VIGS技術(shù)初步鑒定RgMLO6和RlMLO7基因?qū)Π追鄄〉呢?fù)調(diào)控功能

朱正錦，陳 敏，田永賢，向貴生，張 顥，邱顯欽

(1.云南大學(xué) 資源植物研究院，云南 昆明 650091；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 花卉研究所，云南 昆明 650205；3.國(guó)家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650205)

白粉病是切花月季種植中最嚴(yán)重的病害[1-3]，白粉菌的掌狀吸器吸取植株細(xì)胞中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)維持自身的生長(zhǎng)發(fā)育[4].大量研究發(fā)現(xiàn)MLO基因在植物抗白粉病中發(fā)揮重要作用，當(dāng)MLO基因的堿基序列發(fā)生改變時(shí)會(huì)形成mlo等位基因，導(dǎo)致其蛋白功能喪失從而降低了MLO基因?qū)Π追劬秩镜恼{(diào)控作用[4-6].將不同物種的MLO基因敲除后，發(fā)現(xiàn)大麥葉片出現(xiàn)斑點(diǎn)以及大麥谷粒產(chǎn)量下降[7-8]；擬南芥則表現(xiàn)出生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、衰敗較早且未感染葉片有胼胝質(zhì)沉積的現(xiàn)象[9]；辣椒表現(xiàn)為植株變小[10].本實(shí)驗(yàn)室基于大花香水月季與長(zhǎng)尖葉薔薇轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分別獲得11和12個(gè)MLO基因，與其他物種比對(duì)，得到與響應(yīng)白粉菌侵染相關(guān)的6個(gè)候選基因，其中符合抗白粉病MLO基因典型結(jié)構(gòu)特征的有RgMLO6和RlMLO7基因[11].對(duì)6個(gè)候選基因進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果顯示RgMLO6和RlMLO7基因在受到白粉菌脅迫后相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào).

病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)（VIGS）是一種能夠快速簡(jiǎn)便對(duì)植物基因功能進(jìn)行鑒定的遺傳學(xué)方法.將目的基因片段導(dǎo)入病毒載體，然后侵染植物使該植物體內(nèi)的基因被沉默，從而引起植株表型及生理指標(biāo)發(fā)生改變，以此對(duì)目的基因的功能進(jìn)行鑒定[12].目前，VIGS 技術(shù)已經(jīng)被成功地應(yīng)用于煙草（Nicotiana tabacumL.）[13-14]、擬南芥（Arabidopsis thaliana）[14]、棉 花（Gossypium spp）[15-16]、番 茄（Lycopersicon esculentumMill.）[17]、馬鈴薯（Solanum tuberosum）[18]等植物中.考慮到月季遺傳轉(zhuǎn)化的困難性，我們選擇使用VIGS技術(shù)對(duì)RgMLO6和RlMLO7基因的功能進(jìn)行初步鑒定.

本研究分析了大花香水月季的RgMLO6 基因和長(zhǎng)尖葉薔薇的RlMLO7基因在白粉菌侵染時(shí)的表達(dá)模式，進(jìn)一步構(gòu)建了該基因的VIGS沉默載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染獲得沉默植株并進(jìn)行抗性鑒定.本研究為初步鑒定RgMLO6和RlMLO7基因?qū)Π追鄄〉恼{(diào)控功能，也為今后更好地分析MLO基因，培育薔薇科植物抗白粉病新品種提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料參照張顥等[19-20]的方法對(duì)來自大花香水月季與長(zhǎng)尖葉薔薇的幼葉進(jìn)行白粉菌侵染，分別采摘未侵染（0 h）與侵染6、12、24 h的幼葉作為供試植物材料.接穗為云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉所科研成果示范基地的大花香水月季和長(zhǎng)尖葉薔薇萌發(fā)的腋芽，砧木為基地‘月月粉’（R.chinensis‘Pallida’）的枝條.大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 DH5α 及根癌農(nóng)桿菌熱激感受態(tài)GV3101作為試驗(yàn)菌株，pTRV1和pTRV2兩個(gè)供試載體.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1RgMLO6和RlMLO7基 因 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量PCR 分別采摘白粉菌侵染0、6、12、24 h的大花香水月季與長(zhǎng)尖葉薔薇的幼葉，總RNA的提取與基因組DNA的去除使用植物總RNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）.使用PrimeScriptTMRT reagent試劑盒（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA.以在月季中穩(wěn)定表達(dá)的UBC作為內(nèi)參基因（表1）[2]，采用qRT-PCR技術(shù)測(cè)定RgMLO6和RlMLO7基因的表達(dá)量，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)[21].反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照向貴生[11]方法，采用2-ΔΔCt法[22]分析數(shù)據(jù)并用Origin 2021作圖.

1.2.2RgMLO6和RlMLO7基因片段的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建 總RNA提取和cDNA的合成同1.2.1節(jié).分別選取RgMLO6基因CDS序列的3′端224 bp序列和RlMLO7基因CDS序列的3′端的259 bp序列，在設(shè)計(jì)引物（表1）時(shí)加上BamH Ⅰ和SmaⅠ酶切位點(diǎn).PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測(cè)并回收目的條帶，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后用于下一步試驗(yàn).參照 TaKaRa公司試劑盒的操作步驟進(jìn)行 PCR產(chǎn)物的切膠回收，將目的基因片段和病毒空載體pTRV2 同時(shí)用BamH Ⅰ和SmaⅠ進(jìn)行雙酶切[23].分別將酶切后的RgMLO6和RlMLO7片段與線性化載體pTRV2切膠回收.參照T4 DNA Ligase酶（TaKaRa公司）說明書得到連接產(chǎn)物，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)中，在含有50 μg/mL卡那霉素平板上挑取陽(yáng)性單克隆，經(jīng)菌液PCR檢測(cè)后，進(jìn)行測(cè)序鑒定.對(duì)測(cè)序鑒定正確的重組轉(zhuǎn)化子菌液，按照 TIANprep Mini Plasmid Kit 說明書進(jìn)行質(zhì)粒提取[23]，雙酶切鑒定質(zhì)粒是否攜帶目的基因.

1.2.3 農(nóng)桿菌侵染及沉默效率檢測(cè) 參照穆春等[24]的方法，通過電擊轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒 pTRV2、重組質(zhì)粒pTRV2-RgMLO6和pTRV2-RlMLO7轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌感態(tài)GV3101中，進(jìn)行轉(zhuǎn)化前的活化及重懸.分別取大花香水月季和長(zhǎng)尖葉薔薇長(zhǎng)度在5 cm左右的腋芽置于清水中帶回，參照晏慧君等[25]的方法進(jìn)行抽真空侵染.將抽吸后的腋芽取出，放入清水中，通過劈接法進(jìn)行嫁接，用封口膜將接口封住并套上袋子，每隔4 d觀察接穗的情況.使用qRT-PCR分析接種20 d后的大花香水月季與長(zhǎng)尖葉薔薇的RgMLO6和RlMLO7基因的表達(dá)量，在RgMLO6和RlMLO7基因沉默片段外設(shè)計(jì)引物（表1），以UBS為內(nèi)參基因（表1），擴(kuò)增片段大小為109 bp.反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照Cao等[26]的方法進(jìn)行，然后利用Origin 2021軟件作圖.

表1 本研究所用引物及其序列Tab.1 Primers used and their sequences used in the study

1.2.4 VIGS沉默RgMLO6和RlMLO7基因薔薇科植株白粉病抗性鑒定 以VIGS沉默RgMLO6和RlMLO7基因的大花香水月季和長(zhǎng)尖葉薔薇作為處理組的實(shí)驗(yàn)材料，與對(duì)照組相比較進(jìn)行白粉病的抗性鑒定.分別取白粉菌孢子懸浮液20 μL侵染處理組和對(duì)照組的6個(gè)嫩葉正面放入培養(yǎng)皿中密封，并置于20 ℃、光強(qiáng)3 000 lx、16 h/d的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，然后統(tǒng)計(jì)嫩葉的白粉菌侵染情況，3次重復(fù).基因沉默植株的抗病性依照張顥的方法進(jìn)行判定[18]，將相對(duì)抗病指數(shù)為1.00的判定為免疫（I）、在0.80～0.99之間的為高抗（HR）、在0.40～0.79之間的為中抗（MR）、在0.20～0.39之間的為中感（MS）、0.20以下的為高感（HS）.

選用VIGS沉默RgMLO6和RlMLO7基因且生長(zhǎng)狀態(tài)相同的大花香水月季和長(zhǎng)尖葉薔薇（處理組）和未沉默的（對(duì)照組）的植株幼葉作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象.分別取白粉菌孢子懸浮液20 μL侵染處理組和對(duì)照組的幼葉正面，并置于20 ℃、光強(qiáng)3 000 lx、16 h/d的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12、24 h和48 h，應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)染色法染色后在顯微鏡下觀察白粉菌的生長(zhǎng)狀態(tài).

2 結(jié)果分析

2.1 RgMLO6和RlMLO7基因熒光定量qPCR以UBC為內(nèi)參基因，對(duì)RgMLO6與RlMLO7基因在0、6、12 h和24 h時(shí)的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了分析.結(jié)果如圖1所示，RgMLO6在6、24 h的表達(dá)水平分是未處理的24、11倍，差異明顯，12 h的表達(dá)水平與未處理差異不明顯；RlMLO7基因在6、12 h的表達(dá)水平較是未處理的5、7倍，差異明顯，24 h的表達(dá)水平與未處理差異不明顯.這些結(jié)果表明大花香水月季的RgMLO6基因與長(zhǎng)尖葉薔薇的RlMLO7基因在白粉菌侵染中發(fā)揮重要作用.

圖1 月季白粉菌誘導(dǎo)不同時(shí)期RgMLO6與RlMLO7基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.1 The relative expression levels of RgMLO6 and RlMLO7 genes induced by powdery mildew rose at different stages

2.2 單克隆雙酶切檢測(cè)將RgMLO6和RlMLO7基因的CDS片段與線性pTRV2連接得到pTRV2-RgMLO6和pTRV2-RlMLO7重組表達(dá)載體，將重組表達(dá)載體利用BamH Ⅰ和SmaⅠ進(jìn)行雙酶切，最后菌液PCR驗(yàn)證正確性.結(jié)果如圖2所示，PCR電泳得到2個(gè)272 bp和255 bp長(zhǎng)度的小片段和一個(gè)長(zhǎng)度接近線性載體pTRV2大小的片段，表明表達(dá)載體構(gòu)建成功.

2.3 VIGS處理植株的熒光定量qPCR為了驗(yàn)證大花香水月季的RgMLO6與長(zhǎng)尖葉薔薇的RlMLO7 基因是否有效沉默，在VIGS載體轉(zhuǎn)入20 d后進(jìn)行熒光定量qPCR.如圖3所示，結(jié)果表明沉默RgMLO6基因的大花香水月季中的RgMLO6基因表達(dá)量較對(duì)照組降低了87.5%；沉默RlMLO7基因的長(zhǎng)尖葉薔薇中RlMLO7基因的表達(dá)量較對(duì)照組降低了88.9%.沉默植株中RgMLO6和RlMLO7基因的相對(duì)表達(dá)量顯著下降了80%～90%，說明pTRV2-RgMLO6和 pTRV2-RlMLO7 的導(dǎo)入可顯著地降低處理組植株內(nèi)源目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量，有效沉默目標(biāo)基因.

2.4 VIGS技術(shù)處理后的2種植株的白粉病抗性鑒定為了進(jìn)一步探究大花香水月季的RgMLO6與長(zhǎng)尖葉薔薇的RlMLO7 基因在抗白粉病中的作用，接種白粉菌至RgMLO6和RlMLO7基因沉默植株嫩葉7 d后對(duì)處理植株的白粉病抗性鑒定.如表2所示，經(jīng)VIGS處理后大花香水月季的抗性水平由高感上升為中抗，長(zhǎng)尖葉薔薇的抗性水平由中抗上升為高抗，2種基因型植株的抗性水平均得到提高.

圖2 雙酶切檢測(cè)載體重組表達(dá)載體Fig.2 Recombinant expression vector was detected by double enzyme digestion

圖3 RgMLO6和RlMLO7基因在對(duì)照組和處理組植株中的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative expression of RgMLO6 and RlMLO7 gene in control and experimental plants

表2 對(duì)照組和基因沉默處理組植株白粉病抗性鑒定Tab.2 Identification of powdery mildew resistance in control group and gene silencing treatment group

經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后，顯微鏡觀察對(duì)照組和RgMLO6和RlMLO7基因沉默處理組植株受白粉菌侵染后葉片中菌絲體的生長(zhǎng)情況，結(jié)果如圖4、5所示.大花香水月季和長(zhǎng)尖葉薔薇的葉表皮細(xì)胞在接種12 h后，對(duì)照組中均出現(xiàn)分生孢子和初級(jí)菌絲，而基因沉默處理組中僅觀察到分生孢子.在接種24 h后大花香水月季對(duì)照組開始出現(xiàn)二級(jí)菌絲，長(zhǎng)尖葉薔薇在對(duì)照組中發(fā)現(xiàn)了分生孢子和較長(zhǎng)的初級(jí)菌絲，RlMLO7基因沉默處理組中發(fā)現(xiàn)分生孢子和初級(jí)菌絲.在接種48 h后對(duì)照組發(fā)現(xiàn)了串生分生孢子，而在基因沉默處理組中僅發(fā)現(xiàn)了分生孢子和初級(jí)菌絲.

3 討論

MLO基因具有負(fù)向調(diào)控植物抗病性和葉肉細(xì)胞死亡雙重功能[27-29].邱顯欽等[2,6]從野薔薇中克隆得到4個(gè)mlo基因并進(jìn)行結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位及時(shí)空表達(dá)模式分析，克隆1個(gè)MLO基因RmMLO并鑒別出該基因在月季相應(yīng)白粉菌侵染中有一定作用.Kaufmann等[30]將月季中MLO家族成員進(jìn)行分析，篩選出4個(gè)與月季白粉病互作的MLO候選基因（RhMLO1～RhMLO4）.隨后Qiu等[31]對(duì)RhMLO1-RhMLO4基因進(jìn)行qPCR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在受到白粉病菌侵染不同階段表達(dá)量均明顯上調(diào)的有RhMLO1和RhMLO2基因.Qiu等[32]通過PCR和Southern blot檢測(cè)轉(zhuǎn)基因株系的整合和拷貝數(shù)，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和抗性分析發(fā)現(xiàn)野薔薇的抗性與沉默RhMLO1的積累有明顯的相關(guān)性.本研究通過qRT-PCR分析RgMLO6 和RlMLO7基因在受到白粉菌侵染0、6、12、24 h的表達(dá)量，結(jié)果表明與對(duì)照相比不同時(shí)期的表達(dá)量顯著上調(diào)，這與在葡萄、西瓜中的研究結(jié)果相一致[33-34].

圖4 白粉菌在大花香水月季幼葉上菌絲體生長(zhǎng)情況Fig.4 Mycelial growth of powdery mildew fungi on young leaves of Rosa odorata var.gigantea

圖5 白粉菌在長(zhǎng)尖葉薔薇幼葉上菌絲體生長(zhǎng)情況Fig.5 Mycelial growth of powdery mildew fungi on young leaves of Rose.longicuspis var.longicuspis

應(yīng)用VIGS技術(shù)沉默大花香水月季和長(zhǎng)尖葉薔薇RgMLO6和RlMLO7基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默表達(dá)載體導(dǎo)入后有效抑制了RgMLO6和RlMLO基因的表達(dá)，表明VIGS技術(shù)沉默效果明顯.對(duì)RgMLO6和RlMLO7基因沉默植株（處理組）和對(duì)照組植株進(jìn)行白粉病抗性水平鑒定，結(jié)果表明較對(duì)照組處理組植株的抗性水平都得到提高.顯微鏡觀察對(duì)照組和RgMLO6和RlMLO7基因沉默（處理組）植株葉片在受到白粉菌侵染后菌絲體的生長(zhǎng)情況，整體表現(xiàn)出當(dāng)植株受到白粉菌侵染后基因沉默植株中菌絲體的生長(zhǎng)較對(duì)照組更慢.這些結(jié)果均表明當(dāng)植株內(nèi)源MLO基因的表達(dá)下調(diào)時(shí)，可以有效提高薔薇科植物對(duì)白粉病的抗性.

4 結(jié)論

RgMLO6和RlMLO7基因參與了寄主與白粉菌的互作過程，對(duì)薔薇科植物白粉病起負(fù)調(diào)控作用.