高效液相色譜法測定與比較5種不同提取方法提取的茶葉咖啡因

吳以龍，王康，武增才，稅再坤，字成庭2，*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)普洱茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，云南 昆明 650201）

近年來，越來越多的研究證明咖啡因具有興奮心臟、骨骼肌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗氧化、舒張血管、松弛平滑肌等生理作用[1-4]，廣泛存在于瓜拿納、馬黛茶、咖啡樹、茶樹、可樂樹、代茶冬青樹和可可樹的葉片和果實(shí)中[5-6]。茶葉是咖啡因的主要來源之一，茶葉中咖啡因的含量占干物質(zhì)的2%～5%，咖啡因是茶葉中重要的功能成分[7-8]。

咖啡因作為一種傳統(tǒng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑，是世界上應(yīng)用較為廣泛的精神類藥物，日常生活中的茶葉、咖啡、可可飲料、巧克力以及一些軟飲料等食品中均含有咖啡因[9-10]，其獲取方法主要是從天然作物中進(jìn)行提取或人工合成[11-14]。從茶葉中提取咖啡因的常用方法有醇提法、水提法、超臨界二氧化碳流體提取法、微波輻射法、恒壓滴液漏斗代替索氏提取器提取法等[15]，但這些提取方法的提取率和純度普遍偏低。目前測定咖啡因提取物純度的方法較多，有薄層色譜法[16-18]、紫外分光光度法[17]和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[19]等。薄層色譜法是一種微量分離方法，其分離速度較快，但存在無法定量和重現(xiàn)性不好等問題。紫外分光光度法利用了咖啡因結(jié)構(gòu)中嘌呤環(huán)具有共軛雙鍵體系并能產(chǎn)生獨(dú)特吸收光譜的特點(diǎn)，但紫外分光光度法容易受到提取物中其他嘌呤堿的干擾，較純咖啡因的測定才可用紫外分光光度法[20]。本研究討論茶葉中咖啡因的5種提取方法[無水乙醇回流提取濃縮-升華法、丙酮水溶液提取-氯仿萃取法、無水乙醇回流提取濃縮-二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解-凍干法、超聲提取-二氯甲烷萃取法、鹽酸水溶液浸提-二氯甲烷萃取法]，再利用高效液相色譜法測定提取物中咖啡因的含量，根據(jù)測定結(jié)果比較和分析不同提取方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為茶葉產(chǎn)品開發(fā)和深加工過程中咖啡因的分析檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

散裝茶葉（云南省鳳慶縣大葉種茶）：市售；咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）：中國食品藥品檢定研究院；無水乙醇、丙酮、氯仿、硫酸鈉、二氯甲烷、鹽酸、氫氧化鈉、正己烷、活性炭粉（均為分析純）：天津大茂化學(xué)試劑廠；氧化鈣、DMSO、三氟乙酸（均為分析純）、甲醇（色譜純）：美國Sigma公司；純凈水：杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-WO-3L恒溫水油浴鍋：河南鄭州鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；N-1300V-W型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：日本Eyela/東京理化器械公司；FD-1A-50T型冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SK5200HP型超聲清洗器：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；ME204T型電子天平：上海梅特勒－托利多儀器有限公司；Agilent 1260型高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測器）：安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 無水乙醇回流提取濃縮-升華法

稱取5 g散裝茶葉研細(xì)均勻，用濾紙包好放入索氏提取器中，然后向250 mL圓底燒瓶中加入70 mL無水乙醇和幾粒沸石，95℃油浴加熱、回流提取3 h，保持回流速度均衡。然后改裝成蒸餾裝置，蒸餾濃縮提取液至適量（1/10體積），將殘液趁熱倒入蒸發(fā)皿中，加入4 g氧化鈣，在水浴鍋上80℃蒸干，并不斷攪拌、壓碎塊狀物。然后用小火焙炒片刻至除去水分。冷卻后，擦去蒸發(fā)皿上的粉末，用封閉電爐178℃加熱升華，收集得到的咖啡因并稱重（提取方法1）。

1.3.2 丙酮水溶液提取-氯仿萃取法

稱取5 g散裝茶葉研細(xì)均勻，加入30%丙酮水溶液70 mL提取2次，每次30 min，合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40℃減壓濃縮至適量（2/3體積），在經(jīng)正己烷萃取2次后的水相中加入4%硫酸鈉溶液10 mL，用活性炭吸附10 min。氯仿萃取2次，合并有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40℃減壓濃縮回收氯仿，收集得到的咖啡因后干燥并稱重（提取方法2）。

1.3.3 無水乙醇回流提取濃縮-DMSO溶解凍干法

稱取5 g散裝茶葉研細(xì)均勻，放入100 mL單口圓底燒瓶中，再加入75mL無水乙醇。在85℃恒溫水浴鍋中回流提取3 h，稍微冷卻后抽濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀55℃回收乙醇并濃縮至適量（1/10體積）。濃縮液用DMSO溶解，加入轉(zhuǎn)子，放在油浴鍋中85℃進(jìn)行蒸餾，得到含有DMSO和咖啡因的混合液。將混合液置于-80℃超低溫冰箱中預(yù)凍4 h以上，凍干機(jī)預(yù)冷至-48℃，凍干過程中真空度維持在（4±3）Pa，持續(xù)凍干72 h以上。經(jīng)冷凍干燥處理后，收集咖啡因并稱重（提取方法3）。

1.3.4 超聲提取-二氯甲烷萃取法

稱取5 g散裝茶葉研細(xì)均勻，置于250 mL圓底燒瓶中，加入75 mL無水乙醇，攪拌使溶劑完全浸潤茶葉，接冷凝回流裝置，在恒溫加熱磁力攪拌器上100℃加熱煮沸10 min，然后置于超聲清洗器中，超聲浸提30 min，冷卻，經(jīng)減壓抽濾后分離殘?jiān)玫酱痔崛∥?。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀55℃回收乙醇并濃縮至適量（1/10體積），加10 mL水溶解后用活性炭吸附10 min，并加入NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至12左右。用二氯甲烷萃取2次，合并有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀37℃回收二氯甲烷，收集得到的咖啡因，干燥并稱重（提取方法4）。

1.3.5 鹽酸水溶液浸提-二氯甲烷萃取法

稱取5 g散裝茶葉研細(xì)均勻，置于250 mL圓底燒瓶中，加入100 mL 2%的鹽酸水溶液浸濕，攪拌浸提20 min，靜置分層，取上層清液，加入NaOH調(diào)節(jié)pH值至12左右，用二氯甲烷萃取2次，合并有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀37℃回收二氯甲烷，收集得到的咖啡因，干燥并稱重（提取方法5）。

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制

準(zhǔn)確稱取咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品5 mg（精確至0.01 mg），置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容并搖勻制得標(biāo)準(zhǔn)品儲備液（1 mg/mL）。精密吸取對照品咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品儲備液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 置于 10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到濃度為10、20、40、60、80、100、120 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)液。上述系列濃度標(biāo)準(zhǔn)液經(jīng)0.45 μm微孔過濾膜過濾后，HPLC進(jìn)樣分析，以標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.7 供試品的制備

精密稱取5種不同提取方法得到的咖啡因各5mg，置于5 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容并搖勻，放置30 min制得1 mg/mL樣品液，將方法1～5提取的咖啡因樣品液編號為A～E。分別精密吸取A～E樣品液（1 mg/mL）1 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至10 mL，得到0.1 mg/mL的各咖啡因供試品。

1.3.8 色譜條件

色譜柱：AgilentZORBAXSB-C18柱（5μm×4.6mm×250 mm）；流動(dòng)相 A：甲醇（0 min：10%→10 min：50%→20 min：70%→25 min：90%），流動(dòng)相 B：水（0 min：90%→10 min：50%→20 min：30%→25 min：10%）；流速：1 mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：5 μL；檢測波長：280 nm。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

色譜圖采用Origin Pro 8.5制作，提取率、線性試驗(yàn)、回收率和精密度試驗(yàn)數(shù)據(jù)由Office Excel軟件處理，數(shù)據(jù)為3次測定的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取咖啡因的顏色、形狀及提取率比較

5種提取方法從茶葉中提取咖啡因的結(jié)果見表1。

表1 不同方法提取的咖啡因顏色、形狀及提取率比較Table 1 The color and shape of caffeine extracted by different methods and the extraction rate were compared

由表1可知，5種提取方法得到的咖啡因顏色及形狀均較好；同等質(zhì)量的茶葉，由于提取方法不同，咖啡因的提取率不同，而且差別較大。就上述5種提取方法而言，方法2和方法3的提取率相對較高，方法1、方法4與方法5的提取率偏低，其原因是方法4與方法5提取時(shí)間較短，延長提取時(shí)間會(huì)提高咖啡因的提取率，但超聲與鹽酸溶液輔助提取會(huì)增加雜質(zhì)含量，提取時(shí)間不宜過長；方法1在升華過程中由于溫度較難控制，使部分咖啡因在升華過程中碳化損失，部分咖啡因晶體掉落在氧化鈣粉末表面以及結(jié)晶在蒸發(fā)皿器壁上較難收取。

2.2 HPLC測定咖啡因純度比較

2.2.1 線性試驗(yàn)、定量限和檢出限

對1.3.6配制的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行HPLC檢測，線性試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，以咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（C，μg/mL），信號響度峰面積為縱坐標(biāo)（A），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，該方法線性回歸方程為A=12.59C+172.84，相關(guān)系數(shù)r為0.999 9，測定咖啡因的含量在濃度10 μg/mL～120 μg/mL呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。以3倍信噪比（S/N）計(jì)算檢出限，10倍信噪比（S/N）計(jì)算定量限。方法的檢出限為2.51 μg/g，定量限為7.87 μg/g。

表2 線性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of linear experiment

2.2.2 檢測結(jié)果與純度比較

各咖啡因樣品供試品進(jìn)行HPLC檢測，檢測結(jié)果與咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品圖譜對照結(jié)果見圖1。

由圖1可知，A～E的高效液相色譜中的保留時(shí)間與咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間幾乎一致，且雜質(zhì)出峰數(shù)較少。保留時(shí)間、峰面積和純度比較見表3。

表3 高效液相色譜保留時(shí)間與峰面積比較Table 3 The retention time and peak area of HPLC were compared

由表3可知，樣品A～E咖啡因純度均＞90%。由于采用外標(biāo)法測定樣品純度，存在方法誤差與系統(tǒng)誤差，其中樣品E的純度最高達(dá)103.29%，在一定的誤差范圍內(nèi)，樣品E接近咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品純度；樣品A純度最低，為90.54%，分析其原因?yàn)榉椒?無水乙醇回流提取濃縮-升華法在咖啡因升華結(jié)束后的收取過程中容易摻雜其他雜質(zhì)，從而略微影響咖啡因的純度。經(jīng)過HPLC檢測確認(rèn)了5種不同提取方法的提取效果良好，均能從茶葉中獲得純度良好的咖啡因，HPLC方法準(zhǔn)確性較高，能準(zhǔn)確分析不同提取方法提取的茶葉咖啡因之間的純度差異。

2.2.3 精密度試驗(yàn)

分別取 1.3.6 配制的 40、80、120 μg/mL 咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液按照1.3.8的色譜條件測定峰面積，分別重復(fù)測定6次，峰面積的RSD分別為0.31%、0.54%、0.61%，均小于1%，表明HPLC儀器精密度良好。

2.2.4 回收率試驗(yàn)

精密吸取已知含量的A～E樣品液（1 mg/mL）各1 mL并置于10 mL容量瓶中，每個(gè)樣品各3份，分別加入 10 μg/mL 咖啡因標(biāo)準(zhǔn)液 0.5、1、2 mL（即加入 5、10、20 μg咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品）并用甲醇定容至10 mL。每個(gè)加標(biāo)量設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)，HPLC測定并記錄峰面積，計(jì)算平均回收率，結(jié)果見表4。

表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of recovery experiment

從表4可知，5種咖啡因樣品的平均回收率為92.47%～109.07%，RSD為0.11%～2.77%，表明方法的準(zhǔn)確度和精密度較高，適用于咖啡因提取物的檢測分析。

3 討論與結(jié)論

提取方法1為從茶葉中提取咖啡因的傳統(tǒng)方法，耗費(fèi)時(shí)間過長，無水乙醇易揮發(fā)且索氏提取器易破碎，成本較高。本文用此方法所得咖啡因的純度和提取率都不高，原因在于此方法的關(guān)鍵是升華溫度的控制，這直接影響到了咖啡因的提取率和咖啡因純度。提取方法2采用丙酮水溶液作為咖啡因提取劑，丙酮水溶液提取增大了咖啡因的溶出率，氯仿萃取能除去大部分極性低的化合物，咖啡因純度較高。提取方法3采用在水浴鍋中直接冷凝回流提取咖啡因，比起提取方法1的索氏提取器方法，操作要簡單方便，但用此方法提取的咖啡因純度不太高，僅為95.3%。提取方法4采用超聲輔助的方法從茶葉中提取咖啡因，簡化了提取操作且咖啡因純度較好，但是超聲輔助提取咖啡因一方面縮短提取時(shí)間，而另一方面又限制提取時(shí)間不能過長，原因是超聲時(shí)間過長會(huì)增大茶葉中雜質(zhì)的溶出率，咖啡因與雜質(zhì)較難分離，影響咖啡因純度。提取方法5在5種試驗(yàn)方法中操作較為簡便、耗時(shí)短，但是與方法4相似，酸溶液輔助提取過程中需要嚴(yán)格控制提取時(shí)間，不然會(huì)影響咖啡因的提取率和純度，因此，通常需要探索酸溶液提取時(shí)間對咖啡因得率和純度的影響。

利用建立的高效液相色譜法分析5種提取方法從茶葉中提取的咖啡因提取物，能準(zhǔn)確分析出不同提取物之間的差異，每種方法都各有優(yōu)缺點(diǎn)，方法不同導(dǎo)致咖啡因的提取率和純度也有一定差異，但5種提取方法總體上都能達(dá)到一般實(shí)驗(yàn)室提取咖啡因的要求。5種提取方法相比較而言，萃取法較為簡便易行，耗時(shí)較短，升華法和DMSO溶解-凍干法對儀器和操作要求較高，評價(jià)3種萃取法的經(jīng)濟(jì)適用性及結(jié)合綠色化學(xué)的發(fā)展理念，提取方法2的丙酮水溶液提取-氯仿萃取法提取咖啡因效果最佳，咖啡因提取率為1.36%，咖啡因純度能達(dá)到97.47%。

本研究建立的咖啡因高效液相色譜分析法具有準(zhǔn)確性好和精密度高等優(yōu)點(diǎn)，可用于咖啡因提取物中咖啡因含量的檢測。