• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    復(fù)配益生元微膠囊的制備及其消化耐受性

    2023-02-07 07:00:06馬航宇張士凱吳澎
    食品研究與開發(fā) 2023年3期
    關(guān)鍵詞:合生元微膠囊海藻

    馬航宇,張士凱,吳澎

    (山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 泰安 271000)

    益生菌、益生元和合生元是常見的微生態(tài)制劑,其中益生菌對(duì)腸道菌群進(jìn)行調(diào)節(jié)[1],益生元為益生菌提供營養(yǎng)底物[2],合生元是有益宿主的益生菌和益生元的混合物[3],具有益生功能和治療多種疾病的作用[4]。植物乳桿菌是一種兼性異型乳酸發(fā)酵[5]的革蘭氏陽性益生菌,其來源安全,擁有廣泛的代謝多樣性,被用作各種發(fā)酵食品的功能性發(fā)酵劑[6-7]。益生菌應(yīng)在加工、儲(chǔ)存和胃腸道消化過程中保持較高的活力,而植物乳桿菌對(duì)高酸環(huán)境敏感[8],并且在這些過程中還面臨著高溫和膽汁的威脅。目前微膠囊技術(shù)可以很好地解決食品中生物活性物質(zhì)不穩(wěn)定的問題[9],該技術(shù)可以在加工和儲(chǔ)存期間保護(hù)植物乳桿菌免受外部壓力,并保護(hù)植物乳桿菌到達(dá)作用部位時(shí)免受蛋白酶降解和pH值的影響[10],從而提高植物乳桿菌的耐酸性能。根據(jù)包裹益生菌的類型,益生菌的食品級(jí)遞送系統(tǒng)可分為蠶繭和“蜘蛛網(wǎng)”,前者采用外部保護(hù)層包圍內(nèi)部的益生菌,后者借助于網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)保護(hù)益生菌,微膠囊則屬于前者[11]。海藻酸鈉微膠囊是在二價(jià)陽離子(通常是CaCl2溶液形式的鈣離子)存在下通過離子凝膠形成[12],每個(gè)鈣離子均與4個(gè)α-L-古洛糖醛酸鈉(G)單體的羧基和羥基配位,形成所謂的“蛋盒”模型[13],然而,當(dāng)磷酸鹽和檸檬酸等螯合劑以及鈉或鎂離子等非膠凝陽離子存在時(shí),海藻酸鈉微膠囊在化學(xué)上是不穩(wěn)定的[14]。殼聚糖可以進(jìn)一步強(qiáng)化海藻酸鈉微膠囊的凝膠結(jié)構(gòu),它是一種從天然聚合物甲殼素中提取的聚陽離子多糖,與海藻酸鈉形成聚電解質(zhì)復(fù)合物(聚陰離子聚合物),陽離子殼聚糖的加入,可以對(duì)海藻酸鈉進(jìn)行包覆從而形成微膠囊[15]。近年來,海藻酸鈉微膠囊的生產(chǎn)已經(jīng)達(dá)到了益生菌包封的關(guān)鍵要求[16],包括生物相容性、生物降解性以及長期儲(chǔ)存性等[17]。將特定的益生菌與高度選擇性的益生元進(jìn)行配對(duì),使益生元作為益生菌的食物來源[18],是穩(wěn)定改變腸道微生物群最具前景的方法之一。

    黃精多糖(Polygonatum polysaccharide,PP)是黃精主要的活性與功能成分之一,具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖血脂、調(diào)節(jié)免疫力[19]等作用,它在發(fā)揮多糖作用的同時(shí)可以影響腸道菌群的生長,因此可以作為益生元協(xié)同植物乳桿菌生長,與其構(gòu)成合生元,促進(jìn)益生作用。菊粉(inulin,IL)是一種天然的低聚果糖,由果糖基經(jīng)β-糖苷鍵鏈接而成,每個(gè)分子通常含有一個(gè)末端葡萄糖基,這些糖苷鍵使菊粉能夠抵抗動(dòng)物或人類胃腸道酶的水解[20]。因此,菊粉被認(rèn)為是一種常見的益生元,并且被證明其能夠增加微生物數(shù)量和降低結(jié)腸內(nèi)容物的pH值[21]。研究表明,益生菌與益生元組合成的合生元能促進(jìn)腸道微生態(tài)平衡[22-23],如嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌與菊粉組成的合生元能有效緩解小鼠結(jié)腸炎癥并提高腸道有益菌屬比例[24],但不同微生態(tài)制劑治療潰瘍性結(jié)腸炎的效果有很大差異[25]。到目前為止,關(guān)于多種益生元復(fù)配與海藻酸鈉結(jié)合成微膠囊用于益生菌封裝的研究較少。

    本試驗(yàn)將黃精多糖和菊粉進(jìn)行復(fù)配并與植物乳桿菌合成合生元,采用擠壓法將其微膠囊化,隨后采用冷凍干燥技術(shù)進(jìn)行干燥處理,再進(jìn)行體外模擬胃腸液消化實(shí)驗(yàn),研究不同質(zhì)量比的益生元對(duì)植物乳桿菌的益生效果,同時(shí)評(píng)估合生元微膠囊對(duì)胃腸液的耐受性能以及植物乳桿菌在胃腸道中的釋放效果,基于這些研究,得到最優(yōu)的益生元質(zhì)量比,從而提高植物乳桿菌對(duì)腸胃液的耐受能力和微膠囊的貯藏穩(wěn)定性,為新型益生菌食品的研究與開發(fā)提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    植物乳桿菌HH-LP56:西安聚生源生物科技有限公司;MRS培養(yǎng)基:青島海博生物技術(shù)有限公司;海藻酸鈉、甘油、乳果糖、胃蛋白酶(1∶3 000 NFU/g)、胰蛋白酶(1∶250 NFU/mg):北京索萊寶科技有限公司;菊粉:河南晟發(fā)生物科技有限公司;黃精:取樣于山東泰安徂徠山地區(qū);磷酸二氫鉀、無水CaCl2、冰乙酸、殼聚糖(均為分析純):國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉(均為分析純):天津凱通化學(xué)試劑有限公司;海藻糖:上海麥克林生化科技有限公司;脫脂乳粉:新西蘭乳品集團(tuán)。

    1.2 儀器與設(shè)備

    SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī):寧波新芝生物科技股份有限公司;303-00A全自動(dòng)恒溫培養(yǎng)箱:天津市賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠;BCL-1360B型超凈工作臺(tái):北京亞太科隆儀器技術(shù)有限公司;HJ-6多頭加熱磁力攪拌器:國華儀器制造有限公司;TGL-20bR高速離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠;KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司;FCD-2000恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上?,樮帉?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;SHA-B水浴恒溫振蕩器:常州智博瑞儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 黃精多糖的制備

    參照賈宇涵等[26]的超聲波輔助提取法對(duì)黃精多糖進(jìn)行提取優(yōu)化,選擇成熟度適宜、無損傷腐爛的熟黃精切片烘干,磨干成粉,過40目篩。準(zhǔn)確稱取5 g黃精粉末,按照料液比1∶13(g/mL)添加去離子水,在超聲功率325 W的條件下超聲27 min,8 000 r/min離心15 min后過濾,加入無水乙醇后置于冰箱冷藏(4℃、24 h)后轉(zhuǎn)入烘箱干燥成粉末狀備用。

    1.3.2 植物乳桿菌生長曲線的測(cè)定

    將植物乳桿菌活菌以無菌操作按照5%接種量將菌種分別接種到不含益生元和含1%益生元(IL與PP質(zhì)量比為 0 ∶5、2 ∶3、1 ∶1、3 ∶2、5 ∶0)的 MRS 液體培養(yǎng)基中,置于37℃培養(yǎng)24 h,調(diào)整培養(yǎng)基初始pH值為5.9,每隔2 h取適量菌液,在600 nm下測(cè)定菌液的吸光度,以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),以O(shè)D值為縱坐標(biāo),根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制生長曲線。

    1.3.3 植物乳桿菌微膠囊的制備

    首先將活化2代~3代的植物乳桿菌8 000 r/min離心5 min,收集菌泥沉淀與一定濃度的海藻酸鈉溶液混合,進(jìn)行充分?jǐn)嚢枋蛊渚鶆?。在含有一定質(zhì)量的100 mL殼聚糖溶液中加入1%的冰乙酸使殼聚糖溶解,加入一定質(zhì)量的無水CaCl2在磁力攪拌器上使其充分混合均勻至無顆粒狀沉淀。將海藻酸鈉混合液通過5 mL管狀注射器(6號(hào)針頭)勻速逐滴滴入到殼聚糖—CaCl2溶液中形成濕態(tài)微膠囊,磁力攪拌15 min使微膠囊與固化液充分接觸,然后置于4℃冰箱靜置固化備用。用0.9%滅菌生理鹽水充分沖洗微膠囊表面,洗去表面浮菌,將其與凍干保護(hù)劑(脫脂乳6%、海藻糖8%、甘油4%、乳果糖8%)混合均勻后,在-20℃冰箱預(yù)凍24 h,壓力1.0 MPa,冷凍干燥24 h得到植物乳桿菌微膠囊顆粒。

    1.3.4 單因素試驗(yàn)

    1.3.4.1 海藻酸鈉濃度對(duì)微膠囊包埋率的影響

    在殼聚糖濃度0.8%,CaCl2濃度0.3 mol/L,固化時(shí)間3 h,海藻酸鈉濃度分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的條件下,按照1.3.3的方法制備植物乳桿菌微膠囊,以微膠囊包埋率為評(píng)定指標(biāo),考察海藻酸鈉濃度對(duì)微膠囊包埋率的影響。

    1.3.4.2 CaCl2濃度對(duì)微膠囊包埋率的影響

    在殼聚糖濃度0.8%,海藻酸鈉濃度2%,固化時(shí)間3 h,CaCl2濃度分別為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L 的條件下,按照1.3.3的方法制備植物乳桿菌微膠囊,以微膠囊包埋率為評(píng)定指標(biāo),考察CaCl2濃度對(duì)微膠囊包埋率的影響。

    1.3.4.3 殼聚糖濃度對(duì)微膠囊包埋率的影響

    在海藻酸鈉濃度2%,CaCl2濃為0.3 mol/L,固化時(shí)間3 h,殼聚糖濃度為0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%的條件下,按照1.3.3的方法制備植物乳桿菌微膠囊,以微膠囊包埋率為評(píng)定指標(biāo),考察殼聚糖濃度對(duì)微膠囊包埋率的影響。

    1.3.4.4 固化時(shí)間對(duì)微膠囊包埋率的影響

    在殼聚糖濃度0.8%,海藻酸鈉濃度2%,CaCl2濃度 0.3 mol/L,固化時(shí)間為 1、2、3、4、5 h 的條件下,按照1.3.3的方法制備植物乳桿菌微膠囊,以微膠囊包埋率為評(píng)定指標(biāo),考察固化時(shí)間對(duì)微膠囊包埋率的影響。

    1.3.5 正交試驗(yàn)

    在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以海藻酸鈉濃度、CaCl2濃度、殼聚糖濃度及固化時(shí)間4個(gè)因子為自變量,以包埋率為評(píng)價(jià)指標(biāo),正交試驗(yàn)優(yōu)化制備微膠囊因素水平見表1。

    表1 正交試驗(yàn)優(yōu)化制備微膠囊因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design for optimizing the preparation conditions of microcapsules

    1.3.6 合生元微膠囊的制備

    參照1.3.3的方法制備微膠囊,將菌泥沉淀分別與不同質(zhì)量比的益生元(IL與PP質(zhì)量比分別為0∶5、2∶3、1∶1、3∶2、5∶0)混合均勻,再與 2%海藻酸鈉溶液混合攪拌均勻。將海藻酸鈉混合液勻速滴入100 mL含有殼聚糖(0.8%)-CaCl2(0.3 mol/L)溶液中形成濕態(tài)微膠囊,攪拌后置于4℃冰箱靜置固化3 h。用0.9%滅菌生理鹽水充分沖洗微膠囊表面,洗去表面浮菌,將其與凍干保護(hù)劑混合均勻后,在-20℃冰箱預(yù)凍24 h,壓力1.0 MPa,冷凍干燥24 h得到植物乳桿菌微膠囊顆粒。

    1.3.7 微膠囊粒徑的測(cè)定

    用游標(biāo)卡尺隨機(jī)取不同質(zhì)量比益生元的合生元微膠囊若干,取平均值得到合生元微膠囊的粒徑分布情況。

    1.3.8 微膠囊包埋率以及存活率的測(cè)定

    以海藻酸鈉為壁材的微膠囊可以于檸檬酸鈉溶液中輕微振蕩實(shí)現(xiàn)崩解[27]。取1 g不同質(zhì)量比益生元的合生元微膠囊置于9 mL 3%檸檬酸鈉溶液中進(jìn)行裂解,溶液置于37℃水浴恒溫振蕩器,在180 r/min條件下?lián)u勻60 min。裂解后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),計(jì)算公式如下。

    式中:N為微膠囊包埋的活菌數(shù),cfu/mL;N1為包埋前添加的活菌數(shù),cfu/mL。

    不同質(zhì)量比益生元的凍干合生元微膠囊,用檸檬酸鈉溶液進(jìn)行裂解處理,利用活菌計(jì)數(shù)計(jì)算微膠囊中植物乳桿菌的存活率和活菌率。存活率的計(jì)算公式如下。

    式中:S為凍干后合生元微膠囊的活菌數(shù),cfu/mL;S0為凍干前的微膠囊的植物乳桿菌活菌數(shù),cfu/mL。

    活菌率的計(jì)算公式如下。

    式中:N2為凍干后微膠囊中的活菌數(shù),cfu/mL;V為裂解液的體積,mL;M為微膠囊的質(zhì)量,g。

    1.3.9 體外模擬腸胃液消化

    1.3.9.1 模擬胃液的配制

    胃液按照Amakiri等[28]的方法進(jìn)行優(yōu)化制備。準(zhǔn)確移取1 mol/L稀鹽酸1.64 mL加入至90 mL無菌水中,攪拌均勻后再向其中加入1.00 g胃蛋白酶,充分?jǐn)嚢杈鶆?,最后用無菌水定容至100 mL,放入4℃冰箱備用。

    1.3.9.2 模擬腸液的配制

    腸液按照Amakiri等[28]的方法進(jìn)行優(yōu)化制備。準(zhǔn)確稱取磷酸二氫鉀0.68 g于50 mL的無菌水中,攪拌至充分溶解,用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至6.8;另準(zhǔn)確稱取胰蛋白酶1.00 g于30 mL無菌水中,攪拌至充分溶解;將上述兩種液體混合后加無菌水定容至100 mL,放入4℃冰箱備用。

    1.3.9.3 連續(xù)胃腸液消化實(shí)驗(yàn)

    對(duì)照組:取1 mL植物乳桿菌菌液加入9 mL胃液中,180 r/min振蕩處理2 h后,吸取混合液100 μL,適當(dāng)稀釋后涂板計(jì)數(shù)。將模擬胃液處理后的混合液4 000 r/min離心15 min,收集菌體。將菌體加入9 mL腸液中,180 r/min振蕩處理2h后,吸取混合液100 μL,適當(dāng)稀釋后涂板計(jì)數(shù)。

    實(shí)驗(yàn)組:分別取1 g各質(zhì)量比微膠囊顆粒加入到9 mL胃液中,充分搖勻混合后置于37℃搖床(180 r/min),充分搖勻2 h。將混合均勻的菌液進(jìn)行梯度稀釋,然后取最佳梯度稀釋濃度100 μL的菌液進(jìn)行涂布計(jì)數(shù)。將胃液處理后收集的微膠囊加入9 mL腸液中,180 r/min振蕩處理2 h,搖勻后涂板計(jì)數(shù)。

    1.3.9.4 腸胃液分別釋放實(shí)驗(yàn)

    取1mL植物乳桿菌菌液、1g未添加益生元的植物乳桿菌微膠囊和5種不同質(zhì)量比益生元的合生元微膠囊顆粒分別加入至9 mL胃液和9 mL腸液中,充分搖勻混合后置于37℃搖床(180 r/min),充分搖勻2 h。將混合均勻的菌液先進(jìn)行梯度稀釋,然后在合適濃度梯度下進(jìn)行涂布計(jì)數(shù)。

    腸胃液消化實(shí)驗(yàn)前對(duì)微膠囊進(jìn)行裂解處理計(jì)數(shù),調(diào)整菌液濃度,保證菌液和微膠囊的初始菌濃度在同一數(shù)量級(jí)。

    1.3.10 儲(chǔ)存穩(wěn)定性

    將冷凍干燥后不同質(zhì)量比益生元的合生元微膠囊放置于若干玻璃小瓶中,將其分別置于-20、4、25℃保藏63 d。每隔7 d取出1 g凍干微膠囊顆粒進(jìn)行活菌數(shù)測(cè)定,檢測(cè)不同質(zhì)量比益生元的微膠囊貯存穩(wěn)定性。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    所有數(shù)據(jù)均為3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果,均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,利用Excel和SPSS 22.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,P<0.05時(shí)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 植物乳桿菌生長曲線結(jié)果與分析

    測(cè)定植物乳桿菌的生長曲線對(duì)植物乳桿菌的培養(yǎng)研究具有重要的意義。一方面,它可以反映出試驗(yàn)中所采用的菌種在液體培養(yǎng)基中的生長和繁殖能力;另一方面,根據(jù)生長曲線可以判斷出達(dá)到最多活菌數(shù)的時(shí)間,以實(shí)現(xiàn)效益最大化,還可以指導(dǎo)試驗(yàn)進(jìn)度,對(duì)整個(gè)工藝進(jìn)行優(yōu)化[29]。添加不同質(zhì)量比益生元(IL∶PP)的植物乳桿菌的生長曲線見圖1。

    圖1 添加不同質(zhì)量比益生元(IL∶PP)的植物乳桿菌生長曲線Fig.1 Growth curve of Lactobacillus plantarum with prebiotics of different mass ratios(IL ∶PP)

    由圖1可知,植物乳桿菌在MRS培養(yǎng)基中,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,OD值不斷增加。OD值反映了發(fā)酵液中的菌群數(shù)量,變化率反映了菌群的生長速度[30]。培養(yǎng)18 h后進(jìn)入穩(wěn)定期,此時(shí)OD值最高,代表著最大生物量。配養(yǎng)16 h時(shí)生物量最大,為最佳發(fā)酵點(diǎn),因此選擇16 h~20 h內(nèi)的發(fā)酵液進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。并且通過對(duì)比發(fā)現(xiàn),IL與PP質(zhì)量比為2∶3的OD值最大可達(dá)到1.175 2,高于不添加益生元的最大值1.140 1,且添加不同質(zhì)量比益生元的植物乳桿菌OD值整體高于未添加益生元的OD值,即添加益生元對(duì)植物乳桿菌有協(xié)同生長的作用,其中IL與PP質(zhì)量比為2∶3時(shí)OD值和變化率最大,即增殖效果最佳。

    2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

    各因素對(duì)微膠囊包埋率的影響見圖2。

    圖2 單因素對(duì)微膠囊包埋率的影響Fig.2 Influences of single factors on microcapsule embedding rate

    由圖2a可知,當(dāng)海藻酸鈉濃度小于2.0%時(shí),植物乳桿菌微膠囊的包埋率隨著海藻酸鈉濃度的升高而升高;當(dāng)海藻酸鈉濃度為2.0%時(shí),微膠囊的包埋率達(dá)到最大,為80.3%;海藻酸鈉濃度繼續(xù)增大時(shí),包埋率降低,可能是海藻酸鈉菌液混合液黏度增大使植物乳桿菌混合不均所致[31]。

    由圖2b可知,當(dāng)CaCl2濃度小于0.3 mol/L時(shí),植物乳桿菌合生元微膠囊的包埋率隨著CaCl2濃度的增加而增大;當(dāng)CaCl2濃度為0.3 mol/L時(shí),合生元微膠囊的包埋率達(dá)到最大;隨著CaCl2濃度繼續(xù)增大時(shí),包埋率反而降低。這可能是由于CaCl2濃度增大,使Ca2+濃度增大,無法提供給Ca2+更多的結(jié)合位點(diǎn)[32],難以繼續(xù)包埋植物乳桿菌,導(dǎo)致包埋率下降。

    由圖2c可知,當(dāng)殼聚糖濃度達(dá)到0.8%時(shí),植物乳桿菌微膠囊的包埋率最大;當(dāng)殼聚糖濃度小于0.8%時(shí),隨著殼聚糖濃度的增加,殼聚糖與海藻酸鈉結(jié)合愈加緊密,減少了植物乳桿菌的擴(kuò)散,降低菌體損失,使得包埋率增加;當(dāng)殼聚糖濃度大于0.8%時(shí),植物乳桿菌微膠囊的包埋率略微降低,但降低不明顯,原因可能是殼聚糖濃度的增加減少了包埋過程中的菌體損失。

    由圖2d可知,植物乳桿菌微膠囊的包埋率整體隨著固化時(shí)間的延長,包埋率增加。當(dāng)達(dá)到3 h時(shí),微膠囊的包埋率最大,此后隨著時(shí)間的延長,包埋率有所下降,可能是因?yàn)楣袒瘯r(shí)間較長導(dǎo)致植物乳桿菌微膠囊出現(xiàn)菌液滲透的情況,致使微膠囊內(nèi)活菌數(shù)下降,包埋率有所降低。因此,綜合時(shí)間以及節(jié)約成本,選擇海藻酸鈉濃度2%、CaCl2濃度0.3 mol/L、殼聚糖濃度0.8%、固化時(shí)間3 h作為后續(xù)試驗(yàn)條件。

    2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

    以單因素試驗(yàn)中獲得的微膠囊最佳制備條件進(jìn)行正交試驗(yàn),采用四因素三水平正交分析法探究海藻酸鈉濃度、殼聚糖濃度、CaCl2濃度、固化時(shí)間對(duì)植物乳桿菌微膠囊包埋效果的影響,以確定最終微膠囊制備條件,結(jié)果如表2所示。

    表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

    由表2可知,極差R的大小順序?yàn)锳>C>D>B,即海藻酸鈉濃度對(duì)微膠囊包埋率的影響最大,K1、K2、K3中數(shù)值最大的為相應(yīng)水平的最優(yōu)解,因此A2B2C2D2組合為最佳制備條件,經(jīng)驗(yàn)證該條件下包埋率達(dá)到(80.44±0.10)%,明顯高于其他組合。因此,選擇A2B2C2D2組合進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn),以包埋率為評(píng)價(jià)指標(biāo),最佳的工藝參數(shù)為海藻酸鈉濃度2%、CaCl2濃度0.3 mol/L、殼聚糖濃度0.8%、固化時(shí)間3 h。

    2.4 合生元微膠囊的粒徑分布

    合生元微膠囊的粒徑分布情況見圖3。

    圖3 不同質(zhì)量比益生元的微膠囊粒徑分布Fig.3 Size distribution of microcapsules of prebiotics with different mass ratios

    由圖3可知,不同質(zhì)量比益生元對(duì)微膠囊的粒徑分布也有一定影響,IL與PP質(zhì)量比為5∶0時(shí),微膠囊粒徑均值1.583 3 mm;IL與PP質(zhì)量比為3∶2時(shí),微膠囊粒徑均值1.613 3 mm;IL與PP質(zhì)量比為1∶1時(shí),微膠囊粒徑均值1.723 3 mm;IL與PP質(zhì)量比為2∶3時(shí),微膠囊粒徑均值1.893 3 mm;IL與PP質(zhì)量比為0∶5時(shí),微膠囊粒徑均值2.163 3 mm。可以看出,微膠囊粒徑隨著黃精多糖含量的增加而增加,IL與PP質(zhì)量比為0∶5時(shí),微膠囊粒徑最大,可能是由于黃精多糖含量增加,其微粒直徑相較于菊粉較大,導(dǎo)致微膠囊粒徑有所增加。

    2.5 合生元微膠囊包埋率的測(cè)定

    包埋率是評(píng)價(jià)微膠囊非常重要的一個(gè)試驗(yàn)指標(biāo),它反映了制備過程中壁材對(duì)芯材的包埋情況。包埋率越高,說明益生菌與外界環(huán)境接觸越少,對(duì)益生菌的保護(hù)作用越強(qiáng)[33]。本試驗(yàn)中,IL和PP的加入有益于植物乳桿菌的包埋。在添加不同質(zhì)量比益生元的微膠囊中,其植物乳桿菌活菌率如圖4所示。

    圖4 不同質(zhì)量比益生元(IL∶PP)對(duì)植物乳桿菌合生元微膠囊包埋率的影響Fig.4 Effect of prebiotics with different mass ratios(IL∶PP)on the encapsulation rate of Lactobacillus plantarum synbiotics microcapsules

    由圖4可知,微膠囊包埋率分別為80.44%(未添加)、81.37%(5 ∶0)、86.83%(3 ∶2)、86.18%(1 ∶1)、92.61%(2∶3)、89.39%(0∶5),可見微膠囊對(duì)合生元具有很好的包埋效果,且在IL與PP質(zhì)量比為2∶3時(shí),包埋率最高,為92.61%,微膠囊顏色呈淺黃棕色。

    2.6 凍干微膠囊的活菌率以及植物乳桿菌的存活率

    冷凍干燥是一種用來延長益生菌制品保質(zhì)期的方法,作為傳統(tǒng)干燥方法的一種有效替代,其涉及不加熱的脫水過程,使收縮范圍變小,有助于降低敏感性和保存生物活性材料[34]。益生菌在凍干過程中存活率會(huì)下降。冰晶的形成、膜的破壞、細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)的高滲透性、細(xì)胞內(nèi)大分子的變性和水的去除是凍干過程中益生菌生存能力喪失的重要原因[35]。不同質(zhì)量比益生元對(duì)微膠囊活菌率的影響見表3。

    表3 不同質(zhì)量比益生元(IL∶PP)對(duì)微膠囊活菌率的影響Table 3 Effect of prebiotics(IL ∶PP)with different mass ratios on the viability of microcapsules

    由表3可知,經(jīng)濃縮后的原菌液活菌數(shù)為1.76×1010cfu/mL,添加益生元的微膠囊的活菌率均高于未添加,可能是益生元的益生作用提高了植物乳桿菌的存活率。植物乳桿菌可以利用IL和PP,先將其分解為果糖,然后在細(xì)胞內(nèi)對(duì)其進(jìn)行利用。同時(shí),IL酶與植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的水解酶,專門作用于IL的β-2,1鍵,產(chǎn)生果糖或低聚果糖,由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)更容易代謝從而促進(jìn)了植物乳桿菌的生長;提取PP時(shí),所得的較多單糖成分也為植物乳桿菌的生長代謝提供了原料,因此含有益生元的微膠囊活菌率較高。

    不同質(zhì)量比益生元的合生元微膠囊對(duì)植物乳桿菌存活率的影響見圖5。

    圖5 不同質(zhì)量比益生元(IL∶PP)合生元微膠囊對(duì)植物乳桿菌存活率的影響Fig.5 Effect of prebiotic(IL ∶PP)synbiotic microcapsules with different mass ratios on the survival rate of Lactobacillus plantarum

    由圖5可以看出,不同質(zhì)量比益生元在冷凍干燥過程中具有保護(hù)效果。添加益生元的微膠囊相較于未添加的微膠囊,植物乳桿菌的存活率顯著提高(P<0.05),其中IL與PP質(zhì)量比為2∶3時(shí),存活率最高,達(dá)到81.44%,僅使用擠壓法制備的未添加益生元的微膠囊存活率相對(duì)較低。Jouki等[36]研究發(fā)現(xiàn),添加益生元的微膠囊可以提高植物乳桿菌在微膠囊中的存活率,使微膠囊的耐受凍干能力增強(qiáng),與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

    2.7 合生元微膠囊體外消化性質(zhì)

    2.7.1 合生元微膠囊在腸胃液中的穩(wěn)定性

    植物乳桿菌作為益生菌,必須在胃環(huán)境中存活下來,并以足夠多的數(shù)量(需在106cfu/mL以上)到達(dá)結(jié)腸以促進(jìn)定植[37]。植物乳桿菌合生元微膠囊腸胃液連續(xù)作用釋放結(jié)果見表4。

    表4 植物乳桿菌合生元微膠囊腸胃液連續(xù)作用釋放結(jié)果Table 4 Release of Lactobacillus plantarum in synbiotic microcapsules in simulated gastrointestinal fluid lg(cfu/mL)

    由表4可知,當(dāng)植物乳桿菌進(jìn)入胃液后,由于胃液的強(qiáng)酸特性,使植物乳桿菌數(shù)目大幅度下降,從8.67 lg(cfu/mL)下降至 2.13 lg(cfu/mL),下降了 6.54 lg(cfu/mL),而微膠囊通過胃液處理2 h后,活菌數(shù)仍能達(dá)到 7 lg(cfu/mL)以上,僅僅下降了 1 lg(cfu/mL),可以看出微膠囊對(duì)植物乳桿菌的保護(hù)作用大幅提升,耐胃液能力加強(qiáng),達(dá)到腸液后活菌數(shù)仍均保持在6 lg(cfu/mL)以上,即可以在腸道內(nèi)發(fā)揮良好的益生作用。并且通過連續(xù)模擬人工腸胃液實(shí)驗(yàn),可以發(fā)現(xiàn),IL與PP質(zhì)量比為2∶3時(shí),微膠囊的耐酸性最強(qiáng),在腸液中的釋放數(shù)目最多,植物乳桿菌的存活率也最高。

    2.7.2 合生元微膠囊在人工胃液中的釋放

    植物乳桿菌菌液/微膠囊在人工胃液中的比較見圖6。

    圖6 植物乳桿菌菌液/微膠囊在人工胃液中的比較Fig.6 Comparison on the survival rate of Lactobacillus plantarum liquid/microcapsule in simulated gastric fluid

    如圖6所示,未經(jīng)包埋的植物乳桿菌被胃液侵蝕,存活率急劇下降,120 min后菌體消耗殆盡,存活率僅24.57%,遠(yuǎn)低于包埋后的微膠囊的存活率,說明微膠囊化植物乳桿菌可以明顯提高植物乳桿菌對(duì)胃酸的耐受能力。并且,120 min后合生元微膠囊胃液的存活率均高于未添加益生元的微膠囊,可以看出復(fù)配益生元對(duì)植物乳桿菌有一定益生作用,可以提高微膠囊對(duì)酸性條件的抵抗能力;當(dāng)IL與PP質(zhì)量比為2∶3時(shí),微膠囊中植物乳桿菌的存活率最高,活菌數(shù)能達(dá)到7.43 lg(cfu/mL),存活率高達(dá) 85.8%,耐酸性更強(qiáng),有利于減少胃酸的破壞,使足夠數(shù)量的植物乳桿菌能夠到達(dá)腸道發(fā)揮作用。

    2.7.3 合生元微膠囊在人工腸液中的釋放

    植物乳桿菌微膠囊在人工腸液中的釋放見圖7。

    圖7 植物乳桿菌微膠囊在人工腸液中的釋放Fig.7 Release of Lactobacillus plantarum microcapsules in simulated intestinal fluid

    由圖7可以看出,植物乳桿菌微膠囊在腸液中前20 min釋放速度最快,60 min后釋放曲線趨于平緩,釋放速度開始減慢,120 min時(shí)腸液中的微膠囊基本裂解完全。植物乳桿菌微膠囊與合生元微膠囊釋放率相比,合生元微膠囊的釋放率更高,腸溶性較好。在IL與PP質(zhì)量比為2∶3時(shí),合生元微膠囊腸液釋放率最高,同時(shí)腸液中的植物乳桿菌也具有最高的存活率。綜上,復(fù)配益生元的微膠囊擁有更好的腸胃液耐受能力,IL與PP質(zhì)量比為2∶3時(shí),合生元微膠囊的耐酸性和腸溶性最好。

    2.8 儲(chǔ)存穩(wěn)定性分析

    為了評(píng)估合生元微膠囊的儲(chǔ)存穩(wěn)定性,將不同質(zhì)量比益生元的微膠囊分別在-20、4、25℃條件下儲(chǔ)存63 d,每7 d進(jìn)行1次活菌數(shù)測(cè)定,得到的存活率結(jié)果見圖 8~圖 10。

    圖8 合生元微膠囊在-20℃下的保藏性Fig.8 Storage stability of symbiotic microcapsules at-20℃

    圖9 合生元微膠囊在4℃下的保藏性Fig.9 Storage stability of symbiotic microcapsules at 4℃

    圖10 合生元微膠囊在25℃下的保藏性Fig.10 Storage stability of symbiotic microcapsules at 25℃

    由圖8~圖10可知,合生元微膠囊在-20℃時(shí)表現(xiàn)出最佳的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長,微膠囊的活菌數(shù)均有所下降,可能是由于營養(yǎng)底物的消耗和代謝過程中產(chǎn)生的化合物(酸、細(xì)菌素)的存在。在-20℃和4℃時(shí),微膠囊存活率下降相較于25℃明顯減少,可以看出低溫有利于活菌微膠囊的保藏。合生元微膠囊在室溫(25℃)下儲(chǔ)存21 d后植物乳桿菌存活率明顯下降,這可能是由于膠囊壁材的水活性,導(dǎo)致微膠囊內(nèi)植物乳桿菌代謝增加,周圍儲(chǔ)存環(huán)境變差,儲(chǔ)存穩(wěn)定性降低。同時(shí)可以看出,益生元的益生作用使添加益生元的微膠囊存活率明顯高于未添加,在IL與PP質(zhì)量比為2∶3時(shí),微膠囊的存活率最高,并且可以在低溫下保持相對(duì)穩(wěn)定。因此選擇-20℃對(duì)IL與PP質(zhì)量比為2∶3的合生元微膠囊進(jìn)行保藏。

    3 結(jié)論

    植物乳桿菌對(duì)酸性條件敏感,在腸胃液中生存能力低。本試驗(yàn)以海藻酸鈉和殼聚糖為壁材,使用擠壓法對(duì)不同質(zhì)量比益生元(IL∶PP)和植物乳桿菌一同進(jìn)行包埋,制備了合生元植物乳桿菌微膠囊,來提高植物乳桿菌的腸胃液耐受能力,并通過正交試驗(yàn)確定了制備微膠囊的最佳工藝,最終選取質(zhì)量比2∶3(IL∶PP)作為制備合生元微膠囊的最優(yōu)益生元質(zhì)量比。試驗(yàn)結(jié)果表明,益生元對(duì)植物乳桿菌具有益生作用,OD值增加,其生物量和基質(zhì)消耗量明顯增加;在連續(xù)性腸胃液實(shí)驗(yàn)和腸胃液分別釋放實(shí)驗(yàn)中可以看出,微膠囊明顯降低了胃酸對(duì)植物乳桿菌的侵害作用,包埋后的微膠囊在胃酸中60 min內(nèi)幾乎可以崩解完全,并且在腸液仍能保持較高的存活率;合生元微膠囊在腸胃液中呈現(xiàn)出良好的耐酸性和腸溶性,有利于植物乳桿菌在腸道中的定植;低溫有利于微膠囊的儲(chǔ)存,其貯藏穩(wěn)定性明顯高于常溫貯藏,結(jié)果表明-20℃貯藏效果最佳。

    本文探討了合生元微膠囊制備工藝及最優(yōu)益生元質(zhì)量比,所制備的合生元微膠囊具備良好的釋放性能和存活率,在新型益生菌功能食品的開發(fā)研究中有良好的應(yīng)用前景,有望為促進(jìn)腸道益生菌的靶向釋放提供一種新的參考。

    猜你喜歡
    合生元微膠囊海藻
    海藻保鮮膜:來自海洋的天然“塑料”
    軍事文摘(2023年18期)2023-10-31 08:10:50
    海藻球
    海藻與巖石之間
    歐盟:海藻酸、海藻酸鹽作為食品添加劑無安全風(fēng)險(xiǎn)
    天潤乳業(yè)、合生元、伊利、三元等2015年報(bào)披露
    奶粉賣不動(dòng)合生元急攻保健品
    聚砜包覆雙環(huán)戊二烯微膠囊的制備
    中國塑料(2015年9期)2015-10-14 01:12:21
    一種用于橡膠材料自修復(fù)的微膠囊的制備方法
    益生元、益生菌及合生元對(duì)感染腸炎沙門氏菌蛋雞與肉雞的治療效果
    飼料博覽(2015年4期)2015-04-05 10:34:14
    微膠囊自修復(fù)聚合物材料的發(fā)展
    中國塑料(2014年3期)2014-10-27 08:26:48
    操美女的视频在线观看| av视频免费观看在线观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 狂野欧美激情性xxxx| 国产黄色免费在线视频| 久热这里只有精品99| 亚洲五月色婷婷综合| xxxhd国产人妻xxx| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 午夜免费男女啪啪视频观看| 青春草国产在线视频| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 久久久久视频综合| 伦理电影大哥的女人| 少妇人妻精品综合一区二区| √禁漫天堂资源中文www| 最近最新中文字幕大全免费视频 | www日本在线高清视频| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲国产成人一精品久久久| 欧美中文综合在线视频| 国产伦人伦偷精品视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 97精品久久久久久久久久精品| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲精品一二三| 亚洲精品日本国产第一区| 亚洲伊人久久精品综合| 国产成人精品久久久久久| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久久久久网色| 国产人伦9x9x在线观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 中文天堂在线官网| 欧美日韩亚洲高清精品| 日本av手机在线免费观看| 国产97色在线日韩免费| 日韩一本色道免费dvd| 日本黄色日本黄色录像| 精品亚洲成a人片在线观看| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 多毛熟女@视频| 精品国产乱码久久久久久小说| 看免费成人av毛片| 伊人久久国产一区二区| 久久人人爽人人片av| 9色porny在线观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 最新的欧美精品一区二区| 亚洲av电影在线进入| 国产成人午夜福利电影在线观看| 蜜桃国产av成人99| 国产精品熟女久久久久浪| 夫妻午夜视频| 国产极品天堂在线| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 国产人伦9x9x在线观看| 亚洲av男天堂| 一区在线观看完整版| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产男女超爽视频在线观看| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲国产精品国产精品| 五月天丁香电影| 欧美乱码精品一区二区三区| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 黑人猛操日本美女一级片| 日韩精品有码人妻一区| 日韩av不卡免费在线播放| 久久精品人人爽人人爽视色| 丝瓜视频免费看黄片| 国产高清国产精品国产三级| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产有黄有色有爽视频| 日本黄色日本黄色录像| 国产伦理片在线播放av一区| 久久人人97超碰香蕉20202| 热99国产精品久久久久久7| 9191精品国产免费久久| 午夜久久久在线观看| 色吧在线观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 亚洲中文av在线| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产一级毛片在线| 在线 av 中文字幕| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲国产中文字幕在线视频| 女人精品久久久久毛片| 久久久久视频综合| 女人精品久久久久毛片| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 街头女战士在线观看网站| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲中文av在线| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产一区有黄有色的免费视频| 韩国精品一区二区三区| 欧美亚洲日本最大视频资源| 久久人人爽人人片av| 91精品伊人久久大香线蕉| 我的亚洲天堂| 亚洲国产欧美在线一区| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲第一青青草原| 日韩一区二区视频免费看| 国产又爽黄色视频| 新久久久久国产一级毛片| 超碰97精品在线观看| 欧美日韩精品网址| 久久国产亚洲av麻豆专区| 男女国产视频网站| 大片电影免费在线观看免费| 午夜久久久在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲av日韩在线播放| 制服丝袜香蕉在线| av.在线天堂| 国产福利在线免费观看视频| 国产成人精品无人区| 亚洲少妇的诱惑av| 纯流量卡能插随身wifi吗| 18禁观看日本| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 少妇被粗大猛烈的视频| 久久久久精品久久久久真实原创| 视频区图区小说| 色婷婷av一区二区三区视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 少妇人妻久久综合中文| 色视频在线一区二区三区| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 天美传媒精品一区二区| 免费av中文字幕在线| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲av电影在线进入| 男女之事视频高清在线观看 | 日本欧美视频一区| 国产精品久久久人人做人人爽| 夫妻性生交免费视频一级片| 青草久久国产| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 狂野欧美激情性xxxx| 爱豆传媒免费全集在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 日本色播在线视频| 日本av免费视频播放| 在线观看三级黄色| 99久久精品国产亚洲精品| 高清av免费在线| 欧美久久黑人一区二区| 美国免费a级毛片| 晚上一个人看的免费电影| 国产精品一区二区精品视频观看| 男人爽女人下面视频在线观看| 麻豆乱淫一区二区| av在线老鸭窝| 不卡视频在线观看欧美| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 69精品国产乱码久久久| www.精华液| 欧美乱码精品一区二区三区| 久久久精品区二区三区| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 久久久久久久大尺度免费视频| 伊人久久国产一区二区| 伊人久久国产一区二区| 青春草视频在线免费观看| 欧美黑人精品巨大| 国产成人一区二区在线| 欧美黄色片欧美黄色片| 深夜精品福利| 捣出白浆h1v1| 欧美激情极品国产一区二区三区| 女性生殖器流出的白浆| 久久久国产精品麻豆| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 黑丝袜美女国产一区| 人体艺术视频欧美日本| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产精品成人在线| av福利片在线| 欧美国产精品一级二级三级| 高清不卡的av网站| 九色亚洲精品在线播放| 自线自在国产av| 美女午夜性视频免费| 久久毛片免费看一区二区三区| 99国产精品免费福利视频| 国产精品一区二区在线观看99| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 成年美女黄网站色视频大全免费| 操出白浆在线播放| 99久久精品国产亚洲精品| 国产高清国产精品国产三级| 一级毛片我不卡| 丝瓜视频免费看黄片| 国产在线视频一区二区| 成人手机av| 搡老乐熟女国产| 久久韩国三级中文字幕| 日韩成人av中文字幕在线观看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 一个人免费看片子| av有码第一页| 精品免费久久久久久久清纯 | 久久久久久久久免费视频了| av国产精品久久久久影院| 日韩欧美精品免费久久| 丝袜脚勾引网站| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲美女搞黄在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久久久欧美国产精品| 国产精品.久久久| 男女下面插进去视频免费观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲成国产人片在线观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 国产黄频视频在线观看| 成人国产麻豆网| 国产一区二区在线观看av| av网站在线播放免费| 国精品久久久久久国模美| 日韩 亚洲 欧美在线| 久久久久久人妻| 18禁国产床啪视频网站| 性高湖久久久久久久久免费观看| 国产成人精品无人区| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产精品免费大片| 99九九在线精品视频| 日韩一区二区三区影片| 波多野结衣av一区二区av| 成年人免费黄色播放视频| 国产精品 国内视频| 制服诱惑二区| xxx大片免费视频| 国产99久久九九免费精品| 黄色视频在线播放观看不卡| 2021少妇久久久久久久久久久| 亚洲精品国产区一区二| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 久久国产精品大桥未久av| 亚洲美女视频黄频| 午夜日韩欧美国产| 伊人久久国产一区二区| 啦啦啦 在线观看视频| 欧美日韩一级在线毛片| av国产精品久久久久影院| 久热爱精品视频在线9| 国产日韩欧美在线精品| 大香蕉久久网| 亚洲熟女精品中文字幕| 在线观看免费高清a一片| 9热在线视频观看99| 18禁观看日本| 亚洲视频免费观看视频| 99国产综合亚洲精品| 麻豆av在线久日| e午夜精品久久久久久久| 成人影院久久| 色播在线永久视频| 亚洲三区欧美一区| 久久久精品免费免费高清| www.av在线官网国产| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 亚洲精品成人av观看孕妇| 91成人精品电影| 最近中文字幕2019免费版| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲图色成人| 免费高清在线观看日韩| 亚洲欧洲国产日韩| 在线观看免费高清a一片| 亚洲专区中文字幕在线 | 一级,二级,三级黄色视频| 久久性视频一级片| xxx大片免费视频| 午夜福利视频精品| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产免费又黄又爽又色| 美女高潮到喷水免费观看| 久久久亚洲精品成人影院| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲情色 制服丝袜| a级毛片黄视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 男人添女人高潮全过程视频| 看免费成人av毛片| 亚洲一区二区三区欧美精品| 丝袜人妻中文字幕| 一区二区av电影网| 国产亚洲最大av| 色婷婷久久久亚洲欧美| 日本91视频免费播放| 国产欧美亚洲国产| 国产极品粉嫩免费观看在线| 男男h啪啪无遮挡| 婷婷成人精品国产| 两个人免费观看高清视频| 精品福利永久在线观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 两个人看的免费小视频| av女优亚洲男人天堂| 亚洲国产成人一精品久久久| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产精品一区二区在线观看99| 午夜av观看不卡| 国产1区2区3区精品| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 欧美精品av麻豆av| 性色av一级| 美女高潮到喷水免费观看| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 99九九在线精品视频| 日本91视频免费播放| 男的添女的下面高潮视频| 国产成人免费观看mmmm| a 毛片基地| 美女中出高潮动态图| 制服丝袜香蕉在线| 狂野欧美激情性xxxx| 日韩免费高清中文字幕av| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 日本黄色日本黄色录像| 国产精品无大码| 中国国产av一级| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 午夜福利乱码中文字幕| 高清黄色对白视频在线免费看| 成人国语在线视频| 好男人视频免费观看在线| 亚洲精品国产av蜜桃| 捣出白浆h1v1| 国产熟女午夜一区二区三区| 午夜免费鲁丝| 韩国高清视频一区二区三区| 免费看不卡的av| 亚洲人成电影观看| 久久影院123| 韩国高清视频一区二区三区| 国产不卡av网站在线观看| 精品福利永久在线观看| 成人三级做爰电影| 五月天丁香电影| 欧美在线黄色| 亚洲一码二码三码区别大吗| 日韩中文字幕视频在线看片| 婷婷色综合www| 十八禁高潮呻吟视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 欧美在线黄色| 最新的欧美精品一区二区| 久久久精品94久久精品| av不卡在线播放| 国产在线一区二区三区精| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲国产av影院在线观看| 人妻人人澡人人爽人人| 午夜影院在线不卡| 啦啦啦 在线观看视频| e午夜精品久久久久久久| 99久国产av精品国产电影| 在线观看一区二区三区激情| 久久久久久久久久久久大奶| 中国国产av一级| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产欧美亚洲国产| 欧美精品一区二区免费开放| 丝袜美足系列| 涩涩av久久男人的天堂| 高清视频免费观看一区二区| 色精品久久人妻99蜜桃| 男女国产视频网站| 曰老女人黄片| 久久毛片免费看一区二区三区| 亚洲美女黄色视频免费看| 国产成人a∨麻豆精品| 老熟女久久久| 在线看a的网站| 天美传媒精品一区二区| 亚洲专区中文字幕在线 | 国产视频首页在线观看| 免费看av在线观看网站| 久久鲁丝午夜福利片| 一级毛片 在线播放| 水蜜桃什么品种好| 人妻一区二区av| 99香蕉大伊视频| 色播在线永久视频| 久久狼人影院| 91国产中文字幕| 一区二区三区乱码不卡18| 嫩草影视91久久| 免费观看av网站的网址| 久久久久精品国产欧美久久久 | 日本黄色日本黄色录像| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产亚洲一区二区精品| 国产av精品麻豆| 免费av中文字幕在线| 国产在线一区二区三区精| 午夜日本视频在线| 热re99久久国产66热| 另类亚洲欧美激情| 七月丁香在线播放| 老汉色∧v一级毛片| 丝袜美腿诱惑在线| 91老司机精品| 精品亚洲成国产av| 制服丝袜香蕉在线| 成人影院久久| 欧美 日韩 精品 国产| 欧美日本中文国产一区发布| 免费不卡黄色视频| 五月天丁香电影| 亚洲,欧美精品.| 精品久久久久久电影网| 欧美国产精品va在线观看不卡| 两个人免费观看高清视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 美女午夜性视频免费| 十八禁人妻一区二区| 高清不卡的av网站| 精品人妻一区二区三区麻豆| 久久久久久久久久久久大奶| 我的亚洲天堂| 国产精品久久久av美女十八| 男女边摸边吃奶| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 天天影视国产精品| 国产精品无大码| 中文字幕精品免费在线观看视频| 国产av一区二区精品久久| av免费观看日本| av不卡在线播放| 久久毛片免费看一区二区三区| 男女边摸边吃奶| 久久午夜综合久久蜜桃| 男人舔女人的私密视频| 免费观看av网站的网址| 中文字幕最新亚洲高清| www.自偷自拍.com| 久久久亚洲精品成人影院| 久久青草综合色| 黑人猛操日本美女一级片| 久热爱精品视频在线9| av有码第一页| 亚洲精品国产一区二区精华液| 久久久精品区二区三区| 人体艺术视频欧美日本| 中文字幕最新亚洲高清| av在线app专区| 视频在线观看一区二区三区| 在线观看免费高清a一片| 国产淫语在线视频| 观看av在线不卡| 女性被躁到高潮视频| 亚洲精品美女久久av网站| 精品久久蜜臀av无| 婷婷色av中文字幕| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 9色porny在线观看| 日本91视频免费播放| 国产精品成人在线| 婷婷色综合www| 亚洲在久久综合| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲av日韩在线播放| av国产精品久久久久影院| 免费看不卡的av| 国产精品欧美亚洲77777| 男人添女人高潮全过程视频| 一本色道久久久久久精品综合| 亚洲av综合色区一区| 男女免费视频国产| 一区二区三区四区激情视频| 成年动漫av网址| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产精品一区二区精品视频观看| 90打野战视频偷拍视频| svipshipincom国产片| 99久久人妻综合| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 人妻人人澡人人爽人人| 免费在线观看完整版高清| 777米奇影视久久| 亚洲美女搞黄在线观看| 婷婷色麻豆天堂久久| 精品久久久精品久久久| 欧美黑人欧美精品刺激| 久久久国产一区二区| 亚洲美女搞黄在线观看| 只有这里有精品99| 热99国产精品久久久久久7| 五月开心婷婷网| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产成人午夜福利电影在线观看| 久久久久视频综合| 老熟女久久久| 99精品久久久久人妻精品| 国产日韩欧美视频二区| 久久精品国产亚洲av高清一级| 亚洲精品国产av成人精品| 大香蕉久久网| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲人成网站在线观看播放| 2018国产大陆天天弄谢| 国产精品久久久av美女十八| 精品国产一区二区久久| 999精品在线视频| 国产黄色免费在线视频| 曰老女人黄片| av.在线天堂| 丝袜美足系列| 亚洲精品美女久久av网站| 制服人妻中文乱码| 欧美97在线视频| 色吧在线观看| 十八禁高潮呻吟视频| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 日韩欧美精品免费久久| 国产欧美亚洲国产| 日韩成人av中文字幕在线观看| 赤兔流量卡办理| 成人三级做爰电影| 午夜福利视频在线观看免费| 少妇人妻 视频| 国产精品蜜桃在线观看| 国产精品成人在线| 亚洲精品第二区| 日韩av在线免费看完整版不卡| 黄色视频在线播放观看不卡| 天天操日日干夜夜撸| 超碰成人久久| 99精国产麻豆久久婷婷| 中文字幕av电影在线播放| 男女床上黄色一级片免费看| 国产人伦9x9x在线观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 啦啦啦在线观看免费高清www| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲美女搞黄在线观看| 人人妻人人澡人人看| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 日本色播在线视频| 男人舔女人的私密视频| 亚洲免费av在线视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产男人的电影天堂91| 亚洲国产看品久久| 亚洲欧洲日产国产| 午夜免费男女啪啪视频观看| 制服人妻中文乱码| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 天美传媒精品一区二区| 国产成人精品福利久久| 午夜日韩欧美国产| 国产av码专区亚洲av| 日本欧美国产在线视频| 人成视频在线观看免费观看| a级毛片黄视频| 亚洲精品自拍成人| 久久精品久久久久久久性| 99香蕉大伊视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 日本vs欧美在线观看视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 少妇人妻久久综合中文| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲精品国产一区二区精华液| 欧美97在线视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 激情视频va一区二区三区| av在线观看视频网站免费| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产极品天堂在线| 国产精品国产三级国产专区5o| 婷婷色麻豆天堂久久| 青春草国产在线视频| 青草久久国产| 婷婷成人精品国产| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲精品国产av蜜桃| 一区二区av电影网| 国产乱人偷精品视频| 七月丁香在线播放| 国产精品久久久av美女十八| 一本色道久久久久久精品综合| 婷婷色av中文字幕| 高清黄色对白视频在线免费看| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产视频首页在线观看| 久热这里只有精品99| av天堂久久9| 国产精品二区激情视频| 亚洲,一卡二卡三卡|