青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒生產(chǎn)工藝優(yōu)化及成分分析

李秀萍，張葦莉，劉琨毅，黎粵悅，吳決連，李楠*

（1.宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院 五糧液技術(shù)與食品工程學(xué)院，四川 宜賓 644003；2.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；3.廣西益譜檢測(cè)技術(shù)有限公司，廣西 南寧 530007）

青錢(qián)柳（Cyclocarya paliurus），因其果實(shí)長(zhǎng)得如同一串串的銅錢(qián)，所以又稱(chēng)為金錢(qián)柳。青錢(qián)柳含有植物多糖、黃酮、多酚、萜類(lèi)、皂苷等多種活性物質(zhì)，因此青錢(qián)柳能明顯降低機(jī)體膽固醇、甘油三酯，可用于糖尿病、高血壓、高血脂等疾病的預(yù)防和治療[1-3]。青錢(qián)柳多糖具抗癌[4]和抗氧化[5]的作用。巴拉吉紅米為主要生長(zhǎng)于貴州黔東南高山梯田上的一種紅米，其含花色苷，故其顏色紅如瑪瑙。巴拉吉紅米營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，含有多酚、維生素、黃酮、γ-氨基丁酸等活性物質(zhì)[6-7]，且富含硒、鋅、鐵等微量元素[8]，所以具有抗氧化[9]、改善腦血流通[10]、預(yù)防癌癥[11]等功效。由此可見(jiàn)，青錢(qián)柳和巴拉吉紅米均具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

目前，對(duì)于青錢(qián)柳的研究主要為多糖[12-13]和黃酮[14-15]的提取與功效[16-17]，還有少量以青錢(qián)柳為原輔料進(jìn)行發(fā)酵食品的研究，如趙立春等[18-19]研制的青錢(qián)柳無(wú)糖茶凍和青錢(qián)柳雜糧代餐粉；魯青等[20]研究的青錢(qián)柳-葛根復(fù)合發(fā)酵型飲料；黃元河等[21]研究的青錢(qián)柳速溶茶等。然而，以青錢(qián)柳為原輔料釀酒，以及青錢(qián)柳經(jīng)發(fā)酵成為發(fā)酵食品后對(duì)其進(jìn)行成分分析的報(bào)道較少。本研究以巴拉吉紅米為主料，配以青錢(qián)柳為輔料，經(jīng)過(guò)浸漬、蒸煮，再添加微生物復(fù)合菌種發(fā)酵得到青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒，并初步探討發(fā)酵生產(chǎn)工藝，分析復(fù)合酒的成分，從而證明利用青錢(qián)柳復(fù)合紅米可以制備富含營(yíng)養(yǎng)成分的發(fā)酵型復(fù)合酒，以期為青錢(qián)柳的開(kāi)發(fā)利用及青錢(qián)柳發(fā)酵食品的成分分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巴拉吉紅米、青錢(qián)柳樣品：貴州雷山縣瑞康生態(tài)農(nóng)業(yè)投資有限公司；微生物復(fù)合菌種：廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)，主要由根霉、米曲霉和酵母組成。

γ-氨基丁酸（分析純）：美國(guó)SIGMA公司；葡萄糖（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蘆?。ǚ治黾儯荷锕こ躺虾Ｓ邢薰荆粴溲趸c、亞硝酸鈉（均為分析純）：西隴化工股份有限公司；苯酚、硫酸、硝酸鋁、無(wú)水乙醇、四硼酸鈉、次氯酸鈉（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（101-2-BS-Ⅱ）：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；酒精計(jì)：廣州市銘睿電子科技有限公司；分析天平（PL303）：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；雷磁pH計(jì)（PSH-3C）：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；生化培養(yǎng)箱（LRH-250A）：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；恒溫水浴鍋（TW-12）：重慶雅馬拓科技有限公司；分光光度計(jì)（uv1800）：日本株式會(huì)社島津制作所。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒生產(chǎn)工藝流程

青錢(qián)柳加水煮沸→制備青錢(qián)柳浸提液→浸提液浸泡紅米→米飯蒸煮→冷卻→接種→發(fā)酵→過(guò)濾→青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒

1.3.2 青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒生產(chǎn)工藝操作要點(diǎn)

青錢(qián)柳浸提液的制備：青錢(qián)柳葉與水料液比1∶1.5（g/mL），100℃下加熱 20 min，過(guò)濾，制成青錢(qián)柳浸提液備用。

浸泡紅米：利用制備的青錢(qián)柳浸提液浸泡紅米12 h。

米飯蒸煮：浸泡的紅米隔水蒸30 min，要求米粒完整、熟而不糊、透而不爛、疏松均勻。

冷卻：蒸煮成熟的紅米飯，攤開(kāi)冷卻，攤涼至30℃左右。

接種：按試驗(yàn)要求的接種量，稱(chēng)取微生物復(fù)合菌種，均勻撒于攤涼的米飯上，攪拌，使飯粒和菌種完全混勻。

發(fā)酵：將拌好的紅米飯移入三角瓶中，壓實(shí)不留縫隙，保鮮膜封口，橡皮筋包扎，置于生化培養(yǎng)箱中，28℃發(fā)酵至酒精度穩(wěn)定。

過(guò)濾：用小型空壓過(guò)濾機(jī)進(jìn)行膜過(guò)濾，制得青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

以酒精度為指標(biāo)，考察青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒發(fā)酵工藝中的紅米與青錢(qián)柳浸漬液料液比[1 ∶0、1 ∶0.5、1 ∶1.0、1∶1.5、1 ∶2.0（g/mL）]、微生物復(fù)合菌種接種量（0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%）、發(fā)酵溫度（26、28、30、32、34 ℃）和發(fā)酵時(shí)間（4、6、8、10、12 d）對(duì)酒精度的影響。

1.3.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以微生物復(fù)合菌種接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）、紅米與青錢(qián)柳浸漬液的料液比（D）進(jìn)行L16（44）的正交試驗(yàn)，分別測(cè)定酒精度確定青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒的最佳發(fā)酵條件。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Design of orthogonal test

1.3.5 理化指標(biāo)測(cè)定

酒精度參照GB 5009.225—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測(cè)定》中的第二法測(cè)定，再換算成20℃時(shí)樣品的酒精度；還原糖采用3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid method，DNS）法[22]測(cè)定；總酸參照GB 12456—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中總酸的測(cè)定》中的方法進(jìn)行測(cè)定；總酯采用酸堿滴定法[23]測(cè)定。

1.3.6 成分測(cè)定

植物多糖采用苯酚-硫酸法[24]測(cè)定；黃酮采用紫外分光光度法[25]測(cè)定；總酚采用福林-酚法[26]測(cè)定；γ-氨基丁酸參照文獻(xiàn)[27]測(cè)定；氨基酸參照GB 5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》，采用氨基酸分析儀測(cè)定；微量元素參照GB 5009.268—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中多元素的測(cè)定》，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductivelycoupledplasmamassspectrometry，ICP-MS）法測(cè)定。

1.3.7 安全性指標(biāo)檢測(cè)

菌落總數(shù)的測(cè)定參照GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》；大腸桿菌數(shù)參照GB 4789.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》測(cè)定；鉛、無(wú)機(jī)砷、鎘、錫參照NY/T 1885—2017《綠色食品米酒》中要求的GB 5009系列方法，采用ICP-MS法測(cè)定。黃曲霉毒素B1參照GB 5009.22—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中黃曲霉毒素B族和G族的測(cè)定》中的酶聯(lián)免疫法測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用Microsoft Office Excel 2019和origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 紅米與青錢(qián)柳浸漬液料液比對(duì)酒精度的影響

紅米與青錢(qián)柳浸漬液料液比對(duì)酒精度的影響見(jiàn)圖1。

圖1 紅米與青錢(qián)柳浸漬液料液比對(duì)酒精度的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio of red rice to C.paliurus extract on alcohol content

由圖1可知，隨著紅米與青錢(qián)柳浸漬液料液比的增加，青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒酒精度先增加后減少，當(dāng)紅米與青錢(qián)柳浸漬液的料液比為1∶1.0時(shí)，酒精度最高，為16.3%vol。當(dāng)紅米與青錢(qián)柳浸漬液料液比低于1∶1.0時(shí)，隨著青錢(qián)柳浸提液添加量的增加，浸泡和蒸煮時(shí)紅米的含水量增大，紅米中的淀粉水解和糖化增強(qiáng)，并且該作用在紅米與青錢(qián)柳浸漬液料液比為1∶1.0時(shí)達(dá)到最大；但當(dāng)紅米與青錢(qián)柳浸漬液料液比超過(guò)1∶1.0時(shí)，酒精度又明顯下降，這可能是高濃度青錢(qián)柳中的黃酮對(duì)混合微生物菌株中某種菌株生長(zhǎng)具有抑制作用，與相關(guān)報(bào)道[28]一致，青錢(qián)柳黃酮含量達(dá)到一定濃度時(shí)可以抑制霉菌或細(xì)菌的生長(zhǎng)。

2.1.2 微生物復(fù)合菌種接種量對(duì)酒精度的影響

不同微生物復(fù)合菌種接種量對(duì)酒精度的影響見(jiàn)圖2。

圖2 微生物復(fù)合菌種接種量對(duì)酒精度的影響Fig.2 Effect of inoculation amount of microbial strains on alcohol content

由圖2可知，青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒的酒精度隨著微生物復(fù)合菌種接種量的增加，呈先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，當(dāng)微生物復(fù)合菌種接種量（體積分?jǐn)?shù)）為1.2%時(shí)，酒精度最高，達(dá)到15.8%vol。隨著微生物復(fù)合菌種接種量的增加，混合菌株中相應(yīng)的霉菌和酵母菌數(shù)量均有所增加，微生物對(duì)淀粉的水解和糖化作用增強(qiáng)，從而有更多的底物被酵母菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化為酒精，使酒精度增加。但是微生物復(fù)合菌種接種量超過(guò)1.2%時(shí)，發(fā)酵液中的微生物濃度過(guò)高，需要消耗更多的底物用于維持菌種生長(zhǎng)，造成可用于酒精發(fā)酵的底物反而減少，從而導(dǎo)致酒精的生成量減少。

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)酒精度的影響

不同發(fā)酵溫度對(duì)酒精度的影響見(jiàn)圖3。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)酒精度的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcohol content

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒中酒精度呈先上升后下降的趨勢(shì)。發(fā)酵溫度為30℃時(shí)酒精度最高，為16.5%vol。當(dāng)發(fā)酵溫度較低時(shí)，微生物復(fù)合菌種中的霉菌和酵母菌不僅生長(zhǎng)受到抑制，而且用于淀粉水解、糖化和酒精發(fā)酵的酶的活性也減弱，使得底物轉(zhuǎn)化效率不高，導(dǎo)致糖化作用和酒精發(fā)酵進(jìn)行得緩慢，酒精得率低；當(dāng)發(fā)酵溫度適宜時(shí)，微生物生長(zhǎng)、發(fā)酵旺盛，酒精度高。當(dāng)發(fā)酵溫度過(guò)高，微生物菌株的生長(zhǎng)受到抑制甚至死亡，從而導(dǎo)致酒精產(chǎn)量下降。

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響

不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒精度的影響見(jiàn)圖4。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒精度的影響Fig.4 Effect of fermentation time on alcohol content

由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒的酒精度呈先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。發(fā)酵到第10天時(shí)，酒精度最高，為15.6%vol。發(fā)酵時(shí)間過(guò)短，混合微生物菌株濃度不高，有很多底物未被轉(zhuǎn)化完全，致使底物轉(zhuǎn)化率低，從而酒精得率低；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過(guò)10 d后，隨著發(fā)酵時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，酒精度不再增加而趨于平穩(wěn)，結(jié)果說(shuō)明隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)基中用于酒精發(fā)酵的原料物質(zhì)耗盡而影響酒精的增加。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L16（44）正交試驗(yàn)確定青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)，結(jié)果如表2所示。對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results

表3 正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Orthogonal test analysis of variance

由表2和3可知，影響青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒發(fā)酵的主次因素為C（發(fā)酵時(shí)間）＞B（發(fā)酵溫度）＞A（微生物復(fù)合菌種接種量）＞D（紅米與青錢(qián)柳浸漬液料液比），其中發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度對(duì)青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒酒精度有顯著影響（P＜0.05）；最佳的工藝組合為 A2B3C2D3，即微生物復(fù)合菌種接種量0.8%、發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時(shí)間10 d、紅米與青錢(qián)柳浸漬液料液比為1∶1.0（g/mL）。為了驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，按照最優(yōu)組合，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒的平均酒精度為16.3%vol，與正交試驗(yàn)中最高的第5組結(jié)果相近（相對(duì)偏差0.613%），說(shuō)明正交試驗(yàn)的可靠性。

2.3 青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒成分分析

2.3.1 理化指標(biāo)與微量元素分析

對(duì)青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒理化指標(biāo)和微量元素進(jìn)行分析可知，青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒的酒精度為16.3%vol、還原糖為9.1 g/L、總酸為6.1 g/L、總酯為0.71 g/L。此外，青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒中含有鐵、銅、鋅、錳和硒微量元素，尤其是青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒還含有0.039 mg/kg的硒元素，可認(rèn)為該復(fù)合酒為含硒食品。

2.3.2 安全性指標(biāo)

復(fù)合酒安全性指標(biāo)見(jiàn)表4。

表4 復(fù)合酒安全性指標(biāo)Table 4 Security indexes of compound wine

由表4可知，青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒菌落總數(shù)和大腸桿菌數(shù)均未檢出，微生物符合NY/T 1885—2017《綠色食品米酒》標(biāo)準(zhǔn)的要求；有毒有害物質(zhì)中，錫未檢出，黃曲霉毒素B1未檢出，鉛≤0.3 mg/kg，無(wú)機(jī)砷≤0.15 mg/kg，鎘≤0.2 mg/kg，有毒有害物質(zhì)未超標(biāo)。以上結(jié)果說(shuō)明，青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒是一種安全的發(fā)酵食品。

2.3.3 活性成分分析

活性成分分別以植物多糖、黃酮、總酚和γ-氨基丁酸作為測(cè)定指標(biāo)，利用單純紅米發(fā)酵酒和青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒進(jìn)行比對(duì)試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 復(fù)合酒活性成分分析Table 5 Functional component analysis of compound wine mg/100 g

由表5可知，添加青錢(qián)柳可以使紅米酒中4種活性成分的含量均增加，其中植物多糖含量達(dá)到573.2 mg/100g，比紅米酒增加6倍多；黃酮含量為196.3mg/100 g，增幅達(dá)到1.7倍；總酚含量為201.2 mg/100 g，比未添加青錢(qián)柳的紅米酒增加近1倍；相對(duì)于紅米酒，青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒中γ-氨基丁酸略有增加。通過(guò)試驗(yàn)證明利用青錢(qián)柳紅米復(fù)合發(fā)酵可以生產(chǎn)富含活性成分的復(fù)合酒。

2.3.4 氨基酸成分分析

復(fù)合酒氨基酸成分分析見(jiàn)表6。

表6 復(fù)合酒氨基酸成分分析Table 6 Amino acid composition analysis of compound wine

由表6可知，紅米酒和青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒中均含16種氨基酸，其中必需氨基酸均為5種，氨基酸總含量分別為3 871.6 mg/L、7 976.4 mg/L，由此可見(jiàn)添加青錢(qián)柳后，青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒中的總氨基酸得到了成倍增加，提高了青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。根據(jù)蔣瀅等[29]的報(bào)道，不同的氨基酸呈現(xiàn)不同的味覺(jué)，可將氨基酸分為甜味、苦味、酸味、鮮味氨基酸，本研究中添加青錢(qián)柳后，青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒中的每種氨基酸含量均高于紅米酒，因此添加青錢(qián)柳會(huì)使青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒的甜味、苦味、酸味、鮮味得到提升，使青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒的口感更加豐富。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)制備青錢(qián)柳浸提液，巴拉吉紅米浸泡、蒸煮，再添加微生物復(fù)合菌種進(jìn)行發(fā)酵，以微生物復(fù)合菌種接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、紅米與青錢(qián)柳浸漬液料液比為考察對(duì)象進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)，測(cè)定發(fā)酵液酒精度，確定了青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒發(fā)酵的最佳工藝為紅米與青錢(qián)柳浸漬液料液比為1∶1.0（g/mL）、微生物復(fù)合菌種接種量0.8%、發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時(shí)間10 d。在最優(yōu)條件下，得到的青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒的酒精度為16.3%vol、還原糖為9.1 g/L、總酸為6.1 g/L、總酯為0.71 g/L，含有鐵、銅、鋅、錳和硒等微量元素。經(jīng)過(guò)安全性指標(biāo)分析表明，該青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒中的微生物符合要求，有毒有害物質(zhì)未超標(biāo)。成分分析表明，青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒含植物多糖573.2 mg/100 g、黃酮196.3mg/100g、總酚 201.2mg/100g、γ-氨基丁酸 24.2mg/100 g；含有16種氨基酸，其中5種為必需氨基酸，氨基酸總含量為7 976.4 mg/L；此外還含有0.039 mg/kg的硒元素。通過(guò)試驗(yàn)證明，青錢(qián)柳復(fù)合紅米發(fā)酵生產(chǎn)的青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒是一種富含營(yíng)養(yǎng)成分的發(fā)酵食品。此外，本研究發(fā)現(xiàn)青錢(qián)柳紅米復(fù)合酒含有黃酮、多酚，今后可對(duì)其抗氧化功能進(jìn)行研究。