以粗糧為基質(zhì)保藏米根霉的保存時(shí)間研究

陳思達(dá) 陳沙 張鳳英

摘要：對(duì)以粗糧為基質(zhì)保藏米根霉種的保存時(shí)限進(jìn)行了探討。將不同年份的3株根霉種及其轉(zhuǎn)接制備的新鮮麩皮菌種，用于發(fā)酵糯米，測(cè)定發(fā)酵液的糖度，來衡量保存多年的根霉種的糖化酶活力和遺傳穩(wěn)定性。結(jié)果表明，保存3～8年的根霉種的酶活力變化很??；不同年份的3株根霉種及其轉(zhuǎn)接制備的新鮮菌種的酶活力與當(dāng)年不相上下。由此可知，在4～7 ℃米根霉以粗糧為保藏基質(zhì)的保存時(shí)限可達(dá)8年以上，且遺傳穩(wěn)定性良好。

關(guān)鍵詞：米根霉；粗糧；糖度；酶活力；保存時(shí)限

中圖分類號(hào)：TS261.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20230525

Study on the preservation time of coarse grains cultures of Rhizopus oryzae

Chen Sida1， Chen Sha1， Zhang Fengying2

（ 1. Food Inspection and Testing Research Institute of Jiangxi General Institute of Testing and Certification， Nanchang， Jiangxi 330052； 2. School of Food Science and Technology， Jiangxi Agricultural University， Nanchang， Jiangxi 330045 ）

Abstract： In this paper， the preservation time of coarse grains cultures of Rhizopus oryzae was discussed. The three R. oryzae strains cultures from different years and the fresh wheat bran cultures transferred by the former were used to ferment glutinous rice. Saccharification enzyme activity and genetic stability of the preserved R. oryzae strains were measured by detecting the sugar content of the fermentation liquid. The results showed that the enzyme activity of R. oryzae strains stored for 3～8 years had little change. The enzyme activity of the three R. oryzae strains in different years and fresh cultures were similar to that of the same year. In conclusion， the preservation time of R. oryzae using coarse grains as storage substrate could reach more than 8 years at 4～7 ℃ and the genetic stability was good.

Key words： Rhizopus oryzae， coarse grains， total sugar， enzyme activity， preservation time

米根霉是釀酒用曲藥的主要糖化菌株，同時(shí)也是大曲中功能菌之一[1]，工業(yè)上還可用來生產(chǎn)淀粉酶[2]。根霉除有較強(qiáng)的糖化能力外，還具有一定的酒精發(fā)酵能力，但其酒精發(fā)酵能力比一般酵母弱得多，只能產(chǎn)生3%～5%的酒精度[3]；因此米根霉常作為生產(chǎn)小曲和甜酒釀的糖化菌種，另外它具有的產(chǎn)有機(jī)酸[4-6]的特性使酒的口感更香醇。菌株傳代保存是相關(guān)科研生產(chǎn)單位的重要工作之一。大多數(shù)酒曲廠都是采用試管培養(yǎng)基轉(zhuǎn)管傳代的方法保藏菌種，由于頻繁傳代培養(yǎng)，又加上小企業(yè)無菌操作設(shè)施和技術(shù)限制，菌種極易染雜菌和變異退化，一般每年都要到科研機(jī)構(gòu)或菌種保藏機(jī)構(gòu)購買母種，有時(shí)買來的菌種只能保證是這個(gè)種，不一定能保證所需要的優(yōu)良生產(chǎn)性能。如何長期有效地保藏性能優(yōu)良的米根霉菌種讓相關(guān)技術(shù)人員倍加關(guān)注。

目前真菌的保存方法主要有三類[7-8]：第一類是保持菌體連續(xù)生長的保藏方法，其特點(diǎn)是不斷將菌株轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基上，培養(yǎng)好后放在4～7 ℃冰箱中，此方法主要以斜面每2～3月轉(zhuǎn)接一次為主[9-10]，因需要頻繁傳代，易變異退化，染上雜菌的機(jī)會(huì)也較多[11]；第二類是在缺氧干燥的空間中保藏菌種的休眠體，如孢囊孢子、分生孢子等，此法可保存1～2年，保存過程中需換干燥劑、抽真空1～2次，操作也較繁瑣；第三類是通過抑制微生物的生長活性而達(dá)到長期保存目的，一般是低溫凍藏，如真空冷凍干燥、液氮保存[12]及磁珠保藏[13]等，微生物可存活5～20年，弊端是設(shè)備貴、操作復(fù)雜[14-15]，特別是微生物細(xì)胞冷凍和解凍活化技術(shù)要求都較高，在處理過程中也難免存在因冷凍降溫操作不慎導(dǎo)致冰晶對(duì)細(xì)胞造成的傷害問題，這也就是為什么有時(shí)企業(yè)從相關(guān)微生物保藏中心購買的凍干管菌種，活化轉(zhuǎn)接后會(huì)失去菌株原本的生產(chǎn)能力甚至接不活的原因；瓷珠菌種保存管法，常用于食品微生物標(biāo)準(zhǔn)菌種和分離菌株的保存、復(fù)蘇以及運(yùn)輸，保存效果次于冷凍真空干燥保藏法，也比較容易操作，但保存時(shí)間較短[13]。

現(xiàn)在真菌保藏技術(shù)研究多以提高菌株的存活率和純度為衡量指標(biāo)[16-17]，而忽視保持菌株的生產(chǎn)性能的穩(wěn)定性。況且沒有一種保藏方法能適合所有真菌的保藏，每一種真菌都應(yīng)該有獨(dú)特的保藏方法。本研究擬設(shè)計(jì)一種以混合粗糧為基質(zhì)干燥冷藏保存根霉種的方法，將以該法保藏的不同年份的米根霉種及用其制備的新鮮菌種，用于發(fā)酵糯米，并測(cè)定糯米發(fā)酵液的糖度，以此來衡量該方法保存多年的根霉種的繁殖力和糖化力的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要原料

麩皮、燕麥、藜麥、小米、玉米芯、糯米：市售。不同保藏年份的根霉種2-2、F14、F6：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要藥品

氫氧化鈉、酚酞、醋酸、醋酸鈉、五水硫酸銅、次甲基藍(lán)、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀（均為分析純）：天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心；可溶性淀粉、葡萄糖（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備

BCD-378DGN型冰箱：青島海爾股份有限公司；HH-B11-600型電熱恒溫培養(yǎng)箱、GZXDH-DXO-S型電熱恒溫干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2D型超凈工作臺(tái)：江蘇凈化設(shè)備有限公司；MJ-54A型高壓滅菌鍋：施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 保藏培養(yǎng)基制備

稱取磨碎或粉碎玉米芯10%、燕麥片55%、小米20%、黎麥15%混合均勻，將上述原料混勻后放在65 ℃的烘箱內(nèi)烘2 h，用粉碎機(jī)打碎；先過20目篩篩掉粗顆粒，再過40目篩篩掉細(xì)粉，取篩上物料，加入物料質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%的海藻糖水溶液（含海藻糖8%），然后翻拌混勻至松散不結(jié)塊狀態(tài)即可。

1.2.2 根霉種保藏方法

將上述保藏培養(yǎng)基分裝入250 mL三角瓶中，用棉塞塞好包扎滅菌后，趁熱取出并將培養(yǎng)基拍散，冷卻，分別接入分離純化好的米根霉試管種F6、F14、2-2，然后于28～32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40～48 h后，無菌操作在三角瓶內(nèi)弄散后裝入無菌牛皮紙信封中封好，于40～45 ℃恒溫干燥箱（使用前干燥箱應(yīng)紫外燈照射殺菌）中干燥36～48 h，干燥脫水后，用無菌塑料袋裝好密封，放入2～7 ℃冰箱中保存3～9年。

1.2.3 轉(zhuǎn)接制備新鮮根霉種

稱取適量麩皮[18]，加入麩皮量40%～50%的水翻拌混勻至松散不結(jié)塊狀態(tài)，分裝入250 mL三角瓶中，用棉塞塞好包扎滅菌后，趁熱取出并將培養(yǎng)基拍散，冷卻，分別接入不同保藏年份的根霉種F6、F14、2-2，然后于28～32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40～48 h后，弄散裝入滅菌過的牛皮紙信封中封好，于40～45 ℃恒溫干燥箱中烘干36～48 h，用無菌塑料袋裝好，放入2～7 ℃冰箱備用。

1.2.4 根霉種糖化力檢測(cè)

將糯米洗凈、浸泡3～4 h、瀝干水，隔水蒸至米半透明內(nèi)無白心，用純凈水淋冷至室溫，均勻拌入0.5%～1.0%的根霉種，裝入容器、壓實(shí)，用保鮮膜封好，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中糖化40～48 h，有酒香味及發(fā)酵液后，用糖度計(jì)測(cè)發(fā)酵液的糖度，以發(fā)酵液的糖度來反映根霉的糖化力。糖度越高，根霉的糖化力越強(qiáng)。

1.2.5 酸度測(cè)定

參考文獻(xiàn)[19]。

1.2.6 糖化酶活力測(cè)定

參考文獻(xiàn)[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 根霉菌株2-2保存時(shí)限探討

2.1.1 不同年份2-2的糖化力及其酒液的酸度

根霉2-2是從貴陽花溪酒曲中分離到的一株生產(chǎn)和生長性能類似于經(jīng)典根霉糖化菌Q303的菌株，在釀酒過程中不僅有很強(qiáng)的糖化能力，而且具有一定的酒精發(fā)酵能力[21]。將保存5～9年的2-2分別發(fā)酵糯米，以發(fā)酵液的糖度來反映其糖化力，以發(fā)酵液的酸度高低及是否有異味來確定保存的根霉種發(fā)酵的酒釀質(zhì)量是否符合要求，從而得出根霉種可保存年限。根霉2-2發(fā)酵液的糖度見圖1，酸度和風(fēng)味見表1。

由圖1可以看出，保存了5～9年的根霉種的糖度均在40～45 °Bx，當(dāng)年糖度和目前糖度的差值不大，符合根霉種質(zhì)量要求；保藏5年的有異味，可能是原種不純或是操作性污染，重復(fù)幾次后發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)同樣結(jié)果，由此可知是原種不純。由表1可以看出，發(fā)酵液的酸度均未超過0.5%，在相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的范圍內(nèi)。由此可知，保存的根霉種的糖化力基本沒有衰減。

2.1.2 用不同年份的2-2轉(zhuǎn)接制備的新鮮種的糖化力及其酒液的酸度

為了檢測(cè)所保藏種2-2的繁殖力及遺傳穩(wěn)定性，用保藏種2-2轉(zhuǎn)接制備成新鮮麩皮根霉種，糖化發(fā)酵糯米40～45 h，測(cè)發(fā)酵液的糖度和酸度。保存5年的由于不純，這步實(shí)驗(yàn)忽略。由圖1可以看出，用保存3～9年的根霉轉(zhuǎn)接制備的新鮮根霉種的糖化力均在42.0～46.8 °Bx，新鮮種與保藏種的差值在0.5～2.0，且高低互現(xiàn)，說明糖化力基本未隨著保藏年份的增加而衰減，保持了優(yōu)良的繁殖力和遺傳穩(wěn)定性。 由表2可以看出，發(fā)酵液的酸度都沒超過0.5%，發(fā)酵液甜味純正豐滿，無明顯酸感，均無異味，說明保存過程中未染雜菌。

綜上所述，由燕麥皮、小米粉、藜麥粉等粗糧混合制備的保藏培養(yǎng)基培養(yǎng)的根霉種2-2干燥脫水后保存時(shí)限可達(dá)9年。

2.2 根霉菌F14保存時(shí)限的探討

2.2.1 不同年份F14的糖化力及其酒液的酸度

多數(shù)根霉菌株的孢子囊成熟后呈黑色，由于這些黑色孢子囊（一般簡稱黑孢子）往往影響米粉酒餅的外觀品質(zhì)，許多酒廠和酒曲經(jīng)銷商不喜歡使用或經(jīng)銷外表有黑孢子的酒餅，所以一般只適合做麩曲或糠曲，不適合做酒餅。而用F14做出的酒餅不長肉眼可見的黑孢子，糖化發(fā)酵能力又較強(qiáng)，因此F14成為湖北、四川、廣西等一些酒餅企業(yè)生產(chǎn)常用菌[22]。

用保存3～9年的F14發(fā)酵糯米，糖度見圖2，酸度和風(fēng)味見表3。

由圖2可知，保存了3～9年的F14的發(fā)酵液糖度均大于44 °Bx，糖化力較高。由表3可知，發(fā)酵液的酸度較低，均小于0.37%，且發(fā)酵液均有蜂蜜的香甜味。由此確定，保存3～9年的F14的發(fā)酵特性未發(fā)生改變。

2.2.2 用不同年份的F14轉(zhuǎn)接制備的新鮮種的糖化力及其酒液酸度

為了檢測(cè)F14的繁殖力及遺傳穩(wěn)定性，將不同年份保藏種F14轉(zhuǎn)接制備成新鮮麩皮種，用其發(fā)酵糯米，觀測(cè)發(fā)酵液的糖度和酸度。由圖2可以看出，用不同年份的F14轉(zhuǎn)接制備的新鮮種的糖化力均在43～46 °Bx，說明糖化力基本上沒有衰減。由表4可以看出，發(fā)酵液的酸度多數(shù)較低（低于0.24%），保藏6年的酸度雖高（0.35%），但口感反而更豐滿；符合相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量要求，證明該方法保存9年的F14的糖化力和遺傳穩(wěn)定性依然很好。

2.3 根霉菌F6保存時(shí)限的探討

2.3.1 不同年份F6的糖化力和及其酒液的酸度

F6是從廣東肇慶傳統(tǒng)小曲中分離得到的一株糖化能力較強(qiáng)的菌株，與Q303、2-2、F14相比，F(xiàn)6的孢子囊梗和菌絲更短，在麥芽汁培養(yǎng)基表面生長會(huì)起皺褶，氣生菌絲稀疏，黑孢子很少。因此用其生產(chǎn)的酒餅不僅不長肉眼可見的黑孢子，還呈現(xiàn)悅目的淡黃色；且在糖化發(fā)酵中產(chǎn)生獨(dú)特風(fēng)味。 該菌種現(xiàn)已被廣西、廣東、海南等地的一些酒曲廠采用。F6與2-2、F14純根霉曲相比，釀造的酒18種氨基酸總含量（1.7 g/100 mL）和人體8種必需氨基酸的總含量（0.53 g/100 mL）均更高[23]。

用不同年份的F6糖化發(fā)酵糯米，發(fā)酵液的糖度檢測(cè)結(jié)果見圖3，酸度和風(fēng)味見表5。

由圖3可以看出，保存2～8年的根霉F6，其糖度在36～40 °Bx，與當(dāng)年的糖化力差別在范圍內(nèi)，酸度雖普遍比2-2和F14都更高，但均未超過0.5%，且風(fēng)味醇香可口，符合企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

2.3.2 用不同年份的F6轉(zhuǎn)接制備的新鮮種的糖化力及其酒液的酸度

將保藏根霉種轉(zhuǎn)接制備新鮮種，用其發(fā)酵糯米，測(cè)糯米發(fā)酵液的糖度和酸度，以衡量F6的繁殖力及遺傳穩(wěn)定性。由圖3可知，用保存2～8年的F6轉(zhuǎn)接制備新種的糖化力均在39～42 °Bx，均比保藏種高1.0～3.4 °Bx，說明保藏種F6經(jīng)轉(zhuǎn)接活化后使用酶活力更強(qiáng)，生產(chǎn)效率會(huì)更高，這可能與F6孢子少有關(guān)系，因?yàn)殒咦拥挚共涣忌L環(huán)境的能力更強(qiáng)，菌絲經(jīng)長時(shí)間的保存繁殖力比孢子要弱[24]。由表6可知，發(fā)酵液的酸度及風(fēng)味與保藏種差不多，均未超過0.5%，在合格范圍內(nèi)，說明保存8年的 F6依然保持了良好的繁殖能力和糖化力。

綜上所述，以混合粗糧為基質(zhì)保藏的根霉F6的保存時(shí)限也可達(dá)8年。

2.4 糖化酶活力測(cè)定

為了驗(yàn)證上述糖化力測(cè)定方法的可靠性，從不同年份的2-2、F14、F6保藏種和轉(zhuǎn)接制備的新鮮菌種中，各取1個(gè)糖化力最高的種，用還原法測(cè)定其糖化酶的活力，結(jié)果見圖4。

由圖4可以看出，所檢測(cè)的菌種的糖化酶活力與直接發(fā)酵糯米測(cè)定的糖化力強(qiáng)弱順序相吻合，說明本文使用的糖化發(fā)酵糯米的方法檢測(cè)根霉種的糖化力是可靠的。

3 結(jié) 論

由粉碎的燕麥、小米、藜麥、玉米芯混合制備的保藏培養(yǎng)基制備的根霉種干燥脫水后保存時(shí)限可達(dá)8～9年。根霉2-2和F14直接應(yīng)用保藏種與轉(zhuǎn)接活化種發(fā)酵糯米的糖化力沒有明顯規(guī)律性的差別，但F6使用前將保藏根霉種轉(zhuǎn)接活化后其糖化酶活力均更高。

保藏種可隨取隨用，每次從冷藏冰箱取用時(shí)只需先回溫至常溫，再打開封口就可直接用于制備2級(jí)種；而試管和冷凍管菌種須活化1～2代，再擴(kuò)培后，才能用于制備2級(jí)種。從活化、擴(kuò)培到制備2級(jí)種至少要再傳2～4代[25-26]，用本方法的保藏種制備2級(jí)種只需傳1～2代。

本研究中4種保藏培養(yǎng)基組分玉米芯、燕麥、小米、藜麥各有功能。其中，玉米芯是玉米棒剝掉玉米粒的廢棄物粉碎而成的，在培養(yǎng)基組成中不作為根霉菌的營養(yǎng)組分，只起疏松透氣和固定化作用；藜麥淀粉含量雖很低，但含30%的胚芽，蛋白質(zhì)、皂甙和多酚含量均比其它谷物高，抗氧化能力較強(qiáng)，其蛋白含量豐富且比例平衡，含有全部天然氨基酸，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織推薦的唯一全營養(yǎng)食品[27]，是作為本文保藏培養(yǎng)基的保健組分；小米含有其它原料中沒有的胡蘿卜素，維生素B1的含量居其它谷物之首，此外小米的鈣含量也較高且僅次于燕麥[28]，鈣是許多生物酶的激活劑，在保藏方法中小米對(duì)根霉起復(fù)壯作用；燕麥?zhǔn)窃摫２嘏囵B(yǎng)基的基本營養(yǎng)組分。綜上所述，該保藏培養(yǎng)基中4種原料相輔相成，各有其重要功能。

該保種方法：操作簡單，對(duì)設(shè)備要求低，保藏時(shí)間長，保存量大，保存菌種的糖化力穩(wěn)定，對(duì)于一般酒曲企業(yè)和酒廠，尤其是個(gè)體戶是一項(xiàng)很實(shí)用的保種技術(shù)，對(duì)釀造工業(yè)用種質(zhì)資源的可持續(xù)發(fā)展也有重要意義。后續(xù)將對(duì)保藏8～9年的3個(gè)種進(jìn)行產(chǎn)糖化酶基因測(cè)序，并與用試管頻繁轉(zhuǎn)管保藏種的酶基因?qū)Ρ?，觀察其相關(guān)遺傳基因是否有變化。

參 考 文 獻(xiàn)

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