，而對于在極端惡劣礦區(qū)環(huán)境中，苜蓿地土壤養(yǎng)分與微生物演變規(guī)律及其土壤改良的時效性和持續(xù)性仍缺乏足夠的研究[16]，但這方面的研究對于持續(xù)恢復(fù)礦區(qū)脆弱的生態(tài)系統(tǒng)有著積極的指導(dǎo)作用。

燕山山脈是中國北部著名山脈之一，是首都北京的綠色屏障和水源地，是環(huán)首都生態(tài)建設(shè)的重點(diǎn)地區(qū)，也是我國重要的礦產(chǎn)基地。河北省三河市東部礦區(qū)是廊坊市唯一的山區(qū)，系燕山余脈南麓，盛產(chǎn)白云巖。自20世紀(jì)70年代至2015年作為京、津建筑原料的供應(yīng)基地，長期石材的開采破壞了山體的外貌和植被，導(dǎo)致土地資源和環(huán)境資源喪失，使土地失去原有的利用價值。本礦區(qū)在開采的同時進(jìn)行了植被恢復(fù)工程，其中以種植豆科牧草苜蓿為主，在礦區(qū)形成了不同種植年限的苜蓿地恢復(fù)序列。

筆者以該礦區(qū)采石場平臺不同種植年限的苜蓿地為研究對象，通過分析苜蓿地土壤養(yǎng)分和土壤微生物的動態(tài)變化，探索苜蓿地恢復(fù)過程中土壤養(yǎng)分和微生物的演變規(guī)律，旨在闡明以引種苜蓿作為土壤改良的措施在燕山礦區(qū)生態(tài)恢復(fù)中是否是高效和可持續(xù)的，即與未恢復(fù)對照樣地相比，苜蓿對土壤的改良效果是否是高效的；與原生境對照樣地相比，苜蓿對土壤的改良效果是否是可持續(xù)的，是否有明顯的時效性。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)為三河市東部白云石露天礦區(qū)（117°05′13″E～117°11′10″E，40°00′23″N～40°02′34″N）（圖1），行政區(qū)劃屬三河市黃土莊鎮(zhèn)和段甲嶺鎮(zhèn)。三河市東部礦區(qū)地處燕山山脈東段南緣與華北平原接壤部位的低山丘陵區(qū)。三河市屬典型暖溫帶大陸性氣候，年均氣溫11.1 ℃，年均降水量617.4 mm，年蒸發(fā)量1 681.9 mm。礦區(qū)土壤類型以石灰性鹽堿褐土為主，土質(zhì)疏松，抗蝕抗沖性差，水土流失嚴(yán)重，有機(jī)質(zhì)濃度低。礦區(qū)采石場原生表土已經(jīng)全無，現(xiàn)多為缺乏養(yǎng)分與水分的新生石礫土和沙質(zhì)土。

圖1 研究區(qū)及樣地設(shè)置Fig.1 Schematic diagram of study area and sample plots

1.2 樣地設(shè)置與采樣

2020年8 月，在坡位、坡向、海拔等立地條件基本一致的采石場平臺上選擇恢復(fù)年限分別為3年（Me3）、6 年（Me6）、10 年（Me10）和 15 年（Me15）的4個苜蓿恢復(fù)樣地，苜蓿地種植后僅在前2年進(jìn)行澆灌和2次刈割，以后未進(jìn)行人工干預(yù)，處于自然演替狀態(tài)。在礦區(qū)內(nèi)選擇已經(jīng)開采但未進(jìn)行恢復(fù)的區(qū)域（CK1）和有代表性且未經(jīng)開采的自然區(qū)域（CK2）設(shè)置2個對照樣地（圖1）。樣地基本情況見表1。

表1 樣地基本情況Table 1 Basic properties of the sample plots

4個苜蓿恢復(fù)樣地和對照樣地CK1的表層覆蓋客土，來源于研究區(qū)附近建筑工程地基開挖過程中所產(chǎn)生的開槽土和工程棄土?；謴?fù)期間所有樣地均未施肥。

在每個樣地中，設(shè)置3個10 m×10 m取樣小區(qū)，小區(qū)之間及其與樣地邊界之間的距離均大于10 m。在每個采樣小區(qū)中，按照S型多點(diǎn)采樣法，沿S形路線均勻設(shè)置12個取樣點(diǎn)（取樣點(diǎn)距離植株基部3～5 cm左右），去除土壤表面凋落物層后，用土鉆采集0～20 cm土壤樣品，并進(jìn)行混合，用無菌塑封袋密封后，用冰盒冷藏并迅速帶回實驗室。采集的土壤樣品分為2份：一份過2 mm篩后室內(nèi)自然風(fēng)干，用于測定土壤養(yǎng)分；一份于-20 ℃冷凍保存，用于土壤微生物群落的測定。

1.3 土壤養(yǎng)分的測定

速效氮（AN）濃度采用堿解擴(kuò)散法測定；速效磷（AP）濃度采用鹽酸和硫酸溶液浸提法測定；速效鉀（AK）濃度用乙酸銨浸提-火焰光度法測定[17]；土壤有機(jī)質(zhì)（OM）濃度采用重鉻酸鉀容量法-外加熱法測定。每個樣品做7個重復(fù)。

1.4 土壤微生物群落分析

采用CTAB法對不同樣品的總DNA進(jìn)行提取，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳測定抽提的基因組DNA。擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3+V4_b高變區(qū)段，引物為 338F（5'-ACTCCTACGGGAGCAGCA-3'）和 806R（5'GGAC TACHVGGGTWTCTAAT-3'）。真菌多樣性對18S rRNA的ITS1_f區(qū)段進(jìn)行測序，引物為ITS1F（5'-CTTGGTC ATTTAGAGGAAGTA A-3'）和2043R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）。擴(kuò)增條件為 98 ℃ 預(yù)變形 1 min，98 ℃ 變形 10 s，50 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 60 s，30 個循環(huán)，72 ℃ 延伸形5 min[18]。土壤樣品完成DNA提取后，送北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行Illumina高通量測序。每個樣品做7個重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)采用Excel及R-3.6.3中的Vegan分析包進(jìn)行統(tǒng)計分析。根據(jù)方差分析和Tukey檢驗分析樣品間的顯著性差異。分析土壤細(xì)菌、真菌群落的Beta多樣性時，首先對操作分類單元（operational taxonomic units, OTUs）表進(jìn)行Hellinger標(biāo)準(zhǔn)化，采用R-3.6.3的Vegan包計算Bray-Curtis差異性距離（Bray-Curtis dissimilarity,dBCD），并進(jìn)行相似性分析（analysis of similarities, ANOSIM）及置換多元方差分析（permutation-based multivariate ANOVA,PerMANOVA），分析各分組之間是否存在顯著差異，并進(jìn)一步通過主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis, PCoA）進(jìn)行可視化組間差異分析[19-20]。其中，dBCD計算公式如下：

式中：SA,i和SB,i為第i個OTU分別在A群落和B群落中的計數(shù)。dBCD為0～1時，數(shù)值越大，則2個樣本之間的相似性就越低；如果2個樣本相同，則dBCD=0。

2 結(jié)果與討論

2.1 土壤養(yǎng)分演變特征

種植苜?？梢杂行У馗纳仆寥鲤B(yǎng)分[21-22]。由圖2可見，苜蓿對于土壤AN濃度、AP濃度、AK濃度和OM濃度的改良效果有一定差異。

圖2 不同樣地土壤AN、AP、AK及OM濃度Fig.2 Concentrations of soil AN, AP, AK and OM in different sample plots

由圖2（a）可知，隨著恢復(fù)年限的增加，土壤AN濃度呈先增加后降低的變化規(guī)律。種植苜蓿的初期，樣地Me3與未恢復(fù)對照樣地CK1間土壤AN濃度無顯著差異；隨著恢復(fù)年限的增加，樣地Me6中土壤AN濃度達(dá)到峰值，其濃度顯著高于除原生境對照樣地CK2外的所有樣地。這是由于苜蓿根部形成了大量根瘤菌，其具有固氮作用；另外一部分根系和地上莖葉腐爛進(jìn)入土壤，增加了土壤養(yǎng)分濃度。隨著恢復(fù)年限的進(jìn)一步增加，在恢復(fù)的第10年和第15年，土壤AN濃度持續(xù)降低。研究發(fā)現(xiàn)，本礦區(qū)苜蓿的生長盛期為6年，之后苜蓿進(jìn)入衰退期，且隨著種植年限的繼續(xù)增加，根系活力下降，生物量減少，對氮素利用強(qiáng)度減弱，而導(dǎo)致的氮素歸還減少，苜蓿地土壤肥力并不會繼續(xù)保持增長[23-24]。

由圖2（b）可知，隨著恢復(fù)年限的增加，土壤AP濃度呈先增加后降低再增加的變化規(guī)律。盡管在樣地Me6中土壤AP濃度達(dá)到峰值，但是所有樣地間土壤AP濃度均無顯著性差異，表明種植苜蓿對土壤AP濃度的影響并不明顯。研究區(qū)各樣地土壤AP濃度整體偏低（均在10 mg/kg以下），苜蓿對土壤AP的消耗甚微，甚至可以積累AP。隨著種植苜蓿年限的延長，土壤AP濃度呈下降趨勢[25]。

由圖2（c）可知，隨著恢復(fù)年限的增加，土壤AK濃度呈現(xiàn)與土壤AN濃度相同的變化規(guī)律。苜蓿對于土壤AK濃度的影響較為明顯，樣地Me6中土壤AK濃度達(dá)到峰值，其濃度顯著高于所有樣地。苜蓿在生長過程中對鉀元素的需求量也很高，在本研究中樣地Me3和Me6土壤AK濃度顯著增加，這是由于在研究區(qū)鹽堿性土壤中鉀元素濃度較低，且主要以礦物態(tài)鉀和非交換態(tài)鉀形式存在，交換態(tài)鉀和水溶態(tài)鉀濃度較低[26]。不同形態(tài)間的鉀存在著動態(tài)的平衡，苜蓿生長過程中需要大量的AK，而各苜蓿地中AK濃度依然高于對照樣地CK1和CK2，說明長勢旺盛的苜蓿（Me3和Me6）可以大大促進(jìn)土壤AK的轉(zhuǎn)化[27]。隨著苜蓿生長的衰退（Me10和Me15），苜蓿對鉀的轉(zhuǎn)化能力逐漸減弱，同時大量本土植物在樣地中出現(xiàn)，植物在生長過程中的吸收及淋溶作用會造成土壤AK的減少，因此隨著種植年限的延長，土壤AK濃度降低[14]。由圖2（d）可知，隨著恢復(fù)年限的增加，土壤OM濃度總體呈增加趨勢，且均高于對照樣地CK1，但均顯著低于對照樣地CK2，這與樣地中枯落物的淋溶腐解、腐殖質(zhì)含量增加有關(guān)[28-29]。

有研究顯示，苜蓿在不同地區(qū)有著7年[10]、10年[30]、11年[31]等不同的生長盛期，本研究區(qū)苜蓿的生長盛期為6年，這與采石場土壤現(xiàn)狀（開槽土和工程棄土）、利用方式（保土固沙、2次刈割）和管理措施（未施肥、長期自然演替狀態(tài)）等有關(guān)。因此，應(yīng)加強(qiáng)苜蓿地的科學(xué)管理和合理利用以延長苜蓿的生長時間[32]。

2.2 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)演變特征

不同樣地優(yōu)勢細(xì)菌的相對豐度如圖3所示。本研究區(qū)細(xì)菌類群中相對豐度水平前5的優(yōu)勢門依次為變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）〔圖3（a1）～圖3（a5）〕；優(yōu)勢科依次為鞘氨醇單胞菌科（Sphingomonadaceae）、梭菌科（Pyrinomonadaceae）、伯克氏菌科（Burkholderiaceae）、根瘤菌科（Rhizobiaceae）、芽孢桿菌科（Bacillaceae）〔圖3（b1）～圖3（b5）〕。

由圖3（a1）可知，變形菌門的相對豐度呈先增加后降低的變化規(guī)律，樣地Me10中變形菌門的相對豐度顯著高于所有樣地；其他樣地間，該門的相對豐度無顯著差異；該門中的鞘氨醇單胞菌科〔圖3（b1）〕和伯克氏菌科〔圖3（b3）〕呈現(xiàn)與該門一致的變化規(guī)律，而根瘤菌科〔圖3（b4）〕則呈現(xiàn)較復(fù)雜的變化規(guī)律：峰值出現(xiàn)在樣地Me10，而Me6、Me15及CK2樣地中根瘤菌科的相對豐度均較低且無顯著差異。變形菌門細(xì)菌在不同環(huán)境中廣泛分布，適應(yīng)能力強(qiáng)[33]，是堿性土壤中的主要優(yōu)勢群落，廣泛存在于以鹽堿土壤為主的礦區(qū)土壤中[34]。與CK1相比，富營養(yǎng)型細(xì)菌類群變形菌門的相對豐度在所有苜蓿樣地中有所增加，這與黃土高原草地植被自然演替過程中的細(xì)菌群落組成的變化規(guī)律表現(xiàn)出相同的趨勢[35]。其中樣地Me3、Me6和Me10中變形菌門的相對豐度均顯著高于CK1和CK2。變形菌門在土壤中所占比例越大，在一定程度上代表了土壤越肥沃，在一些黑土地及半濕潤地區(qū)的土壤中變形菌門往往是優(yōu)勢菌群[36]。本研究也證實，在種植苜蓿初期，可以改善土壤變形菌門分布狀況。

酸桿菌門〔圖3（a2）〕的相對豐度呈先增加后降低再增加的變化規(guī)律，第6年其相對豐度顯著高于其他苜蓿樣地及對照樣地CK1，而顯著低于樣地CK2；其中，隸屬于該門的梭菌科〔圖3（b2）〕的相對豐度隨著苜蓿種植年限的增加而增加。酸桿菌門在自然環(huán)境中亦十分常見，可以降解植物纖維素等大分子聚合物[37]。本研究發(fā)現(xiàn)酸桿菌門主要存在于原生境樣地CK2中，可能與樣地中有大量的荊條、沙棗等灌木植物有關(guān)。

放線菌門〔圖3（a3）〕和厚壁菌門〔圖3（a4）〕呈現(xiàn)相同的變化規(guī)律，即二者的相對豐度先降低后增加。樣地Me3、Me6中，放線菌門的相對豐度高于樣地CK1（但無顯著差異），表明種植初期苜蓿雖能夠改善放線菌狀況，但效果不明顯。樣地CK1中厚壁菌門的相對豐度最高，而該門的相對豐度在樣地Me6、Me10及CK2間無顯著性差異；隸屬于厚壁菌門的芽孢桿菌科〔圖3（b5）〕的相對豐度的變化規(guī)律與厚壁菌門的變化規(guī)律一致。在干旱和寡營養(yǎng)的土壤中放線菌門和厚壁菌門的相對豐度較高[38]。厚壁菌門細(xì)菌細(xì)胞壁厚，結(jié)構(gòu)簡單，可以產(chǎn)生芽孢，它可以抵抗脫水和極端環(huán)境，因而能較好地適應(yīng)礦區(qū)惡劣環(huán)境[39]。樣地CK1幾乎無植被覆蓋，土壤水分含量低，故其厚壁菌門的相對豐度最高，在樣地Me3和Me6中，植被覆蓋顯著增加，土壤水分含量有所增加，故厚壁菌門的相對豐度呈下降趨勢。樣地Me10（苜蓿呈現(xiàn)衰退跡象）和Me15（苜?；鞠В┑耐寥篮繙p少，此時相對豐度出現(xiàn)增加的趨勢，原生境樣地CK2中厚壁菌門的相對豐度較低，這些差異說明厚壁菌門的相對豐度與植被恢復(fù)的不同階段土壤含水量有關(guān)[40]。

圖3 不同樣地優(yōu)勢細(xì)菌的相對豐度Fig.3 Relative abundance of dominant bacteria in different sample plots

擬桿菌門〔圖3（a5）〕的相對豐度則隨著恢復(fù)時間的增加而增加，樣地CK1、Me15的擬桿菌門的相對豐度顯著最高，而其他樣地間，該門的相對豐度則無顯著差異。擬桿菌門在水體、土壤及沉積物中也是廣泛分布的一個類群，在研究區(qū)該門也有較高的平均相對豐度。樣地Me3、Me6、Me10和Me15中擬桿菌門的相對豐度逐漸增加，但是均低于樣地CK1，這與變形菌門、酸桿菌門、放線菌門等優(yōu)勢菌群在上述樣地中競爭性增強(qiáng)有關(guān)[41-42]。

2.3 土壤真菌群落結(jié)構(gòu)演變特征

不同樣地優(yōu)勢真菌相對豐度如圖4所示。本研究區(qū)真菌類群中相對豐度水平前5的優(yōu)勢門依次為子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、毛 霉 門 （Mucoromycota） 、 隱 真 菌 門（Rozellomycota） 、 被 孢 霉 門 （Mortierellomycota）〔圖4（a1）～圖4（a5）〕；優(yōu)勢科及其平均相對豐度依次為曲霉科（Aspergillaceae）、毛殼菌科（Chaetomiaceae）、被孢霉科（Mortierellaceae）、粉褶菌科（Entolomataceae）、枝孢霉科（Cladosporiaceae）〔圖4（b1）～圖4（b5）〕。

在真菌群落中，子囊菌門和擔(dān)子菌門是自然界中分布最廣、豐度最高的2個真菌類群，這與其代謝特性及在多種生境中較強(qiáng)的生存能力有關(guān)[43]。本研究區(qū)子囊菌門〔圖4（a1）〕和擔(dān)子菌門〔圖4（a2）〕的相對豐度均較高，這與Yang等[44-45]在黃土高原半干旱區(qū)退耕草地中研究的結(jié)果相似。子囊菌門和擔(dān)子菌門大多數(shù)為腐生菌，本研究中各樣地土壤pH為7.5～8.5，堿性土壤最適合腐生真菌的生長，這可能是子囊菌門和擔(dān)子菌門為優(yōu)勢菌門的一個原因[46]。

由圖4（a1）可知，隨著恢復(fù)年限的增加，子囊菌門的相對豐度呈先降低后增加趨勢。子囊菌門是土壤腐生真菌，易受到植物種類和植物殘茬的強(qiáng)烈影響，其功能是分解木質(zhì)化植被碎屑[47]。本研究中各苜蓿樣地中植被覆蓋度及植被殘茬均顯著增加，使子囊菌門真菌能夠更好地利用可降解的植被殘茬，促進(jìn)菌群的快速增長與繁殖[48]，故各苜蓿地子囊菌門的相對豐度均顯著高于CK1。本研究中，隸屬于子囊菌門的優(yōu)勢科為曲霉科、毛殼菌科和枝孢霉科。曲霉科〔圖4（b1）〕的相對豐度隨著恢復(fù)年限增加而增加，而毛殼菌科〔圖4（b2）〕與枝孢霉科〔圖4（b5）〕呈現(xiàn)完全相反的變化規(guī)律，即隨著恢復(fù)年限增加，毛殼菌科的相對豐度是先降后增，而枝孢霉科的相對豐度是先增后降。

圖4 不同樣地優(yōu)勢真菌相對豐度Fig.4 Relative abundance of dominant fungi in different sample plots

擔(dān)子菌門〔圖4（a2）〕呈現(xiàn)與子囊菌門相反的變化規(guī)律，這與子囊菌門真菌優(yōu)勢度增加有關(guān)[49-50]。自然界中超過98%的陸生真菌屬于子囊菌門和擔(dān)子菌門，而且前者的物種多樣性明顯多于后者，子囊菌門的物種數(shù)量是擔(dān)子菌門的2倍多[51]。本研究中，隸屬于擔(dān)子菌門的粉褶菌科〔圖4（b4）〕的相對豐度隨著恢復(fù)年限增加而增加。

毛霉門〔圖4（a3）〕和隱真菌門〔圖4（a4）〕的變化規(guī)律較為一致，即二者的相對豐度隨恢復(fù)年限的增加而呈現(xiàn)降低的趨勢。毛霉門真菌能夠吸收糖和簡單的多糖以及N、P、K等營養(yǎng)物質(zhì)，其孢子萌發(fā)快，菌絲生長速度快。因此，在植被恢復(fù)的初期最先形成優(yōu)勢菌，然而毛霉門真菌對自身代謝副產(chǎn)物的積累較為敏感，尤其是環(huán)境中CO2的積累，使其停止生長，產(chǎn)生休眠結(jié)構(gòu)，進(jìn)入休眠狀態(tài)。毛霉門真菌的相對豐度在苜蓿種植初期（3～6年）之后逐漸較低，這一演替階段隨著毛霉門真菌自身可利用的營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和土壤中CO2的積累而消失，樣地Me15中毛霉門真菌幾乎消失。隱真菌門是在水體及極端環(huán)境中廣泛分布的真菌，在土壤中相對較少[52-53]。本研究顯示，各樣地的隱真菌門無論從相對豐度（均較低），還是從變化規(guī)律（逐年遞減）呈現(xiàn)出非常一致的變化規(guī)律。

隨著苜蓿種植年限的增加，被孢霉門〔圖4（a5）〕的相對豐度在樣地Me6中達(dá)到峰值（與Me10間無差異）；在樣地Me3、Me15和CK2中，其相對豐度均極低；在樣地CK1、Me6、Me10中，其相對豐度均顯著高于樣地CK2。被孢霉門是土壤養(yǎng)分豐富的標(biāo)志類群，與土壤養(yǎng)分有密切聯(lián)系[54]。本研究顯示，盡管各樣地中被孢霉門的相對豐度較低，但是呈現(xiàn)了一定的規(guī)律性，即隨苜蓿種植年限的增加呈先升后降趨勢，最高值出現(xiàn)在第6年，這與土壤AN和AK變化規(guī)律相一致。本研究中，隨著恢復(fù)年限的增加，隸屬于被孢霉門的被孢霉科〔圖4（b3）〕的相對豐度呈現(xiàn)與該門較為一致的變化規(guī)律。

2.4 細(xì)菌/真菌群落Beta多樣性演變特征

為了進(jìn)一步闡明不同恢復(fù)年限苜蓿地間微生物群落組成上的差異性，本研究基于Bray-Cutis距離矩陣采用PCoA分析了6個樣地土壤細(xì)菌及真菌群落物種組成的相似度，結(jié)果見圖5、表2。

表2 基于Bray-Curtis距離算法的樣地間土壤細(xì)菌/真菌的距離（dBCD）矩陣Table 2 Distance matrix of soil bacteria / fungi between sample plots based on Bray-Curtis distance（dBCD） algorithm

由圖5可見，土壤細(xì)菌和真菌的7個重復(fù)樣本聚在一起，這說明樣本的重復(fù)性較好，組內(nèi)變異相對較小。在細(xì)菌PCoA分析中PCoA第1軸和PCoA第2軸分別解釋了變異信息的32.59%、16.36%，二者累計貢獻(xiàn)率達(dá)48.95%。結(jié)果表明，在第1軸方向上，樣地Me3與樣地CK1的細(xì)菌群落組成較為相似，樣地Me6和Me10相似，樣地Me15與樣地CK2相似性較低。在真菌PCoA分析中PCoA第1軸和PCoA第2軸分別解釋變量方差的24.97%、14.69%，二者累計貢獻(xiàn)率達(dá)39.66%。結(jié)果表明在第1軸方向上，隨著苜蓿種植年限的增加，土壤真菌群落組成發(fā)生明顯的階段性變化，樣地Me3和Me6與樣地CK1相似，而樣地Me15與CK2相似。

圖5 土壤微生物PCoA分析圖Fig.5 PCoA analysis of soil microorganisms

土壤細(xì)菌和真菌隨著恢復(fù)時間的增加呈現(xiàn)逐漸本土化的演變趨勢，但二者的演變進(jìn)度存在差異。由Bray-Curtis距離矩陣（表2）可知，與未恢復(fù)樣地CK1相比，在種植苜蓿的第10年，樣地Me10與樣地CK1的細(xì)菌群落的Bray-Curtis距離就達(dá)到了0.524 4，而此時兩樣地的真菌群落的Bray-Curtis距離為0.245 2；在種植苜蓿的第15年，樣地Me15與樣地CK1的真菌群落的Bray-Curtis距離為0.572 2。各樣地與樣地CK2的真菌群落的Bray-Curtis距離也明顯大于與細(xì)菌群落的Bray-Curtis距離。顯然，苜蓿地土壤細(xì)菌群落演變較快，而真菌群落的演變相對緩慢。

Dangi等[55]研究了美國懷俄明州東北部露天煤礦復(fù)墾地經(jīng)過14年的土地復(fù)墾，土壤真菌群落結(jié)構(gòu)基本達(dá)到正常水平。本研究與Dangi等[55]研究結(jié)果存在差異的原因在于苜蓿對土壤細(xì)菌群落的碳源供應(yīng)更充足，恢復(fù)能力很強(qiáng)[56]，所以本研究中細(xì)菌的恢復(fù)進(jìn)程更快，而真菌在競爭中處于劣勢，恢復(fù)較為緩慢[57]。另有研究顯示，隨著生態(tài)系統(tǒng)的成熟，土壤微生物生物量的主導(dǎo)地位將由細(xì)菌向真菌轉(zhuǎn)變[58]。

3 結(jié)論

（1）與未恢復(fù)對照樣地相比，苜?？梢愿咝У靥岣咄寥繟N、OM、AK等養(yǎng)分的濃度以及變形菌門、酸桿菌門、子囊菌門、擔(dān)子菌門、鞘氨醇單胞菌科、伯克氏菌科、根瘤菌科、芽孢桿菌科、毛殼菌科、粉褶菌科等優(yōu)勢微生物類群的相對豐度。

（2）與原生境對照樣地相比，苜蓿的土壤改良效果有明顯的時效性。苜蓿對土壤養(yǎng)分的恢復(fù)以第6年為最佳，之后隨著恢復(fù)年限的延長，土壤AN濃度及AK濃度呈下降趨勢；在第6年或第10年，土壤優(yōu)勢微生物類群的相對豐度顯著升高；苜蓿對細(xì)菌的恢復(fù)進(jìn)度較快，而對真菌的恢復(fù)較慢。苜蓿地恢復(fù)中應(yīng)充分考慮氣象、土壤等環(huán)境因素，根據(jù)不同區(qū)域特點(diǎn)對苜蓿地進(jìn)行科學(xué)的管理與利用，以延長其土壤改良的時間。