響應(yīng)面法優(yōu)化黑水虻抗菌肽提取工藝研究

胡文舉，孫英菲

（河南開放大學(xué)，河南鄭州 450046）

抗菌肽具有熱穩(wěn)定性好、抗菌譜廣、不易產(chǎn)生耐藥性、對高等動物正常細胞幾乎無害等特點。杜紅等（2022）研究表明，將抗菌肽添加到飼料中能提高動物生長性能、免疫功能、血清抗氧化功能和促進腸道發(fā)育（張書會等，2022；李美茹等，2020）。黑水虻又稱亮斑扁角水虻，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織推薦的可飼用昆蟲之一（Van，2013）。自然環(huán)境下黑水虻幼蟲體內(nèi)可產(chǎn)生抗菌肽來抵抗病原微生物。夏嬙等（2013）對黑水虻幼蟲進行食源性人工誘導(dǎo)，使其產(chǎn)生具有抑菌活性的抗菌肽成分。目前，黑水虻抗菌肽的制備途徑主要包括直接從幼蟲體內(nèi)分離、化學(xué)合成和生物工程制備（Müller等，2014）。由于成本低、耗時短、工藝簡單、抗菌效果穩(wěn)定等優(yōu)點，直接分離法成為目前黑水虻抗菌肽制備的常用方法。本研究采用響應(yīng)面設(shè)計對黑水虻抗菌肽提取工藝進行優(yōu)化，以期為黑水虻抗菌肽的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與主要試劑 黑水虻蟲卵購自河南某黑水虻繁育基地；金黃色葡萄球菌菌株購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

EDTA-2Na、NaCl、蛋白胨、瓊脂粉、固體硫酸銨、去離子水、酵母提取物、無水乙醚等均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；透析袋購自上海源葉生物科技有限公司；超濾管購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

LB 培養(yǎng)基 ：10 g蛋白胨，5 g酵母提取物，5 g NaCl，15 g 瓊脂，1000 mL 蒸餾水。

1.2 主要儀器設(shè)備 DHG-3000AE型電熱烘干箱：無錫展霖環(huán)境科技有限公司；BILON-DFT-100A型粉碎機：上海比朗儀器制造有限公司；JIDI-16D離心機：廣州吉迪儀器有限公司；BXP-65型生物培養(yǎng)箱：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；MKZ-G2A真空冷凍干燥箱：青島邁可威微波創(chuàng)新科技有限公司；超低溫冰箱MD-86L58：美的集團股份有限公司；BBS-H1800超凈工作臺：濟南好來寶醫(yī)療器材有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑水虻的飼養(yǎng)與誘導(dǎo) 將孵化72 h后的黑水虻幼蟲置于飼養(yǎng)盒內(nèi)飼養(yǎng)至5齡期，在飼養(yǎng)基質(zhì)內(nèi)加入5 mL含有金黃色葡萄球菌（3×1012個/mL）的菌液繼續(xù)飼養(yǎng)24 h。

1.3.2 樣品預(yù)處理 取適量的黑水虻幼蟲，用純凈水沖洗干凈，吸干水分，50℃烘干至恒重，研磨粉碎，索氏提取法脫脂，破壁機粉碎過70目篩后冷凍保存。

1.3.3 黑水虻抗菌肽的提取 稱取10 g脫脂黑水虻幼蟲粉，加入含0.9% NaCl的EDTA緩沖液，按照試驗設(shè)計進行浸提。浸提后8層紗布過濾，8000 r/min 離心 15 min，取上清液加入硫酸銨（質(zhì)量百分比濃度70%），攪拌至充分溶解，4℃靜止4 h，10000 r/min 離心 15 min，棄上清液。參照張弘弛等（2021年）的方法，將黑水虻幼蟲粗蛋白提取物用1 kD透析袋4℃下透析24 h，期間換液3次。將透析后的粗蛋白加入到10 kD超濾管內(nèi)，5000 r/min 離心 1 h，收集管底液，真空冷凍干燥稱重后保存。

1.3.4 抗菌肽提取率的測定 抗菌肽提取率=抗菌肽的質(zhì)量/黑水虻蟲干的質(zhì)量

1.3.5 抗菌肽抗菌活性的檢測 以金黃色葡萄球菌為指示菌，采用牛津杯擴散法測定黑水虻抗菌肽的抑菌活性（李美茹等，2010）。試驗設(shè)陰陽性對照，其中，陰性對照為滅菌蒸餾水，陽性對照為4 U/mL青霉素。將LB平板置于37℃條件下連續(xù)培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈的直徑，每組試驗重復(fù)3次，計算平均值。

1.4 試驗設(shè)計

1.4.1 單因素試驗 參考相關(guān)文獻（韓玉竹等，2019），在預(yù)試驗基礎(chǔ)上分別研究液料比（2∶1、4∶ 1、6∶ 1、8∶ 1、10 ∶ 1 g/mL）、浸提時間（4、8、12、16、20 h）、超聲功率（10、30、50、70、90 W）對黑水虻抗菌肽提取率和抗菌活性的影響。

1.4.2 響應(yīng)面試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以液料比、浸提時間和超聲功率為自變量，以提取率為響應(yīng)值，利用Box-Behnken試驗設(shè)計原理進行3因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗，利用Design-Expert 10.07軟件進行分析。響應(yīng)面優(yōu)化試驗因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 液料比對抗菌肽的影響 由圖1可知，黑水虻抗菌肽的提取率隨液料比的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)液料比為6∶1時，提取率達到最高值1.03%，但與4∶1和8∶1組差異不顯著（P＞0.05），當(dāng)液料比達到10∶1時抗菌肽提取率最低，為0.64%，與4∶1、6∶1和8∶1組差異極顯著（P＜0.01），與2∶1組差異不顯著（P＞0.05）。從抑菌效果看，2∶1組抑菌圈直徑最小，為11.32 mm，與其他組相比差異極顯著（P＜0.01）。因此，在響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計時選擇液料比6∶1作為中心試驗點。

圖1 液料比對黑水虻抗菌肽的提取率及抑菌性能的影響

2.1.2 浸提時間對抗菌肽的影響 由圖2可知，黑水虻抗菌肽提取率隨浸提時間的增加呈上升趨勢，浸提時間為4 h時，抗菌肽提取率最低，為0.71%，與其他組差異極顯著（P＜0.01）。當(dāng)浸提時間達到12 h時抗菌肽提取率最高，為1.26%，但與 8、16、20 h 組差異不顯著（P ＞ 0.05）。浸提時間對黑水虻抗菌肽的抑菌效果影響各組之間差異不顯著（P＞0.05）。因此，確定黑水虻抗菌肽最佳浸提時間為12 h，并將浸提12 h作為響應(yīng)面試驗設(shè)計的中心點。

圖2 浸提時間對黑水虻抗菌肽的提取率及抗菌性能的影響

2.1.3 超聲功率對抗菌肽的影響 由圖3可知，超聲功率為30 W時，黑水虻抗菌肽提取率比10 W時顯著提高，當(dāng)超聲波功率達到50 W時黑水虻抗菌肽的提取率最高，達到1.14%。隨功率的提高，提取率有下降趨勢。當(dāng)超聲波功率大于70 W時，提取的抗菌肽抑菌效果呈顯著下降趨勢，抑菌圈直徑顯著低于10、30和50 W組。綜合考慮提取率和抑菌效果，最佳超聲功率選定為50 W，每10 W一個梯度。

圖3 超聲功率對黑水虻抗菌肽的提取率及抑菌性能的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果 根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗所得數(shù)據(jù)，經(jīng)回歸擬合得到二次多項回歸方程為：

Y=1.4678-0.1011A+0.0279B+0.0193C+0.01 4AB+0.0653AC-0.0243BC-0.2742A2-0.1871B2-0.1829C2

回歸模型方差分析見表2。由表2可知，該模型P＜0.01，模型整體達到極顯著水平，失擬項P＞0.05，失擬項不顯著，說明該模型擬合較好，能準確反應(yīng)液料比、浸提時間和超聲功率對抗菌肽提取率的影響。模型決定系數(shù)R2=0.9641，說明不到5%的變異無法利用該模型進行解釋。矯正決定系數(shù)，擬合決定系數(shù)，說明該模型可靠，預(yù)測值與實際值之間誤差較小，能準確預(yù)測和分析黑水虻抗菌肽最佳提取工藝參數(shù)和結(jié)果。回歸模型中一次項A和二次項A2、B2、C2對黑水虻抗菌肽提取效率影響達到極顯著水平（P＜0.01）。各因素對黑水虻抗菌肽提取率影響順序為A＞B＞C。

表2 回歸模型分析結(jié)果

2.3 響應(yīng)面交互作用分析 利用Design-Expert 10.07軟件繪制3個因素交互作用對黑水虻抗菌肽提取率影響的響應(yīng)面圖（見圖4）。由圖4可知，液料比和超聲功率的交互作用對抗菌肽提取率影響最為顯著，浸提時間分別與液料比和超聲功率的交互作用均不明顯。

圖4 液料比、浸提時間、超聲功率對提取率交互作用的響應(yīng)面圖

2.4 最佳提取工藝的確認與驗證 根據(jù)模型分析結(jié)果，黑水虻抗菌肽最佳提取條件為液料比6.964、浸提時間 12.335 h、超聲功率 51.338 W，此時黑水虻抗菌肽的提取率預(yù)測值為1.360%。為便于驗證試驗的進行，將提取條件修正為液料比7.0，浸提時間 12 h，超聲功率 50 W。按照修正條件進行3次平行驗證試驗，測得該條件下黑水虻抗菌肽的提取率為1.34%，與預(yù)測值非常接近，說明該模型準確可行，所確定的提取條件可靠。此外，3次平行驗證試驗所提取的抗菌肽抑菌圈直徑為（12.68±0.72）mm，與各單因素試驗最高值相比差異不顯著（P＞0.05），表明最佳提取條件下提取的抗菌肽抑菌效果穩(wěn)定。

3 討論

隨著抗菌肽功能研究的不斷深入，抗菌肽的提取也越來越受關(guān)注。抗菌肽的提取受提取溫度，提取液種類、比例，提取時間，輔助手段等多種因素的影響，并且各因素之間還存在互作效應(yīng)。本研究采用響應(yīng)面設(shè)計，在單因素試驗的基礎(chǔ)上對液料比、浸提時間、超聲功率3個因素之間的互作效應(yīng)進行研究，以探索黑水虻抗菌肽的最佳提取工藝。在單因素試驗中，料液比對黑水虻抗菌肽提取率的影響趨勢與李美茹等（2020）在紅線蟲上的研究類似，可能是因為液料比過低時，蟲體內(nèi)抗菌效果較強的多肽不能充分溶解，隨著提液料比的增大，蟲體內(nèi)的抗菌肽被充分溶解在提取液內(nèi)，但當(dāng)液料比過高，抗菌肽凝析不完全，反而影響了提取效果。隨著浸提時間的增加，黑水虻抗菌肽提取率呈先上升后穩(wěn)定的趨勢，可能是因為浸提12 h左右，黑水虻幼蟲體內(nèi)的抗菌肽已經(jīng)達到靜態(tài)下所能提取的極值。在浸提過程中，隨著超聲波功率的提高，抗菌肽提取率先呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)功率達到50 W后提取率達到最高值，隨后隨著功率的繼續(xù)增大，提取率和抗菌效果均呈顯著下降趨勢，這主要是因為提取過程中輔以超聲波能加快提取液的振動頻率，促進提取液進入黑水虻組織，有利于抗菌肽的提取，超聲功率過大則會破壞抗菌肽的結(jié)構(gòu)，從而影響提取效果和抑菌效果（許依能等，2022）。利用響應(yīng)面設(shè)計對3個影響因素進行優(yōu)化，建立最優(yōu)提取條件的二次多項回歸模型，通過對模型的分析可知，液料比和超聲功率的交互作用對抗菌肽提取率影響最為顯著，其余交互作用均不顯著，模型預(yù)測的最佳提取條件為液料比6.964、浸提時間12.335 h、超聲功率51.338 W，提取率預(yù)測值為1.360%，對提取條件進行修正和驗證得知，抗菌肽提取率可以達到1.34%，與預(yù)測值基本契合，提取率比優(yōu)化前提高了6.35%。

4 結(jié)論

本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對黑水虻抗菌肽的提取條件采用響應(yīng)面法進行優(yōu)化。結(jié)果表明，黑水虻抗菌肽的最優(yōu)提取條件為液料比7 ∶ 1，浸提時間 12 h，超聲波功率 50 W，在此條件下，提取的抗菌肽提取率為1.34%，抗菌肽抑菌圈直徑為（12.68±0.72）mm。說明該條件下提取的黑水虻抗菌肽提取率高，抑菌效果恒定，可為今后黑水虻產(chǎn)業(yè)化開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。