野生櫻桃李酵素的主要成分及其抗氧化性能分析

李浩然，劉偉，王曉文，王俊龍，武晉雄，李雪*

（1.伊犁師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院新疆維吾爾自治區(qū)普通高校天然產(chǎn)物化學(xué)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 伊寧 835000；2.四川省達(dá)州市林業(yè)研究科技推廣中心，四川 達(dá)州 635000）

食用酵素是指以動(dòng)物、植物及菌類為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵而制得的具有特定生物活性成分的可食用產(chǎn)品[1]。食用酵素口感清爽酸甜，含有糖類、酶類（脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶等）及有機(jī)酸類等對(duì)人體有益的活性物質(zhì)，具有清除自由基、抗菌消炎、抗衰老、凈化血液等功能[2]。發(fā)酵過(guò)程不僅可以改善產(chǎn)品風(fēng)味、增加色澤、減少刺激性物質(zhì)，還可以產(chǎn)生黃酮類、有機(jī)酸等新的活性成分。目前關(guān)于食用酵素體外抗氧化性能的研究較多，如Li等[3]采用釀酒酵母菌和植物乳桿菌發(fā)酵的蘋(píng)果酵素總黃酮含量比原蘋(píng)果汁增加了87.76%，維生素C含量增加至1.02 mg/100 mL，清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基能力、超氧陰離子自由基（·O2－）清除能力和鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）均增強(qiáng)；Kwaw等[4]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌發(fā)酵的桑葚酵素總酚含量明顯增加，其抗氧化性能與總酚含量正相關(guān)；金哲寧等[5]研究發(fā)現(xiàn)沙棘酵素3個(gè)抗氧化活性指標(biāo)（羥基自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力和DPPH自由基清除能力）均隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，且與總游離氨基酸含量和總酸含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；高慶超等[6]發(fā)現(xiàn)黑果枸杞酵素含有13種有機(jī)酸，以琥珀酸、醋酸和乳酸為主，總有機(jī)酸含量比原黑果枸杞增加了110.39%，并認(rèn)為黑果枸杞酵素體外抗氧化活性主要受有機(jī)酸、總黃酮、花青素、維生素和總酚的影響。

野生櫻桃李（Prunus cerasifera）為薔薇科李屬落枝灌木或小喬木，是一種珍稀的野生果樹(shù)種質(zhì)資源，其野生種在我國(guó)僅分布于新疆伊犁霍城縣婆羅科努山的大西溝和小西溝[7]，被列為國(guó)家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物。野生櫻桃李果實(shí)含有氨基酸、有機(jī)酸、黃酮、多糖、多酚及維生素等物質(zhì)，可抗氧化、抗菌、治療便秘和促進(jìn)傷口愈合[8-10]，被當(dāng)?shù)鼐用穹Q之為“雪域圣果”，具有天然的保健功能和較高的開(kāi)發(fā)潛力。然而，由于野生櫻桃李果實(shí)采收后不易貯存，目前主要加工為果醬、果汁、果酒等低附加值產(chǎn)品。隨著我國(guó)酵素產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，將野生櫻桃李開(kāi)發(fā)為酵素類功能性食品具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前關(guān)于野生櫻桃李酵素的研究鮮有報(bào)道，由于野生櫻桃李有機(jī)酸含量高、糖酸比較低，需要外源添加糖類物質(zhì)提升口感，而外源糖的添加對(duì)發(fā)酵過(guò)程有重要影響。此外，野生櫻桃李果皮也含有花色苷、多酚等物質(zhì)，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性[11-12]，因此本研究以野生櫻桃李果肉和果皮為主要原料，采用自然發(fā)酵法制備不同糖添加量的6種野生櫻桃李果肉酵素和果皮酵素，測(cè)定6種酵素的功能成分及含量，并考察其體外抗氧化性能，以期為野生櫻桃李酵素的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生櫻桃李：2020年9月采摘于新疆伊犁霍城縣大西溝，由伊犁師范大學(xué)生物與地理科學(xué)學(xué)院任艷利副教授鑒定為薔薇科野生櫻桃李果實(shí)，樣本存于伊犁師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院天然產(chǎn)物研究室；冰糖（一級(jí)品）：市售；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：上海源葉生物科技有限公司；沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）、蒽酮試劑、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，4，6-三（2-吡啶基） 三嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）：長(zhǎng)沙市如吉生物科技有限公司；D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）、福林酚試劑：上海士鋒生物科技有限公司；水溶性維生素E（Trolox）：上海麥克林生化科技有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、濃硫酸、無(wú)水碳酸鈉、氫氧化鈉、三氯化鋁、鄰苯二甲酸氫鉀、氯化鉀、氯化鐵、水楊酸鈉、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、無(wú)水乙醇、甲醇（均為分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津分析儀器廠；DD-5M低速離心機(jī)：長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司；FA2104電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；PHS-3F酸度計(jì)：上海精科儀器有限公司；WYA-2S阿貝折射儀：上海精密科學(xué)儀器廠；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SY-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；DW-86W28超低溫冰箱：浙江捷盛低溫設(shè)備有限公司；HH-S1數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 野生櫻桃李酵素的制備

野生櫻桃李紫色鮮果用無(wú)菌水洗滌后，晾干水分，去皮、去核，將果肉和果皮分別打漿、曬干、研磨后得到果肉干粉和果皮干粉，稱取果肉干粉3份，每份均為180 g，置于發(fā)酵壇中，發(fā)酵壇預(yù)先于121℃條件下滅菌20 min，加入占總質(zhì)量10%、20%、30%的冰糖，再分別加入無(wú)菌水1 000 mL，密封，編號(hào)分別為R10（10%糖添加量果肉酵素）、R20（20%糖添加量果肉酵素）、R30（30%糖添加量果肉酵素）。果皮酵素同果肉酵素的制備方法一致，編號(hào)分別為P10（10%糖添加量果皮酵素）、P20（20%糖添加量果皮酵素）、P30（30%糖添加量果皮酵素）。

以上所有操作在無(wú)菌工作臺(tái)進(jìn)行，發(fā)酵壇置于培養(yǎng)箱25℃避光發(fā)酵90 d。發(fā)酵結(jié)束后，分別取10.00 mL酵素液，每種酵素取3個(gè)平行樣，過(guò)濾后，4 000 r/min離心7 min，取上清液置于-80℃超低溫冰箱冷凍保存，使用時(shí)提前取出解凍至25℃待測(cè)。

1.3.2 未發(fā)酵野生櫻桃李提取液的制備

參考文獻(xiàn)[9]的方法并稍作修改，分別稱取野生櫻桃李果肉干粉和果皮干粉180 g，置于500 mL圓底燒瓶中，加入300 mL 60%乙醇，設(shè)置水浴鍋溫度70℃，回流90 min，提取3次后合并提取液過(guò)濾，濾液4 000 r/min離心7 min，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至無(wú)醇味，濃縮得浸膏，定容于1 000 mL容量瓶中，搖勻，得未發(fā)酵果肉提取液（編號(hào)為CK1）和未發(fā)酵果皮提取液（編號(hào)為CK2），分別取10.00 mL未發(fā)酵果肉和果皮提取液，每種提取液取3個(gè)平行樣，置于-80℃超低溫冰箱冷凍保存，使用時(shí)提前取出解凍至25℃待測(cè)。

1.3.3 總黃酮含量的測(cè)定

采用NaNO2-Al（NO3）3法測(cè)定總黃酮含量[13]。準(zhǔn)確移取0.50 mL樣品溶液置于25 mL容量瓶中，加入5%NaNO2溶液0.50 mL，靜置5 min，再加入10%Al（NO3）3溶液0.50 mL，搖勻靜置5 min后加入4%NaOH溶液4.00 mL，搖勻后用60%乙醇定容，25℃條件下放置15 min后，測(cè)定在510 nm波長(zhǎng)處的吸光度。配制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入試液測(cè)定吸光度得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.028 88x-0.000 79，R2=0.999 45。測(cè)得的樣品吸光度代入回歸方程計(jì)算樣品中總黃酮含量。

1.3.4 總糖含量的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[10]中的方法，采用硫酸-蒽酮法測(cè)定。準(zhǔn)確移取各樣品溶液1.00 mL于10 mL容量瓶中，加入6.00 mL的硫酸-蒽酮溶液，搖勻后沸水浴15 min，隨后于冰水浴冷卻至25℃，測(cè)定在625 nm波長(zhǎng)處的樣品吸光度。配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入試液測(cè)定吸光度得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.044 42x-0.006 05，R2=0.999 55。測(cè)得的樣品吸光度代入回歸方程計(jì)算樣品中總糖含量。

1.3.5 總酚含量的測(cè)定

采用福林酚法測(cè)定總酚含量[14]。準(zhǔn)確移取各樣品溶液1.00 mL于25 mL容量瓶中，依次加入12.00 mL蒸餾水、1.00 mL福林酚溶液，搖勻后靜置6 min，加入2.00 mL0.1%Na2CO3溶液，搖勻后用蒸餾水定容至刻度線，搖勻后靜置30 min，在765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。配制沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入試液測(cè)定吸光度得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.084 73x-0.017 62，R2=0.999 31。測(cè)得的樣品吸光度代入回歸方程計(jì)算樣品中總酚含量。

1.3.6 總酸及可溶性固形物含量的測(cè)定

總酸的含量參考GB 12456—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中總酸的測(cè)定》[15]進(jìn)行測(cè)定；可溶性固形物的含量參考GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》[16]進(jìn)行測(cè)定。

1.3.7 抗氧化性能的測(cè)定

1.3.7.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[17]中的方法并稍作修改，測(cè)定DPPH自由基清除能力。用甲醇作溶劑配制濃度為76 μmol/L的DPPH溶液，將野生櫻桃李酵素樣品配制成質(zhì)量濃度為 1.5、3.0、4.5、6.0、7.5 mg/mL 的溶液，加入 9.00 mL DPPH溶液，搖勻后避光靜置30 min，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。稱量相同質(zhì)量濃度的未發(fā)酵野生櫻桃李果皮、果肉提取液和對(duì)照L-抗壞血酸溶液，用相同方法測(cè)定3種樣品的DPPH自由基清除率。計(jì)算公式如下。

DPPH自由基清除率/%=[（A空白-A樣品）/A空白]×100

式中：A空白為1 mL甲醇和9 mL DPPH溶液混合后的吸光度；A樣品為樣品測(cè)定管的吸光度。

1.3.7.2 ·OH清除能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[18]中的方法并稍作修改，測(cè)定·OH清除能力。向試管中依次加入0.50 mL樣品、1.00 mL H2O2溶液、0.60 mL水楊酸鈉溶液和1.00 mL硫酸亞鐵溶液，37℃條件下恒溫水浴1 h，以蒸餾水為空白，在562 nm波長(zhǎng)下測(cè)定樣品吸光度。用相同方法測(cè)定對(duì)照L-抗壞血酸溶液對(duì)·OH的清除率。計(jì)算公式如下。

·OH 清除率/%={[A空白-（A樣品2-A樣品1）]/A空白}×100

式中：A空白為空白試樣的吸光度；A樣品1為不加H2O2顯色劑的樣品溶液本底吸光度；A樣品2為加H2O2顯色劑的樣品吸光度。

1.3.7.3 總抗氧化能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[19]中的方法并稍作修改，采用鐵離子抗氧化能力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）法測(cè)定總抗氧化能力。分別配制10 mmol/L TPTZ鹽酸溶液、pH3.6的0.1 mol/L醋酸鹽緩沖溶液和20 mmol/L氯化鐵溶液，將3種溶液按照體積比1∶10∶1混勻后即得溶液為FRAP工作液。準(zhǔn)確移取0.20 mL樣品溶液置于比色管中，加入5.00 mL FRAP工作液，搖勻后，避光條件下放置90 min，于593 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品吸光度。用不同濃度Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)以上操作，以不同濃度Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度為縱坐標(biāo)，Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：y=6.509 5x+0.021 41，R2=0.999 01。將各樣品的吸光度代入回歸方程，樣品FRAP清除能力用每克干樣品的Trolox當(dāng)量評(píng)價(jià)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，通過(guò)Duncan法和單因素方差分析法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)間的差異顯著性，采用Pearson法進(jìn)行總黃酮、總糖、總酚和總酸等功能性成分含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析。采用Origin 8.5和Excel繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生櫻桃李酵素的主要成分測(cè)定結(jié)果

野生櫻桃李果肉和果皮酵素的主要成分及含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 野生櫻桃李酵素主要成分測(cè)定結(jié)果Table 1 Measurement results of main components in Prunus cerasifera Jiaosu

由表1可以看出，與未發(fā)酵野生櫻桃李果肉相比，野生櫻桃李果肉酵素的總黃酮含量均顯著降低（P＜0.05），R10、R20和 R30分別降低了 62.01%、73.74%和62.57%，R20酵素中總黃酮的含量最低，而R10和R30酵素中總黃酮含量差異不顯著（P＞0.05），可能是由于隨糖添加量增加會(huì)使發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)[20]，野生櫻桃李果肉酵素中有部分黃酮類化合物氧化或轉(zhuǎn)化為其他化合物，從而使總黃酮含量降低[21]；3個(gè)野生櫻桃李果皮酵素的總黃酮含量均低于未發(fā)酵野生櫻桃李果皮總黃酮含量，P10、P20和P30分別降低了26.60%、22.66%和48.28%；3個(gè)果皮酵素總黃酮含量均高于3個(gè)果肉酵素，這與野生櫻桃李果皮中初始總黃酮含量高于果肉有關(guān)，Wang等[22]報(bào)道野生櫻桃李紫果果皮中含有4種花青素，總花青素含量為11.18 g/kg·FW～19.86 g/kg·FW，而紫果果肉中未檢測(cè)到花青素。

外源糖的加入可以為微生物的生長(zhǎng)繁殖提供穩(wěn)定的碳源，從而延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，另一方面還可以抑制雜菌的生長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)90 d的自然發(fā)酵后，野生櫻桃李果肉和果皮酵素的總糖含量均顯著高于未發(fā)酵果肉和果皮（P＜0.05），且隨糖添加量的增加而逐漸增加，R10、R20和R30的總糖含量分別增加了11.95%、298.74%和 569.81%，P10、P20和P30的總糖含量分別增加了51.45%、353.18%和502.89%，所有果肉和果皮酵素總糖含量均低于實(shí)際糖添加量，這是微生物生長(zhǎng)繁殖過(guò)程大量消耗糖類物質(zhì)所致[23]。

野生櫻桃李果肉和果皮酵素的總酚含量均顯著高于未發(fā)酵果肉和果皮（P＜0.05），R10、R20和 R30的總酚含量分別增加了202.04%、148.98%和217.01%，P10、P20和P30的總酚含量分別增加了95.38%、90.17%和172.25%，這是由于在微生物酶和酸類物質(zhì)的作用下，野生櫻桃李果肉和果皮中與纖維素結(jié)合的不溶多酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可溶的游離態(tài)多酚[24]，Chu等[25]研究發(fā)現(xiàn)微生物可以合成單體多酚類物質(zhì)；糖添加量的變化與果肉和果皮酵素總酚含量變化趨勢(shì)不一致，這可能是由于果肉和果皮化學(xué)成分種類及含量的差異影響微生物的發(fā)酵，從而導(dǎo)致發(fā)酵液總酚等活性成分的差異[7]。

在微生物發(fā)酵作用下，所有野生櫻桃李果肉和果皮酵素樣品的總酸含量顯著高于未發(fā)酵果肉和果皮（P＜0.05），R10、R20 和 R30 的總酸含量分別增加了84.59%、76.10%和134.28%，P10、P20和 P30的總酸含量分別增加了55.68%、76.45%和99.17%，這是因?yàn)橛袡C(jī)酸是微生物生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生的主要代謝產(chǎn)物。高慶超等[6]發(fā)現(xiàn)黑果枸杞酵素的可滴定酸含量比原黑果枸杞增加了109.73%～166.67%，與本研究結(jié)果類似；范昊安等[26]的研究表明，發(fā)酵過(guò)程中，蘋(píng)果梨酵素中的草酸和醋酸等次級(jí)代謝產(chǎn)物的生成導(dǎo)致可滴定酸增加；野生櫻桃李果肉酵素中的總酸含量隨糖添加量的增加呈先降低后明顯增加的趨勢(shì)，果皮酵素中的總酸含量則隨糖添加量的增加而逐漸升高，這是由于糖類物質(zhì)為微生物提供了足夠的發(fā)酵底物，有機(jī)酸大量代謝生成，在酵母菌和細(xì)菌的作用下，可使還原型和氧化型糖降解代謝為丙酮酸、琥珀酸和富馬酸等有機(jī)酸[27]。

食品中的可溶性固形物主要包括維生素、糖、酸、礦物質(zhì)等所有可溶于水的化合物，是評(píng)價(jià)食品及果蔬汁飲料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)，同時(shí)也是發(fā)酵底物的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)因子。野生櫻桃李果肉和果皮酵素的可溶性固形物含量均高于未發(fā)酵果肉和果皮，并且果肉和果皮酵素的可溶性固形物含量呈現(xiàn)出隨糖添加量的增加而增加的趨勢(shì)，R10、R20和R30的可溶性固形物含量分別增加了19.56%、86.83%和182.53%，P10、P20和P30的可溶性固形物含量分別增加了24.89%、117.39%和202.40%。此外，由表1可知，野生櫻桃李果肉和果皮酵素中總糖和總酸對(duì)可溶性固形物的貢獻(xiàn)最大，是可溶性固形物的主要成分。

2.2 野生櫻桃李酵素的抗氧化性能測(cè)定結(jié)果

2.2.1 野生櫻桃李酵素的DPPH自由基清除能力

野生櫻桃李果肉酵素和果皮酵素對(duì)DPPH自由基的清除能力如圖1所示。

圖1 野生櫻桃李果肉酵素和果皮酵素的DPPH自由基清除能力Fig.1 DPPH radical scavenging ability of Prunus cerasifera pulps and rinds Jiaosu

由圖1可以看出，在1.5 mg/mL～7.5 mg/mL濃度范圍內(nèi)，CK1、R10、R20和R30對(duì)DPPH自由基的清除能力隨樣品質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)，各果肉酵素樣品清除DPPH自由基的能力順序?yàn)閂C＞R30＞R10＞R20＞CK1。經(jīng) SPSS 21.0 軟件計(jì)算，CK1、R10、R20和 R30清除 DPPH自由基的 IC50分別為（5.55±0.04）、（3.25±0.08）、（5.26±0.14）mg/mL 和（2.60±0.09）mg/mL；其中R30的IC50最低，可見(jiàn)在一定濃度范圍內(nèi)，糖添加量為30%的果肉酵素表現(xiàn)出最強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。對(duì)于果皮酵素，在1.5 mg/mL～7.5 mg/mL 濃度范圍內(nèi)，CK2、P10、P20和 P30對(duì) DPPH自由基的清除能力同樣呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)，各果皮酵素樣品清除DPPH自由基的能力順序?yàn)閂C＞P30＞P20＞CK2＞P10。經(jīng) SPSS 21.0 軟件計(jì)算，CK2、P10、R20和P30清除DPPH自由基的IC50分別為（9.00±0.15）、（16.90±1.27）、（5.69±0.29）mg/mL 和（3.04±0.05）mg/mL；其中P30的IC50最低，可見(jiàn)在一定濃度范圍內(nèi)，糖添加量為30%的果皮酵素同樣表現(xiàn)出最強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，但低于糖添加量為30%的果肉酵素。

2.2.2 野生櫻桃李酵素的羥基自由基清除能力

野生櫻桃李果肉酵素和果皮酵素對(duì)·OH的清除能力如圖2所示。

圖2 野生櫻桃李果肉酵素和果皮酵素的·OH清除能力Fig.2 Hydroxyl radical scavenging ability of Prunus cerasifera pulps and rinds Jiaosu

由圖2可知，在1.5 mg/mL～7.5 mg/mL濃度范圍內(nèi)，CK1、R10、R20和 R30對(duì)·OH 的清除能力總體呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，各果肉酵素樣品清除·OH能力與清除 DPPH 自由基能力順序一致，為 VC＞R30＞R10＞R20＞CK1。經(jīng) SPSS 21.0軟件計(jì)算，CK1、R10、R20和 R30清除·OH 的 IC50分別為（3.53±0.07）、（2.17±0.04）、（2.69±0.05）mg/mL 和（2.02±0.09）mg/mL；其中，R30 的 IC50最低，可見(jiàn)在一定濃度范圍內(nèi)，糖添加量為30%的果肉酵素同樣表現(xiàn)出最強(qiáng)的清除·OH能力。各果皮酵素樣品清除·OH的能力與清除DPPH自由基能力順序一致，同樣為 VC＞P30＞P20＞CK2＞P10。經(jīng) SPSS 21.0 軟件計(jì)算，CK2、P10、R20和 P30清除·OH 的 IC50分別為（4.80±0.07）、（5.40±0.10）、（3.98±0.11）mg/mL 和（2.62±0.05）mg/mL；其中，P30 的 IC50最低，這表明糖添加量為30%的果皮酵素同樣對(duì)·OH的清除能力最強(qiáng)，但與果肉酵素相比，R30對(duì)·OH的清除能力強(qiáng)于P30。

2.2.3 野生櫻桃李酵素的總抗氧化能力

野生櫻桃李果肉和果皮酵素的總抗氧化能力測(cè)定結(jié)果如圖3所示。

圖3 野生櫻桃李果肉和果皮酵素的總抗氧化能力Fig.3 Total antioxidant capacity of Prunus cerasifera pulps and rinds Jiaosu

采用FRAP法考察野生櫻桃李酵素的總抗氧化能力。由圖3可知，R30的總抗氧化能力最強(qiáng)，F(xiàn)RAP為（102.43±0.99）mg Trolox/g，R10和 R20的 FRAP 分別為（98.38±1.08）mg Trolox/g 和（98.27±0.38）mg Trolox/g，R10和R20的總抗氧化能力無(wú)顯著差異（P＞0.05），CK1的總抗氧化能力最弱，F(xiàn)RAP值為（85.19±0.69）mg Trolox/g。對(duì)于果皮酵素，CK2、P10、P20 和P30 的FRAP值分別為（90.99±0.46）、（92.89±0.64）、（96.60±0.50）mg Trolox/g和（99.56±1.31）mg Trolox/g，總抗氧化能力順序?yàn)镻30＞P20＞P10＞CK2。果肉酵素和果皮酵素的總抗氧化能力順序與清除DPPH自由基和·OH的能力順序均不一致，糖添加量為30%的果肉酵素的總抗氧化能力強(qiáng)于同樣糖添加量的果皮酵素。

2.3 野生櫻桃李酵素主要成分與抗氧化活性的相關(guān)性分析

表2為野生櫻桃李果肉酵素主要成分及其與抗氧化活性的相關(guān)性分析結(jié)果。

表2 野生櫻桃李果肉酵素各參數(shù)相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of various parameters in Prunus cerasifera pulps Jiaosu

由表2可知，野生櫻桃李果肉酵素DPPH自由基清除能力與總酚、總酸及可溶性固形物含量均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為 0.738、0.833 和0.716；果肉酵素·OH清除能力則與總酚和總酸含量均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.972和0.953；果肉酵素總抗氧化能力則與總酚、總酸和可溶性固形物含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.970、0.969和0.751；總糖含量與DPPH自由基清除能力、·OH清除能力和總抗氧化能力均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)分別為 0.641、0.625 和 0.703；總黃酮含量與DPPH自由基清除能力無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系（P＞0.05），而與·OH清除能力和總抗氧化能力均呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為-0.890和-0.926?？梢钥闯?，果肉酵素中的總酚、總酸和可溶性固形物含量對(duì)DPPH自由基清除能力和總抗氧化能力有一定影響，·OH清除能力則主要受總酚和總酸含量的影響，由于果肉酵素中總黃酮含量總體上遠(yuǎn)低于總酚、總酸和可溶性固形物含量，因此，并不能簡(jiǎn)單的認(rèn)為黃酮類物質(zhì)會(huì)抑制抗氧化活性，而文獻(xiàn)表明野生櫻桃李果肉中黃酮類物質(zhì)會(huì)起到一定的抗氧化作用[9]。

表3為野生櫻桃李果皮酵素各參數(shù)相關(guān)性分析。

表3 野生櫻桃李果皮酵素各參數(shù)相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of various parameters in Prunus cerasifera rinds Jiaosu

由表3可知，野生櫻桃李果皮酵素DPPH自由基清除能力與總糖和可溶性固形物含量均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.904和0.911；果皮酵素·OH清除能力則與總糖、總酚、總酸和可溶性固形物含量均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.970、0.704、0.757 和 0.960；果皮酵素總抗氧化能力也與總糖、總酚、總酸和可溶性固形物含量均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為 0.972、0.874、0.914和0.978。由此可知，果皮酵素中的總糖、總酚、總酸和可溶性固形物含量對(duì)·OH清除能力和總抗氧化能力有一定影響，DPPH自由基清除能力則主要受總糖和可溶性固形物含量的影響。

3 討論

通過(guò)比較不同糖添加量的果肉和果皮酵素主要成分的含量差異，可以看出不同糖添加量明顯影響了微生物發(fā)酵過(guò)程，從而使各酵素的活性物質(zhì)含量產(chǎn)生較大差異。外源糖的加入為微生物發(fā)酵提供了碳源，糖添加量較低會(huì)使發(fā)酵不完全，導(dǎo)致代謝產(chǎn)物減少及抗氧化活性降低。從表3可以看出總糖與總酚、總酸和可溶性固形物均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），這是由于在微生物的作用下，糖類物質(zhì)代謝為有機(jī)酸，并促進(jìn)微生物合成多酚類物質(zhì)，從而增加了總酸及總酚的含量。果肉和果皮酵素在一定的濃度條件下均表現(xiàn)出良好的體外抗氧化性能，并呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)，R30和P30的DPPH自由基清除能力、·OH清除能力和總抗氧化能力均最強(qiáng)，而且R30的抗氧化性能強(qiáng)于P30，結(jié)合表2、表3的相關(guān)性結(jié)果分析，原因主要是R30和P30中的總糖、總酚、總酸和可溶性固形物的含量均高于其他酵素，尤其是果肉酵素中的總酚和總酸與3種抗氧化指標(biāo)均具有極顯著的正相關(guān)性（P＜0.01），與陳小偉等[28]的研究結(jié)果一致。劉曉等[11]、劉偉等[29]研究發(fā)現(xiàn)，野生櫻桃李果皮提取物及枝、葉提取物的抗氧化活性的變化趨勢(shì)均與多酚含量一致，陳小偉等[30]發(fā)現(xiàn)咖啡果皮酵素中的總酚含量與2，2’-二氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基和DPPH自由基的清除能力極顯著正相關(guān)?？偹嶂械囊恍┯袡C(jī)酸是抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，方晟等[31]研究發(fā)現(xiàn)，金佛手酵素中的乳酸和乙酸含量與·OH清除率呈極顯著正相關(guān)，而琥珀酸與DPPH自由基清除能力呈極顯著正相關(guān)，草莓酵素中的檸檬酸和L-蘋(píng)果酸與4種抗氧化評(píng)價(jià)指標(biāo)均呈極顯著正相關(guān)[28]。

4 結(jié)論

本文通過(guò)DPPH自由基、羥基自由基和FRAP 3種抗氧化模型，評(píng)價(jià)了不同糖添加量的野生櫻桃李果肉和果皮酵素的體外抗氧化性能，并采用Pearson法分析了野生櫻桃李酵素的主要成分與抗氧化活性的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同糖添加量使微生物發(fā)酵代謝產(chǎn)物產(chǎn)生了差異，6種果肉和果皮酵素總體表現(xiàn)出良好的抗氧化活性，30%糖添加量的果肉和果皮酵素DPPH自由基清除能力、·OH清除能力和總抗氧化能力最強(qiáng)，多酚類物質(zhì)和有機(jī)酸是野生櫻桃李酵素抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。在今后的工作中，可以對(duì)野生櫻桃李發(fā)酵過(guò)程中多酚類物質(zhì)和有機(jī)酸的種類、含量及體外抗氧化活性進(jìn)行研究，為野生櫻桃李酵素產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供參考。