新疆8種薔薇果中可溶性糖組分含量的特征分析

王寧，周鋼，張珊滋，王春燕，田莉，3*

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院，新疆 烏魯木齊 830011；3.新疆名醫(yī)名方與特色方劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830011）

全世界有200多種薔薇，其中有多種薔薇的果實(shí)可供藥食兩用，其富含氨基酸、總多酚、總有機(jī)酸和糖類等成分[1-2]，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血脂、抗癌和抗菌等方面的藥理活性[3]；在阿拉斯加、匈牙利和土耳其等地，一些口感獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富的薔薇果也被制成果醬，深受兒童喜愛[4]。新疆地處亞歐腹地，獨(dú)特的氣候和地理?xiàng)l件為薔薇提供了適宜的生長(zhǎng)環(huán)境[5]，新疆薔薇果果型大、肉厚、味甘甜、營(yíng)養(yǎng)豐富，在食品、藥品開發(fā)方面具有巨大潛力[1-2]。植物多糖是植物體內(nèi)具有多種生物學(xué)功能的生物大分子，主要由葡萄糖、果糖、半乳糖等單糖以一定的比例聚合而成，相對(duì)分子質(zhì)量從幾萬(wàn)到幾百萬(wàn)不等?，F(xiàn)代藥理研究表明，植物多糖具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗氧化、抗輻射等多種藥理作用[6-7]，目前，關(guān)于新疆薔薇果中總多糖和單糖的研究鮮見報(bào)道。

多糖主要采用滴定法和紫外分光光度法（ultraviolet and visible spectrophotometry，UV-Vis）[8-9]等方法檢測(cè)。滴定法操作簡(jiǎn)單、成本低，但試驗(yàn)條件要求較高且滴定終點(diǎn)不易判別；UV-Vis法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，目前被廣泛應(yīng)用。單糖目前最常用的檢測(cè)方法是高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[10]，糖類物質(zhì)經(jīng)衍生化后可連接在紫外可見吸收檢測(cè)器中（ultraviolet-visible detector，UVD）進(jìn)行測(cè)定，但衍生化操作步驟繁瑣且準(zhǔn)確性較低；蒸發(fā)光檢測(cè)器（evaporativelight scattering detector，ELSD）[11]可直接檢測(cè)糖類物質(zhì)，但靈敏度、重復(fù)性和精密度較差；示差折光檢測(cè)器（differential refractive index detector，RID）[12]檢測(cè)糖類物質(zhì)具有靈敏度高、穩(wěn)定性和重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。因此本試驗(yàn)采用UV-Vis和HPLC-RID測(cè)定新疆8種薔薇果中的總多糖和4種單糖的含量，并采用主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚類分析（cluster analysis，CA）進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[13]，為后續(xù)研發(fā)品種的篩選及質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

8種不同品種的完全成熟的新疆薔薇果（表皮為深紅色、萼片干枯）于2020年9月采自新疆烏魯木齊市雅瑪里克山和阿勒泰地區(qū)海拔的山地或灌叢，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)徐海燕教授鑒定為薔薇科薔薇的果實(shí)，編號(hào)為 S1～S8，見表 1。

表1 樣品編號(hào)及采集地點(diǎn)Table 1 Sample number and collection location

葡萄糖（純度大于99.8%）、果糖（純度大于99.9%）、蔗糖（純度大于98.8%）：中國(guó)食品藥品檢定研究院；麥芽糖（純度大于94.4%）：廣州碩譜生物科技有限公司；乙腈（色譜純）：美國(guó)Honeywell公司；苯酚、硫酸（分析純）：天津北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A島津液相色譜儀、RID-10A檢測(cè)器：日本島津公司；722S可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；SL-200高速多功能粉碎機(jī)：浙江省永康市松青五金廠；XS105電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ-5200DE數(shù)控超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；TDL-5A離心機(jī)：上海菲恰爾分析儀器有限公司；Milli-Q純水機(jī)：美國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 總多糖含量的測(cè)定

1.3.1.1 供試品提取方法篩選

精密稱量S3號(hào)干燥樣品粉末（80目）2.000 0 g，平行9份，平均分3組，均加入500 mL蒸餾水，分別采用浸漬24 h、超聲45 min、煎煮45 min三種方法提取總多糖，采用UV-Vis法測(cè)定總多糖含量。

1.3.1.2 供試品溶液的制備

分別精密稱取8種新疆薔薇果粉末（80目）2.0000g，按照1.3.1.1所得最佳方法進(jìn)行提取，抽濾，濾液作為供試品溶液，備用。

1.3.1.3 總多糖顯色條件考察

以薔薇果中的總多糖作為考察指標(biāo)，單因素考察5%苯酚用量 0.6、0.8、1.0、1.2 mL，其它條件為濃硫酸3 mL、50 ℃ 加熱 20 min；濃硫酸用量 3、5、7 mL，其它條件為5%苯酚用量1.0 mL、50℃加熱20 min；加熱溫度 40、50、60、80℃，其它條件為 5%苯酚用量 1.0 mL、濃硫酸 5 mL、加熱 20 min；加熱時(shí)間 10、20、30、40 min，其它條件為5%苯酚用量1.0 mL、濃硫酸5 mL、加熱溫度50℃。

1.3.1.4 總多糖線性關(guān)系考察

精密稱取葡萄糖對(duì)照品適量，制備濃度為5.138μg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液。精密移取 0、1.20、1.60、2.00、2.40、2.80、3.20、3.60 mL，加入 2 mL 蒸餾水，按照最佳顯色條件在490 nm處測(cè)定吸光度[14]。以葡萄糖的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.1.5 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性考察

將方法“1.3.1.4”的葡萄糖對(duì)照品溶液的吸光度重復(fù)測(cè)定6次，記錄并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）值，考察儀器精密度。

取S3樣品粉末按照“1.3.1.2”方法，平行制備6份供試品溶液，按“1.3.1.3”方法，測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD值，考察重復(fù)性。

取方法“1.3.1.4”中對(duì)照品溶液，25℃放置，在0、2、4、8、12、24 h 分別測(cè)定吸光度，計(jì)算 RSD 值，考察樣品的穩(wěn)定性。

1.3.1.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱量已知總多糖含量的S3樣品粉末2.0000g，平行9份，按照樣品含量的80%、100%和120%加入葡萄糖對(duì)照品，每組平行3份，按照“1.3.1.2”方法制備供試品溶液，根據(jù)方法“1.3.1.4”中的條件測(cè)定，計(jì)算回收率，考察該方法的準(zhǔn)確度。

1.3.1.7 新疆薔薇果樣品中總多糖含量測(cè)定

精密移取“1.3.1.2”方法中的供試品液各0.1 mL，按照方法“1.3.1.4”的條件測(cè)定樣品中總多糖含量。

1.3.2 新疆薔薇果單糖組分分析

1.3.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液制備

精密稱取適量的果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖對(duì)照品，分別置于10 mL容量瓶，用40%乙腈溶解配制質(zhì)量濃度分別為 50.28、40.12、20.45、20.98 mg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.3.2.2 供試品溶液制備

取方法“1.3.1.2”中的供試品溶液125 mL，水浴蒸干，用5 mL 40%乙腈復(fù)溶，0.45 μm濾膜過(guò)濾，濾液為單糖組分供試品溶液。

1.3.2.3 色譜條件

色譜柱CAPCELLPKANH2（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈-水，在此基礎(chǔ)上考察流動(dòng)相的比例；流速：1.0 mL/min，柱溫：40℃，檢測(cè)池溫度 40℃，進(jìn)樣15 μL。

1.3.2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“1.3.2.1”方法中的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液，梯度稀釋制備系列濃度各單一對(duì)照品溶液，按方法“1.3.2.3”的條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.5 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性考察

取“1.3.2.4”方法中的對(duì)照品溶液，按“1.3.2.3”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算RSD值，考察儀器的精密度。

取S3樣品粉末按照方法“1.3.2.2”制備供試品溶液，平行6份，然后按“1.3.2.3”方法測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算RSD值，考察重復(fù)性。

取方法“1.3.2.4”中的對(duì)照品溶液，25℃放置 0、4、8、12、24、48 h，再按照方法“1.3.2.3”條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算RSD值，考察4種單糖的穩(wěn)定性。

1.3.2.6 加樣回收率

精密稱量已知含量的S3樣品粉末2.000 0 g，平行6份，按已知含量100%加入果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖對(duì)照品，按照方法“1.3.2.2”制備供試品溶液，再按方法“1.3.2.3”的條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算各成分的加樣回收率，考察該方法的準(zhǔn)確度。

1.3.2.7 薔薇果中單糖組分的含量測(cè)定

將方法“1.3.2.2”中的樣品溶液按照方法“1.3.2.3”進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各樣品中單糖組分的含量。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理與分析

以薔薇果中總多糖、果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖的含量為變量，利用Origin 2018軟件對(duì)樣品中的5種成分進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）及聚類分析（cluster analysis，CA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 總多糖提取方法的確定

總多糖含量結(jié)果：煎煮法總多糖含量為263.48mg/g、超聲法總多糖含量為187.52 mg/g、浸漬法總多糖含量為126.79 mg/g。因此，確定煎煮法為供試品提取方法。

2.2 總多糖測(cè)定方法的確定

表2為總多糖測(cè)定方法的單因素考察結(jié)果。

表2 單因素考察結(jié)果（n=3）Table 2 Results of the single factor examination（n=3）

由表2可知，以1.0 mL 5%苯酚溶液，5 mL濃硫酸，50℃加熱30min為顯色條件，放至25℃后進(jìn)行測(cè)定，此時(shí)S3樣品最為穩(wěn)定且總多糖含量最高，為263.48mg/g，因此，以此條件為最佳。

2.3 總多糖含量測(cè)定方法學(xué)考察

葡萄糖的線性方程為A=26.152C+0.013 4（r=0.999 2），表明葡萄糖含量在 7.65 μg/mL～22.67 μg/mL范圍線性關(guān)系良好。精密度考察的RSD值為0.96%。表明該儀器精密度良好。重復(fù)性考察的RSD值為0.67%，表明該方法重復(fù)性良好。穩(wěn)定性考察的RSD值為0.91%，表明總多糖在24 h內(nèi)穩(wěn)定。對(duì)樣品進(jìn)行加樣回收率測(cè)定試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率結(jié)果（n=9）Table 3 Results of sample adding recovery（n=9）

如表3所示，平均加樣回收率為99.87%，RSD值為1.20%，表明本法測(cè)定總多糖含量準(zhǔn)確。

2.4 單糖組分含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性與線性考察

依據(jù)《中國(guó)藥典》[15]，考察流動(dòng)相的比例對(duì)薔薇果中4種單糖成分色譜行為的影響，HPLC-RID色譜分析圖如圖1所示。

圖1 對(duì)照品和樣品溶液的HPLC-RID色譜分析圖Fig.1 HPLC-RID chromatograms of standard and sample solution

由圖1A可知，當(dāng)乙腈與水體積比為80∶20時(shí)，4種單糖成分的出峰時(shí)間在15 min以內(nèi)，果糖和葡萄糖的分離度小于1.5；由圖1B可知，當(dāng)乙腈與水的體積比為70∶30時(shí)，待測(cè)物質(zhì)對(duì)稱因子為1.45且麥芽糖無(wú)檢測(cè)峰；乙腈與水的體積比為75∶25時(shí)，4種單糖成分的分離度大于1.5，對(duì)稱因子為1.02，理論塔板為3 320，適用于4中單糖類成分檢測(cè)。

2.4.2 線性考察

4種單糖成分的線性考察結(jié)果見表4。

表4 4種單糖回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)Table 4 Regression equations，linear ranges and correlation coefficients of four monosaccharides

如表4所示，果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖分別在質(zhì)量濃度 5.01 mg/mL～35.09 mg/mL、4.04 mg/mL～28.28 mg/mL、0.25 mg/mL～8.06 mg/mL、0.24 mg/mL～7.73 mg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r≥0.999 6。

2.4.3 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率試驗(yàn)

果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的精密度考察RSD分別為0.27%、0.25%、0.69%、0.94%，表明儀器精密度良好；重復(fù)性考察的RSD分別為2.17%、2.38%、1.95%、2.72%，表明方法的重復(fù)性良好；穩(wěn)定性考察的RSD分別為2.36%、1.51%、2.41%、2.55%，表明4種單糖在48 h內(nèi)穩(wěn)定；4種單糖成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 4種單糖成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 5 Results of the spiked recovery test for the 4 monosaccharides（n=6）

續(xù)表5 4種單糖成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Continue table 5 Results of the spiked recovery test for the 4 monosaccharides（n=6）

由表5可知，平均加樣回收率分別為99.51%、99.24%、100.46%和 102.32%，RSD值分別為1.25%、0.66%、1.21%和2.43%，表明本法測(cè)定4種單糖含量準(zhǔn)確。

2.5 含量測(cè)定

新疆8種薔薇果中總多糖含量及4種單糖組分含量結(jié)果見表6。

表6 新疆8種薔薇果樣品中總多糖和4種單糖組分的含量Table 6 Content of total polysaccharides and four sugars in 8 Xinjiang Rosa fruits samples

表6結(jié)果顯示，總多糖和4種單糖組分的含量差異較大，含量分布范圍較廣。其中S4號(hào)樣品總多糖含量最高，S3號(hào)樣品果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖含量最高。

2.6 主成分分析

主成分分析（PCA）運(yùn)用降維的思維，通過(guò)提取對(duì)應(yīng)特征值大于1的成分，排除重疊信息，減少變量，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相似性分類[16-17]。本文以新疆8種薔薇果中總多糖、果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖5種成分為變量進(jìn)行PCA分析，結(jié)果如表7所示。

表7 主成分分析方差貢獻(xiàn)率Table 7 Principal component analysis variance contribution rate

表7結(jié)果表明，提取獲得的主成分為總多糖和果糖，累計(jì)的方差貢獻(xiàn)率為87.85%，前2個(gè)主成分因子的特征值分別為3.38和1.02，表明這2個(gè)主成分可以代表8種藥材中5個(gè)成分87.85%的信息。

旋轉(zhuǎn)后的因子載荷矩陣可以表示主成分與其對(duì)應(yīng)變量的相關(guān)系數(shù)[18-19]，結(jié)果見表8。

表8 旋轉(zhuǎn)后的因子載荷矩陣Table 8 Rotated component matrixa

采用得到的2個(gè)主成分對(duì)8種不同薔薇果進(jìn)行評(píng)分，計(jì)算2個(gè)主成分的單獨(dú)得分，表達(dá)式如下。

Y1=-0.070X1+0.159X2+0.177X3+0.172X4+0.084X5

Y2=0.903X1+0.033X2-0.139X3-0.134X4+0.281X5

以2個(gè)主成分所對(duì)應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率為權(quán)重，獲得綜合評(píng)價(jià)函數(shù)為Y=67.511%Y1+20.334%Y2，計(jì)算樣品的綜合得分并進(jìn)行排序，結(jié)果見表9，樣品S3質(zhì)量最好。

表9 8種薔薇果樣品的主成分因子得分、綜合得分和排序Table 9 Factor scores，comprehensive scores and sorting of principal components of 8 Rosa of fruits kinds of samples

2.7 聚類分析

聚類分析（CA）是一個(gè)“物以類聚”的分類過(guò)程，通過(guò)計(jì)算樣品間的歐氏距離，根據(jù)樣品間的相似性進(jìn)行分組[20]。本研究以新疆8種薔薇果中5種成分的含量為變量，以樣品間的歐式距離為區(qū)間分析樣品之間的異同[21]。聚類分析樹狀圖如圖2所示。

圖2 薔薇果的聚類分析樹狀圖Fig.2 Dendrogram for clustering analysis of the Rosa of fruits

由圖2可知，在樹狀圖的距離75處為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行歸類，可將樣品分成 3 類，S5、S7 和 S8 歸為一類，S1、S2、S4、S6歸為一類，S3歸為一類。此分析結(jié)果與主成分分析結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用UV-Vis和HPLC-RID分析測(cè)定新疆地區(qū)8種薔薇果中總多糖和4種單糖成分的含量，考察不同提取方法以及總多糖和4種單糖組分測(cè)定方法的提取效率，所建立的方法經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的方法學(xué)考察，操作簡(jiǎn)單、精密度好、靈敏度高，適用于果實(shí)類中糖的檢測(cè)。8種薔薇果中波斯單葉薔薇（S3）的綜合評(píng)分最高，其次為寬刺薔薇（S2）、密刺薔薇（S5）和疏花薔薇（S6），研究結(jié)果可為新疆薔薇果的開發(fā)及綜合利用提供試驗(yàn)依據(jù)。