健康與患黑脛病煙株根內(nèi)AMF多樣性和群落結(jié)構(gòu)差異分析

李秋樺，尹 敏，裴 妍，陳 秀，任 禛**，夏體淵，徐勝光

(1.昆明學(xué)院 農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 云南省高校生物炭工程研究中心，云南 昆明 650214；2.云南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650091；3.昆明學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650214)

叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）為球囊菌亞門，是土壤中生物量最大、作用最顯著的有益真菌，可以侵染80%以上的陸生植物[1]，對(duì)植物的生長(zhǎng)生理、營(yíng)養(yǎng)吸收以及土壤生態(tài)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)具有重要作用[2].AMF群落多樣性及物種組成受多種因素影響，宿主、地理位置以及環(huán)境因子等都會(huì)使AMF類型發(fā)生變化[3].董甜等[4]對(duì)長(zhǎng)白山4種赤楊根際AMF群落多樣性進(jìn)行探究發(fā)現(xiàn)，不同品種赤楊根內(nèi)AMF具有一定的宿主專一性，在4個(gè)品種中AMF多樣性存在差異.曹敏等[5]發(fā)現(xiàn)重慶地區(qū)不同種植基地的茅蒼術(shù)根際AMF群落結(jié)構(gòu)不同.蔡曉布等[6]發(fā)現(xiàn)土壤活性有機(jī)碳含量會(huì)顯著影響植物AMF的發(fā)育、分布與侵染.目前關(guān)于病原菌侵染對(duì)植物AMF群落多樣性的影響鮮有報(bào)道.AMF在植物抗病方面具有巨大潛力，在植物根際與病原菌競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)位點(diǎn)是其提高植物對(duì)土傳病害抗性的重要機(jī)制之一[7]，然而土傳病害的存在有可能影響AMF對(duì)宿主的侵染，進(jìn)而影響AMF對(duì)植物的功能作用.進(jìn)一步探明AMF-植株-土傳病害間的相互關(guān)系，可為AMF在緩解植物土傳病害方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ).煙草（Nicotiana tabacumL.）是茄科煙屬植物，在經(jīng)濟(jì)作物中占有重要地位.AMF可與煙草建立互惠共生體[8]，其在煙草生長(zhǎng)生理方面具有積極作用，同時(shí)部分AMF可以緩解煙草病害.Subhashini等[9]研究發(fā)現(xiàn)，AMF可以與腐霉屬產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，占據(jù)侵染位點(diǎn)，從而提高煙草抗病能力.劉先良等[10]在煙草中分別接種兩類AMF菌劑（Glomus intraradices和Glomus mosseae），結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種菌劑均可緩解煙草青枯病的發(fā)生.Giovannetti等[11]對(duì)煙草根腐病研究發(fā)現(xiàn)，接種Glomus monosporum后可以提高煙草對(duì)根腐病的抵抗能力，因此AMF在煙草抗病方面具有積極作用.目前AMF在農(nóng)作物中的抗病應(yīng)用仍處于起步階段，尚未突破對(duì)其大規(guī)模純培養(yǎng)的技術(shù)難題，同時(shí)AMF的防病效果會(huì)受到pH、溫濕度以及土壤養(yǎng)分狀況等因素條件的影響，且在生產(chǎn)中這些條件難以控制，這些因素極大地限制了AMF在農(nóng)作物抗病方面的開發(fā)與利用[12-13].寄生疫霉（Phytophthora nicotianae）是誘發(fā)煙草黑脛病的主要土傳病害，其病原菌可以通過厚垣孢子和休眠菌絲在發(fā)病區(qū)域長(zhǎng)期存在，并且依靠土壤和病殘?bào)w進(jìn)行傳播，危害嚴(yán)重且難以根治[14].鑒于AMF在土傳病害防治方面的作用，探究煙株根內(nèi)AMF-土傳病害-根際土壤間的相互作用具有重要意義.研究以云南煙草主栽品種K326和云煙87作為研究對(duì)象，對(duì)兩個(gè)品種健康與患黑脛病煙株根內(nèi)AMF侵染特征進(jìn)行探究，分析感染黑脛病對(duì)煙株根內(nèi)AMF侵染率和群落多樣性的影響，為進(jìn)一步摸清AMF與煙株共生關(guān)系建立的影響因素奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 樣本采集樣本采集時(shí)間為2020年8月，供試煙草品種為K326和云煙87，由云南省煙草公司紅河州分公司橄欖坡煙草綠色防控示范基地提供，該地區(qū)海拔約1 451 m，地理坐標(biāo)為103°27′34″E，24°22′35″N，種植K326和云煙87的煙田之間距離約200 m.在K326煙田（病情指數(shù)約為38.86%）中隨機(jī)選擇3株健康煙株和3株患黑脛病煙株，健康與患黑脛病煙株如圖1所示，重復(fù)煙株間距離5～10 m.取出完整煙株后，立刻帶回實(shí)驗(yàn)室，對(duì)煙株根及根際土壤進(jìn)行采集，首先將附著在根的根際土壤抖落至密封袋中保存?zhèn)溆?，之后?duì)煙株根部進(jìn)行清洗，保存?zhèn)溆?健康煙株（K326-JK）標(biāo)記為K326-JK-1、K326-JK-2和K326-JK-3；患病煙株(K326-B)標(biāo)記為K326-B-1、K326-B-2和K326-B-3；云煙87（病情指數(shù)約為42.67%）根系和根際土壤取樣方法同K326，健康煙株（Y87-JK）標(biāo)記為Y87-JK-1、Y87-JK-2和Y87-JK-3；患病煙株（Y87-B）標(biāo)記為Y87-B-1、Y87-B-2和Y87-B-3.樣品存放于-80 ℃?zhèn)溆?

圖1 健康與患黑脛病煙株Fig.1 Health and black shank tobacco

1.2 土壤理化性質(zhì)檢測(cè)對(duì)樣品土壤進(jìn)行理化性質(zhì)的監(jiān)測(cè)：pH值采用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定；有機(jī)質(zhì)測(cè)定采用重鉻酸鉀法；土壤全氮測(cè)定采用凱氏定氮法；堿解氮測(cè)定采用堿解擴(kuò)散法；土壤全磷測(cè)定采用高氯酸-硫酸法；速效磷測(cè)定采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法；土壤全鉀測(cè)定采用堿溶-原子吸收分光光度計(jì)法；速效鉀測(cè)定采用乙酸銨-火焰光度計(jì)法.

1.3 菌根侵染狀況和土壤孢子密度測(cè)定菌根侵染狀況采用Koske等[15]的方法進(jìn)行檢測(cè)，將煙株根部剪成1 cm的根段放入試管中，加入2.5%的KOH，煮沸1 h后倒掉堿液加10% H2O2漂白30 min，自來水沖洗后加1%鹽酸酸化1 h，之后加入0.05%的曲利苯藍(lán)在90 ℃水浴20 min.取出浸泡于乳酸甘油中脫色12 h，取出根段制片鏡檢.將數(shù)據(jù)輸入Mycocalc軟件，對(duì)菌根侵染數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算.土壤孢子密度測(cè)定采用濕篩-傾析法和蔗糖離心法進(jìn)行分離，在解剖鏡下觀察統(tǒng)計(jì).

1.4 根部樣品測(cè)序稱取煙草根部樣品各2 g，用75%乙醇滅菌1 min后浸泡在3% NaClO中消毒2 min，最后用去離子水洗干凈，置于無菌研缽中，加入適量液氮，研磨成粉末.采用CTAB法[16]對(duì)煙草根部總DNA進(jìn)行提??；運(yùn)用巢式PCR擴(kuò)增AMF 18S rRNA基因部分片段，PCR反應(yīng)采用1×T3 Super PCR Mix（擎科生物），按照說明書對(duì)樣品及引物進(jìn)行添加，反應(yīng)體系為25 μL，第1輪引物為AML1（5′-ATCAACTTTCGATGGTAGGATAGA-3′）和AML2（5′-GAACCCAAACACTTTGGTTTCC-3′），第2輪引物為AMV4-5NF（5′-AAGCTCGTAGT TGAATTTCG-3′）和AMDGR（5′-CCCAACTATCCC TATTAATCAT-3′），PCR擴(kuò)增程序均為95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min.擴(kuò)增產(chǎn)物送至美吉生物公司進(jìn)行Illumina Miseq高通量二代測(cè)序；并根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析.

1.5 數(shù)據(jù)處理使用fastp軟件對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控，并應(yīng)用FLASH軟件進(jìn)行拼接；使用UPARSE軟件，根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類并剔除嵌合體，并選取每個(gè)中最長(zhǎng)的OTU序列作為代表序列；利用RDP classifier對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)maarjam081/AM數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置比對(duì)閾值為70%；利用Mothur（version v.1.30）軟件計(jì)算樣品α多樣性指數(shù)；偏最小二乘法判別分析應(yīng)用R語言mixOmics包中plsda分析和作圖；Venn圖使用R語言工具統(tǒng)計(jì)和作圖；使用Excel 2003軟件對(duì)各分類單元數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；采用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；應(yīng)用Canoco 4.5軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行RDA分析.

1.6 序列登錄K326-JK-1、K326-JK-2、K326-JK-3、K326-B-1、K326-B-2、K326-B-3、Y87-JK-1、Y87-JK-2、Y87-JK-3、Y87-B-1、Y87-B-2和Y87-B-3上傳在NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)中的登錄號(hào)分別為SRR13091087、 SRR13091086、 SRR13091083、SRR13091082、 SRR13091081、 SRR13091080、SRR13091079、 SRR13091078、 SRR13091077、SRR13091076、SRR13091085、SRR13091084.

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)煙株土壤理化性質(zhì)分析見表1.整體來看，兩個(gè)煙草品種根際土壤pH值均呈酸性，其中K326健康土壤酸性最強(qiáng)，達(dá)到5.41.各煙草品種根際土壤有機(jī)質(zhì)含量為中等水平，而云煙87患病樣品中的含量更為豐富.所有樣品根際土壤的全氮質(zhì)量比差異不顯著，但K326患病土壤樣品的堿解氮質(zhì)量比最高，顯著高于其它樣品.土壤磷質(zhì)量比結(jié)果表明，K326健康樣品質(zhì)量比最高，并顯著高于云煙87患病樣品；K326健康樣品根際土壤鉀質(zhì)量比亦最高，其全鉀質(zhì)量比顯著高于其它樣品.

分析健康與患病樣品根際土壤間理化性質(zhì)差異，從根際土壤的全磷和速效磷質(zhì)量比的結(jié)果可以看出(表1)，兩個(gè)煙草品種患病樣品均明顯低于健康樣品，其中云煙87患病樣品中全磷質(zhì)量比顯著低于健康樣品，表明感染黑脛病可降低煙草根際土壤磷質(zhì)量比.此外，K326患病樣品土壤堿解氮質(zhì)量比顯著高于健康樣品，但其全鉀和速效鉀含量均顯著低于健康樣品，而云煙87患病煙草根際土壤pH值和全鉀質(zhì)量比均顯著高于健康樣品，可見感染黑脛病對(duì)土壤全鉀質(zhì)量比的影響與煙草品種相關(guān).

2.2 煙草根內(nèi)AMF侵染狀況及土壤孢子密度對(duì)煙株根部?jī)?nèi)生菌根的侵染狀況進(jìn)行檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)兩個(gè)品種健康和患病煙株根內(nèi)均存在AMF的侵染（表2），侵染率均達(dá)到70%以上.其中K326健康煙株侵染率最高，達(dá)到82.22%；云煙87患病煙株侵染率最低，僅為70%.整體來看，兩個(gè)煙草品種健康和感病植株根內(nèi)間菌根侵染率、侵染強(qiáng)度和叢枝豐富度均無顯著差異，但患病煙草樣品AMF的侵染狀況低于健康煙草樣品.此外，孢子密度結(jié)果表明（表2），K326和云煙87健康樣品孢子密度均高于患病樣品，此變化趨勢(shì)與菌根侵染狀況結(jié)果相一致.根據(jù)結(jié)果可以推測(cè)，由于病原菌與AMF在煙株根內(nèi)和根際土壤中競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)位點(diǎn)，影響到煙株根際土壤AMF孢子的單位量，進(jìn)而降低其對(duì)煙株根內(nèi)的侵染.K326和云煙87健康及患病植株根系內(nèi)AMF的侵染水平均未達(dá)到顯著水平，可能是因?yàn)樵诓≡秩局埃珹MF對(duì)煙株根系的侵染已達(dá)到較高水平，占據(jù)了穩(wěn)定的生態(tài)位，導(dǎo)致后面病原菌侵染對(duì)根內(nèi)AMF的變化影響較小.

表1 K326、云煙87健康和患病樣品根際土壤理化性質(zhì)Tab.1 Physicochemical properties of rhizosphere soil from healthy and diseased samples of K326 and Yunyan87

表2 K326和云煙87健康和患病樣品AMF侵染率與孢子密度Tab.2 Colonization rate and spore density of AMF from healthy and diseased samples of K326 and Yunyan87

2.3 煙株根部AMF高通量測(cè)序結(jié)果分析

2.3.1 序列統(tǒng)計(jì)分析 K326健康、K326患病、云煙87健康和云煙87患病煙株根部高通量測(cè)序結(jié)果經(jīng)過質(zhì)控并去除嵌合體后（表3），分別獲得的原始序列為64 285、70 561、71 911條和71 742條，排除線粒體和葉綠體干擾后得到的有效序列分別為62 938、68 947、70 524條和70 142條，按照97%相似性進(jìn)行歸類后分別獲得629、592、620和727個(gè)OTUs.其中，云煙87健康煙株根內(nèi)測(cè)得的AMF有效序列數(shù)最多，K326健康煙株根內(nèi)AMF有效序列數(shù)最少，云煙87患病煙株根內(nèi)AMF的OTUs高于其它樣品，K326患病煙株根內(nèi)AMF的OTUs最低.從整體來看，云煙87根內(nèi)AMF的有效序列和OTUs數(shù)量均高于K326.根據(jù)Shannon指數(shù)稀釋曲線（圖2）可以看出，當(dāng)測(cè)序深度大于10 000時(shí)，所有樣品的稀釋曲線逐漸趨于平行，表明測(cè)序數(shù)量足夠，種群多樣性不再變化，測(cè)序結(jié)果可真實(shí)地反映煙草根內(nèi)AMF群落組成.

表3 K326和云煙87健康和患病樣品根內(nèi)AMF群落測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果及相關(guān)序列指數(shù)Tab.3 The statistical results of sequencing data of AMF community in roots between healthy and diseased samples of K326 and Yunyan87

圖2 Shannon指數(shù)稀釋曲線Fig.2 Shannon index dilution curve

2.3.2 煙草根內(nèi)AMF多樣性指數(shù)分析 多樣性指數(shù)結(jié)果（表4）表明各煙草樣品根部AMF的Ace、Chao、Shannon和Simpson指數(shù)均無顯著差異.云煙87患病樣品AMF的Ace和Chao指數(shù)最高，說明其根內(nèi)AMF較為豐富，K326健康樣品AMF的Shannon指數(shù)最高，Simpson指數(shù)最低，說明其根內(nèi)的多樣性最高.總體來看，云煙87品種的AMF豐富度較高，多樣性較低，K326樣品的AMF多樣性較高而豐富度較低.同時(shí)各個(gè)樣品中AMF的OTU覆蓋率（Coverage）均高于99%，說明本次測(cè)序結(jié)果可靠.

2.3.3 煙草根內(nèi)AMF群體聚類分析 基于偏最小二乘回歸模型對(duì)樣本進(jìn)行PLS-DA（partial least squares discriminant analysis）分析.如圖3所示，在不同品種中患病與健康煙株AMF群落存在差異，且K326與云煙87健康煙株的AMF群落有較高的相似性，感病煙株根內(nèi)AMF群落相似性較高.

2.3.4 煙草AMF種群歸類分析 排除不可歸類的類型后對(duì)AMF種群組成進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表5），發(fā)現(xiàn)煙草根內(nèi)AMF均為Glomeromycetes（球囊菌綱）.在目水平，AMF歸屬于4個(gè)目，包括Archaeosporales（原囊霉目）、Diversisporales（多孢囊霉目）、Glomerales（球囊霉目）和Paraglomerales（類球囊霉目）；在科水平，AMF歸屬于5個(gè)科，包括Archaeosporaceae（原囊霉科）、Diversisporaceae（多孢囊霉科）、Gigasporaceae（巨孢囊霉科）、Glomeraceae（球囊霉科）和Paraglomeraceae（類球囊霉科）.

表4 多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)Tab.4 Diversity index statistics

圖3 煙株根內(nèi)AMF群落聚類分析Fig.3 The cluster analysis of AMF community in root of tobacco.

對(duì)兩個(gè)品種煙株健康和患病樣品AMF種群在屬水平上進(jìn)行歸類，如圖4所示，排除不可歸類的類型后在各個(gè)樣品中豐度水平前3的AMF均為Paraglomus（類球囊霉屬，33.73%～57.86%）、Glomus（球囊霉屬，26.42%～54.41%）和Diversispora（多孢囊霉屬，11.59%～21.29%），但相對(duì)豐度不同.此外，云煙87健康煙株中Glomus占比高于Paraglomus，其余樣品均為Paraglomus占比高于Glomus.Gigaspora和Scutellospora僅存在于K326健康煙株中，分別占比4.46%和0.39%.可見，不同品種煙株根內(nèi)AMF類型存在差異，患病與健康煙株根內(nèi)AMF類型亦存在差異.

2.3.5 煙株根內(nèi)AMF的OTU分析 通過OTUs聚類繪制的Venn圖（圖5）可較為直觀地看出煙株根內(nèi)AMF的OTUs組成情況.所有樣品中共存在1 655個(gè)OTUs，其中共有的OTUs為558個(gè)，占比為33.72%.云煙87患病煙株根內(nèi)獨(dú)有的OTUs較多，約占全部的12.93%；其次為K326和云煙87健康煙株，分別占比8.04%和7.92%；患病的K326煙株根內(nèi)獨(dú)有的OTUs較少，約占全部的7.67%.整體來看，云煙87所含AMF的OTUs多于K326，在K326中健康煙株所含OTUs高于患病煙株，而云煙87中患病煙株存在的OTUs高于健康煙株.

表5 煙株根內(nèi) AMF 種群組成統(tǒng)計(jì)Tab.5 The AMF population composition in tobacco root

圖4 AMF在屬水平的相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance ratio of AMF at genus level

圖5 K326和云煙87健康與患病煙株之間獨(dú)有和共有的OTU數(shù)Fig.5 The number that unique and shared OTUs between healthy and diseased tobacco strains of K326 and Yunyan87

2.4 土壤理化性質(zhì)對(duì)煙草AMF的影響應(yīng)用冗余度分析（redundancy analysis，RDA）可探究煙草根際土壤理化性質(zhì)與AMF侵染特征的相關(guān)性.根際土壤理化性質(zhì)對(duì)AMF多樣性指數(shù)影響的冗余分析結(jié)果顯示（圖6（a）），第1排序軸解釋信息量達(dá)70.3%，第2排序軸解釋信息量達(dá)11.7%.從整體來看pH為AMF多樣性的主要影響因子，其次為全氮和有機(jī)質(zhì).相關(guān)性結(jié)果表明土壤全磷、速效磷、全鉀和速效鉀質(zhì)量比與Shannon和Chao指數(shù)呈正相關(guān)，其它指標(biāo)與兩指數(shù)均呈負(fù)相關(guān).其中，全磷、速效磷對(duì)Shannon指數(shù)影響較大，而全鉀和速效鉀對(duì)Chao指數(shù)影響較大.全氮、堿解氮、有機(jī)質(zhì)和pH與群落多樣性Simpson指數(shù)呈正相關(guān)，其它土壤指標(biāo)與之呈負(fù)相關(guān)；堿解氮、有機(jī)質(zhì)和pH與均勻度Ace指數(shù)呈正相關(guān)，其它指標(biāo)與其呈負(fù)相關(guān).可見，根際土壤理化性質(zhì)對(duì)AMF多樣性指數(shù)產(chǎn)生影響，但不同土壤理化指標(biāo)對(duì)各AMF多樣性指數(shù)影響并不一致.

根際土壤理化性質(zhì)對(duì)煙草AMF侵染狀況影響的冗余分析見圖6（b），兩軸累積解釋信息量達(dá)69.8%.從整體來看全鉀為AMF侵染狀況的主要影響因子，其次為速效磷和全磷.相關(guān)性結(jié)果表明全氮、堿解氮、有機(jī)質(zhì)和pH值與AMF侵染率（F）呈正相關(guān)，其它土壤指標(biāo)與之呈負(fù)相關(guān)；全氮、全鉀、速效鉀、全磷和速效磷均與菌根侵染密度（M）和從枝豐富度（A）呈正相關(guān)；pH和全磷含量與土壤孢子密度呈正相關(guān)，其余根際土壤性質(zhì)均與其為負(fù)相關(guān).綜上，根際土壤理化性質(zhì)與土壤中的AMF孢子密度及煙草根內(nèi)的AMF侵染狀況均存在一定的相關(guān)性，但其對(duì)AMF的侵染狀況的影響更為明顯.

圖6 煙株根際土壤理化性質(zhì)對(duì)AMF多樣性（a）、侵染狀況（b）和屬水平相對(duì)豐度（c）影響的RDA分析Fig.6 RDA analysis about effects of physical and chemical properties of tobacco rhizosphere soil on AMF diversity(a) infection status (b) and relative abundance at genus level (c)

根際土壤理化性質(zhì)對(duì)煙草AMF在屬水平相對(duì)豐度影響的結(jié)果見圖6（c）.從整體來看速效鉀為AMF屬水平相對(duì)豐度的主要影響因子，其次為全鉀和速效磷.相關(guān)性結(jié)果表明Diversispora與速效鉀和堿解氮呈正相關(guān)，與其它土壤理化性質(zhì)呈負(fù)相關(guān)；Glomus與速效磷、全磷和有機(jī)質(zhì)呈正相關(guān)；Archaeospora與全磷、速效磷、pH和有機(jī)質(zhì)呈正相關(guān)；Gigaspora和Scutellospora與全鉀、全氮、pH、全磷、速效磷和有機(jī)質(zhì)呈正相關(guān)，與速效鉀和堿解氮呈負(fù)相關(guān)；Paraglomus與有機(jī)質(zhì)呈負(fù)相關(guān)，與其它指標(biāo)均呈正相關(guān).可見煙草AMF的群落組成與土壤理化性質(zhì)密切相關(guān)，其中土壤中鉀含量影響最為明顯.

3 討論

3.1 煙株根內(nèi)存在豐富的AMF資源AMF作為一種寄生真菌，可以通過與植物根部結(jié)合在土壤中形成龐雜的菌絲網(wǎng)絡(luò)，使植物對(duì)土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收更加具有優(yōu)勢(shì)[17].AMF在提高煙草生長(zhǎng)生理以及抗病抗逆方面具有巨大潛力[18-20]，探究煙株根部AMF類型具有重要意義，但目前對(duì)煙草AMF多樣性的研究相對(duì)較少.李昕竺[21]使用DGGE法對(duì)煙草根部AMF多樣性進(jìn)行檢測(cè)，共獲得28個(gè)AMF類型.本實(shí)驗(yàn)室先前應(yīng)用分子克隆文庫(kù)構(gòu)建法對(duì)4個(gè)煙草品種根部AMF多樣性進(jìn)行調(diào)查，共檢測(cè)到21個(gè)OTUs[22]，其中云煙87、K326分別檢測(cè)到9個(gè)和8個(gè)OTUs.目前已有研究采用傳統(tǒng)分子生物學(xué)手段在煙草根內(nèi)只獲得較少的AMF類型，但本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)煙草K326和云煙87根內(nèi)AMF多樣性進(jìn)行檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)了極為豐富的AMF資源.在兩個(gè)煙草品種根內(nèi)共得到1 655個(gè)OTUs，其中，在K326中發(fā)現(xiàn)了1 240個(gè)OTUs，在云煙87檢測(cè)到1 348個(gè)OTUs.可見，應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)可打破傳統(tǒng)分子生物學(xué)手段的局限，檢測(cè)到更多的AMF類型.同時(shí)與K326相比，云煙87根內(nèi)AMF種類更為豐富，這與本實(shí)驗(yàn)室先前研究結(jié)果相一致[22].此外，本研究所測(cè)得的OTUs在可歸類的分類階元中歸屬于1綱4目5科6屬.整體來看，在本研究的煙草根部樣品中，排除不可歸類的AMF，Paraglomus相對(duì)豐度最高，占總AMF的42.56%；其次為Glomus，占比39.64%，該結(jié)果與先前報(bào)道的Glomus為煙草優(yōu)勢(shì)AMF類型的結(jié)果并不同[21-22]，這可能與不同檢測(cè)方法敏感度不同有關(guān).

3.2 患 病 與 健 康 煙 株 間 的 根 際 土 壤 和 根 內(nèi)AMF存在差異植株根部在受到病原菌侵染時(shí)AMF可與病原物產(chǎn)生強(qiáng)烈競(jìng)爭(zhēng)，阻礙病原菌進(jìn)入植株[23]，同時(shí)病原菌的存在有可能對(duì)AMF孢子及其對(duì)植物根部的定殖產(chǎn)生影響.本研究結(jié)果表明，K326和云煙87健康煙株根際土壤孢子密度高于患病煙株，這可能由于患病植株根際土壤中存在大量的病原菌，這些病原菌可與AMF孢子爭(zhēng)奪生存空間及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[24]，導(dǎo)致AMF的生存環(huán)境受到破壞，進(jìn)而降低了AMF的孢子數(shù)量.本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，患病煙株根內(nèi)AMF的菌根侵染率和菌根侵染密度明顯下降，推測(cè)可能的直接原因除與根際土壤中AMF孢子密度降低相關(guān)外，還與病原菌入侵根部與AMF競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)位點(diǎn)相關(guān)[25]，在雙重直接因素影響下導(dǎo)致AMF對(duì)患病煙株根部的定殖下降.

此外，本研究還證實(shí)，感染黑脛病會(huì)改變煙株根內(nèi)AMF的侵染類型.一方面，煙株患病后根內(nèi)AMF的OTUs數(shù)量會(huì)發(fā)生變化，K326中健康煙株所含有的OTUs高于患病煙株，而云煙87健康煙株所含類型低于患病煙株，感染黑脛病對(duì)煙株根內(nèi)AMF種類數(shù)量的影響與煙草品種有關(guān).另一方面，患黑脛病亦會(huì)引起煙株根內(nèi)AMF類型發(fā)生改變，在K326健康煙株根內(nèi)存在Gigaspora和Scutellospora的AMF，而患病煙株并未檢測(cè)到；云煙87的健康煙株與患病煙株根內(nèi)AMF最主要屬類型出現(xiàn)不同，健康煙株主要屬為Glomus，而Paraglomus為患病煙株的主要屬.非常有趣地是，本研究發(fā)現(xiàn)盡管患病對(duì)K326和云煙87根內(nèi)AMF帶來的影響不一致.但在群體聚類分析中發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)品種的健康植株根內(nèi)AMF群落結(jié)構(gòu)具有較高的相似性，推測(cè)患病后可改變了煙草根圈微生態(tài)環(huán)境，導(dǎo)致根內(nèi)AMF群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變.可見，在植煙大田中，土傳病害-煙株根內(nèi)-AMF之間的關(guān)系較為復(fù)雜.本研究只能初步證實(shí)，感染黑脛病能夠改變煙株根際的AMF孢子密度及其對(duì)煙株的侵染特征，引起煙株根內(nèi)AMF群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，但在煙株根圈黑脛病及AMF之間存在著怎樣的動(dòng)態(tài)關(guān)系？哪些AMF在煙株遭受黑脛病侵襲后能還能更好地侵染根部？以及感染黑脛病是否影響到AMF對(duì)煙株的抗病能力還有待進(jìn)一步證實(shí).

3.3 土壤理化性質(zhì)對(duì)煙株根際和根內(nèi)AMF產(chǎn)生影響AMF作為土壤習(xí)居菌，主要存在于植物根內(nèi)及根際土壤中，與土壤環(huán)境關(guān)系密切，其孢子密度及其對(duì)植物的侵染水平受到多種因素的影響，其中土壤養(yǎng)分的影響最為重要[26].本研究發(fā)現(xiàn)，土壤全鉀質(zhì)量比是影響AMF孢子密度及對(duì)煙株侵染狀況的主要驅(qū)動(dòng)因子，其次為速效磷質(zhì)量比和全磷質(zhì)量比.土壤中的全鉀、速效鉀、全磷和速效磷質(zhì)量比均與菌根侵染密度和從枝豐富度呈正相關(guān)，且土壤全磷質(zhì)量比與土壤孢子密度呈正相關(guān).鉀和磷同為土壤中的大量元素，但磷元素與AMF的關(guān)系更為密切[27].大量研究結(jié)果表明，土壤磷質(zhì)量比過高往往會(huì)抑制AMF的生長(zhǎng)、發(fā)育和功能[28]，降低了AMF的根內(nèi)侵染能力和根外菌絲密度[29].這與本研究結(jié)果不同，可能是本研究采樣煙田土壤中的磷質(zhì)量比背景值不高，未達(dá)到抑制AMF生長(zhǎng)的上限.在一定范圍內(nèi)增加土壤全磷和速效磷含量可增加土壤中AMF的孢子密度，并能促進(jìn)AMF與煙株形成更好地侵染.

植物根內(nèi)AMF多樣性及群落結(jié)構(gòu)可受到宿主植物、土壤因子、地理位置以及氣候條件等因素的影響[30]，其中土壤理化性質(zhì)的影響較為廣泛[31].本研究發(fā)現(xiàn)土壤pH值對(duì)煙株根內(nèi)AMF多樣性影響最大，且與AMF多樣性呈負(fù)相關(guān).目前土壤pH值被認(rèn)為是影響AMF多樣性非常重要的土壤因子，受到越來越多研究者的關(guān)注.李雪靜等[32]發(fā)現(xiàn)土壤pH是影響荒漠和草原生態(tài)系統(tǒng)AMF多樣性的最主要驅(qū)動(dòng)因子.代心靈等[33]研究認(rèn)為土壤pH對(duì)內(nèi)蒙古典型草原的AMF影響最為明顯，可顯著影響其群落結(jié)構(gòu).這些研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致，均證實(shí)了pH在AMF生長(zhǎng)和繁殖環(huán)境中的重要性.我們認(rèn)為AMF可能是一類對(duì)酸堿環(huán)境比較敏感的微生物，pH值的高低可直接影響AMF孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)、孢子繁殖[34-35]以及種類分布[36].

植株AMF群落組成會(huì)受到土壤理化性質(zhì)的影響，眾多研究表明磷元素為AMF群落組成的主要影響因子.汪志琴等[37]對(duì)免耕覆蓋栽培管理下的冬麥根部AMF研究發(fā)現(xiàn)，影響優(yōu)勢(shì)屬豐度的土壤理化性質(zhì)主要為土壤速效磷與全磷.王化秋等[38]對(duì)石山香根草的AMF研究發(fā)現(xiàn)，速效磷質(zhì)量比是AMF群落的主要影響因子.但本研究與上述結(jié)果不同，發(fā)現(xiàn)速效鉀是影響煙株根系A(chǔ)MF屬水平相對(duì)豐度的主要影響因子，其次為全鉀和速效磷.可見，鉀與磷均為土壤中的大量元素，其對(duì)植物AMF群落的影響亦不可忽略.

3.4 土傳病害對(duì)煙株AMF的影響與其改變土壤理化性質(zhì)相關(guān)土壤理化性質(zhì)與植物是否感病之間存在密切關(guān)系，土傳病害會(huì)使土壤營(yíng)養(yǎng)平衡失調(diào)[39].丁亞茹等[40]分析了四川涼山州成熟期健康與易感病煙田土壤理化性質(zhì)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)盡管全鉀和速效鉀指標(biāo)在兩種煙田土壤中無顯著差異，但全鉀和速效鉀、全氮和速效氮等指標(biāo)均表現(xiàn)為易感病煙田>健康煙田.陳海念等[41]研究結(jié)果表明，患病煙田土壤中的全氮和速效氮、全磷和速效磷、全鉀和速效鉀的含量均大于健康煙田.已有報(bào)道都認(rèn)為對(duì)比健康煙田，感染病害可提升土壤的養(yǎng)分含量.本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)品種健康與患病根際土壤的全氮與堿解氮含量均呈現(xiàn)患病>健康，這與上述研究結(jié)果一致.可能的原因是由于煙草黑脛病為維管束系統(tǒng)性病害，患病后煙株根部和莖基部的維管束壞死[42]，氮元素?zé)o法從植株地下部運(yùn)輸?shù)降厣喜?，使得在患病土壤中殘留量較大.

但對(duì)于磷和鉀元素，本研究結(jié)果與上述報(bào)道并不一致.本文發(fā)現(xiàn)煙草K326和云煙87根際土壤的全磷和速效磷質(zhì)量比均呈現(xiàn)為健康>患病，這與前人對(duì)煙田的研究結(jié)果相反.Bian等[43]報(bào)道感染根銹腐病使得人參根際土壤中全磷和速效磷質(zhì)量比明顯降低，這與本研究結(jié)果一致.同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)全鉀和速效鉀在兩個(gè)品種患病與健康煙株根際土壤中雖存在顯著差異，但在兩個(gè)品種中表現(xiàn)不同，其中K326健康樣品全鉀和速效鉀質(zhì)量比顯著高于患病樣品，而云煙87則表現(xiàn)為健康低于患病.在感染根銹腐病人參的根際土壤中，其全鉀和速效鉀的質(zhì)量比明顯降低[43]，這與本研究煙草K326的結(jié)果一致.可見，關(guān)于感病對(duì)植株根際土壤理化性質(zhì)的影響并無定論.土壤-病害-植物間關(guān)系復(fù)雜，并且相關(guān)研究較少，但我們可以肯定的是植株感染病害與根際土壤養(yǎng)分含量關(guān)聯(lián)密切，土壤養(yǎng)分含量的改變和失衡也可能是引發(fā)或加重植株病害的原因之一.

AMF在促進(jìn)植物對(duì)磷素吸收方面具有積極作用，同時(shí)土壤中磷元素質(zhì)量比與AMF的群落結(jié)構(gòu)和豐度關(guān)聯(lián)密切[44-46].本研究在RDA分析中表明土壤全磷和速效磷含量與菌根侵染密度和從枝豐富度呈正相關(guān)，且患病后煙株根內(nèi)AMF侵染率下降，根際土壤孢子密度降低，可以推測(cè)煙株感染黑脛病可通過改變土壤中磷含量進(jìn)而對(duì)根際和根內(nèi)AMF產(chǎn)生影響.綜上所述，由于土壤理化性質(zhì)會(huì)影響AMF的多樣性，煙株感染黑脛病可引發(fā)土壤理化性質(zhì)發(fā)生改變，從而間接地對(duì)AMF群落產(chǎn)生影響.

煙草根際土壤富含豐富的AMF資源，病原菌和土壤理化性質(zhì)均與AMF群落組成相關(guān).煙株感染黑脛病會(huì)使土壤理化性質(zhì)發(fā)生改變，進(jìn)而對(duì)根內(nèi)AMF多樣性產(chǎn)生影響.可見，病原菌的侵染可直接或間接地影響AMF群落結(jié)構(gòu)，同時(shí)AMF在煙草根內(nèi)定殖亦會(huì)對(duì)病原菌產(chǎn)生一定地拮抗作用[47].深入研究AMF-土傳病害-土壤理化性質(zhì)-煙株根部的相互關(guān)系，可為后續(xù)AMF在緩解煙草土傳病害方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ).