云南江城雪茄煙根結(jié)線蟲病的病原鑒定及生物源氨氣熏蒸的防治效果研究

馬桂妹，譚 濤，楊 東，劉 通，莫明和，王 揚，姜方榮，張應(yīng)和，趙 華，劉劍金**

(1.云南大學(xué) 省部共建云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，云南 昆明 650091；2.云南省煙草公司普洱市公司，云南 普洱 665000；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)省部共建云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，云南 昆明 650201)

由根結(jié)線蟲（Meloidogynespp.）侵染引起的根結(jié)線蟲病是多種作物的重要土傳病害.全球報道的根結(jié)線蟲種類有90余種，在中國分布的有50余種，其中危害最重的有4種：南方根結(jié)線蟲（M.incognita）、北方根結(jié)線蟲（M.hapla）、花生根結(jié)線蟲（M.arenaria）和爪哇根結(jié)線蟲（M.javanica）[1].全世界每年因根結(jié)線蟲造成的煙草產(chǎn)量損失估計為15%[2].根結(jié)線蟲病是中國烤煙種植中的重要病害之一，目前，煙草根結(jié)線蟲病除東北煙區(qū)發(fā)病較輕外，在其他16個產(chǎn)煙省區(qū)均有嚴重危害的發(fā)生報道，每年造成煙草經(jīng)濟損失約有 6 000萬元[3].危害中國烤煙的根結(jié)線蟲種類主要為南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲、北方根結(jié)線蟲和象耳豆根結(jié)線蟲.其中，南方根結(jié)線蟲為中國大多數(shù)煙區(qū)的優(yōu)勢種，分布廣泛；花生根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲為區(qū)域性的優(yōu)勢種[4].

雪茄煙是一種用原料煙葉經(jīng)過晾干、發(fā)酵、陳化等處理制作而成的特殊煙制品，具有雪茄香型、香氣濃郁、吃味濃、勁頭大、煙氣呈堿性、焦油與煙堿比值小的煙質(zhì)特點[5].雪茄煙葉主要在古巴、印度尼西亞、美國、多米尼加、洪都拉斯、巴西、墨西哥、牙買加和尼加拉瓜等國廣泛種植.據(jù)統(tǒng)計，2015年上半年，中國卷煙生產(chǎn)與銷售量分別下降3.11%和2.23%，但中國雪茄煙卻逆勢上漲，產(chǎn)量增長37.2%，銷量增長82%，銷售額增長55.4%，雪茄煙已成為中國煙草行業(yè)新的經(jīng)濟增長點[6].制作雪茄的煙葉按其在產(chǎn)品中的用途可分為茄衣、茄套和茄芯，國內(nèi)也習(xí)慣稱作外包皮、內(nèi)包皮和芯葉.優(yōu)質(zhì)的雪茄煙葉是制作高品質(zhì)雪茄的基礎(chǔ)，目前國產(chǎn)優(yōu)質(zhì)雪茄煙葉嚴重匱乏，茄衣和茄套全部依靠進口.近年來，中國引進多種雪茄煙葉品種，在海南、四川、湖北和云南等省大面積試種，中國特色的雪茄煙產(chǎn)業(yè)正在逐步形成[7].云南省普洱市具有種植雪茄煙葉的優(yōu)良地理氣候條件，土壤以沙粒和粘粒為主，是中國發(fā)展優(yōu)質(zhì)雪茄原料最具潛在優(yōu)勢的產(chǎn)區(qū)之一.云南省煙草公司普洱市公司2019—2022年在江城縣、寧洱縣等地共開發(fā)種植雪茄煙葉約208 hm2(3 120余畝)，均不同程度地發(fā)生根結(jié)線蟲病.由于種植茄衣品種需要搭建遮陰網(wǎng)棚，投入成本較高，往往會在同一塊土地上連作多年，導(dǎo)致根結(jié)線蟲病逐年加重，根結(jié)線蟲病很有可能成為阻礙普洱煙區(qū)雪茄煙葉產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要病害之一.然而，目前國內(nèi)外對雪茄煙葉根結(jié)線蟲病的病原鑒定、種類組成、病理流行規(guī)律等研究未見報道.

“生物熏蒸（biofumigation）”一詞最早出現(xiàn)在利用十字花科（Brassicaceae）植物熏蒸土壤進而抑制土傳病害的研究中，十字花科植物中的芥子油甙在芥子酶的催化下水解并釋放出抑制病原菌的異硫氰酸酯類化合物，對控制土傳病害有良好防效[8].利用各種植物廢棄物產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)熏蒸土壤已被證明對根結(jié)線蟲病具有良好的防效，并在很多國家廣泛推廣應(yīng)用[9].氨氣（NH3）對多種植物病原線蟲具有高效殺滅活性.利用NH4OH、(NH4)2HPO4、NH4HCO3等能釋放NH3的肥料熏蒸土壤能有效防治根結(jié)線蟲病[10]；熟石灰與雞糞等有機物混合使用時釋放的NH3能有效控制根結(jié)線蟲病害[11].脲酶可專一性催化尿素產(chǎn)生NH3，利用細菌脲酶催化尿素釋放NH3被證明對根結(jié)線蟲病具有良好防效[12].一些食用菌菌渣含有豐富的脲酶[13].據(jù)此，本文提出利用菌渣脲酶催化尿素釋放NH3防控根結(jié)線蟲病的新策略，并在此研究中評估該策略的可行性和實效性.

1 材料與方法

1.1 雪茄煙葉根結(jié)線蟲病的根樣采集及病害程度調(diào)查2021年7月13日，在云南省普洱市江城縣整董鎮(zhèn)整董村13.33 hm2(200余畝)連片種植的雪茄煙葉大田（經(jīng)緯度：101°55'84″E, 22°43'6″N；海拔：813 m；品種：云雪1號），采用五點取樣法拔出煙根，100株/點，共500株，取樣點覆蓋面積約6.67 hm2(100畝).洗凈根系附著土壤，帶回實驗室，按5級標準進行根瘤分級并計算病情指數(shù)和病株率[14].病情指數(shù)=100×Σ（各級病根數(shù)×各級代表值）/（調(diào)查總根數(shù)×最高級代表值）.病株率（%）=感病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%.

1.2 根結(jié)線蟲病原鑒定

1.2.1 雌蟲會陰花紋形態(tài)鑒定 從感病煙株根瘤上挑取雌蟲，參照文獻[15]描述的方法制作根結(jié)線蟲雌成蟲會陰花紋，在顯微鏡下觀察會陰花紋的形態(tài)特征并拍照.

1.2.2 根結(jié)線蟲的分子鑒定 從感病煙株根瘤上挑取成熟的單頭雌蟲，放于裝有5 μL無菌ddH2O的PCR管中，參照文獻[16]方法提取線蟲DNA.根據(jù)雌蟲會陰花紋形態(tài)，初步判斷此線蟲為爪哇根結(jié)線蟲（M.javanica）.因此，以線蟲DNA為模板，選用爪哇根結(jié)線蟲特異性引物（Fjav/Rjav）進行SCAR-PCR.PCR反 應(yīng) 體 系(50 μL)：5×Trans Start? Fastpfu Buffer 10 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，Trans Start?DNA polymerase 1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，線蟲DNA模板2 μL，無菌ddH2O 31 μL.擴增條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測.

1.3 科赫法則驗證病原線蟲的致病性從田間采集的感病雪茄煙葉根樣上挑取卵塊，置于培養(yǎng)皿的篩網(wǎng)上.在培養(yǎng)皿中加入適量的無菌水，25 ℃下孵育7 d后用貝曼漏斗法分離并離心濃縮，獲得二齡幼蟲（J2）懸液（約2 000條/mL）.將煙用育苗基質(zhì)在高溫高壓（121 ℃、110 kPa）下濕熱滅菌1 h后裝盤，播種雪茄煙葉“云雪1號”種子，在溫室條件下按煙草常規(guī)育苗方法獲得5葉期煙苗.在花盆中裝入經(jīng)高溫高壓濕熱滅菌的土壤，移栽煙苗，1株/盆，移栽5 d后接種J2懸液0.5 mL/株，以等體積無菌水替代J2懸液接種為對照，每處理10個重復(fù).在溫室內(nèi)培養(yǎng)60 d時拔出煙株，挑取雌蟲并按上述方法進行會陰花紋的形態(tài)比對和分子鑒定.

1.4 食 用 菌 菌 渣 脲 酶 活 性 的 測 定金針菇菌渣、杏鮑菇菌渣、香菇菌渣、姬菇菌渣取自云南省的陸良爨鄉(xiāng)綠圓菇業(yè)有限公司，參照文獻[17]方法測定菌渣的脲酶活性.脲酶活性用反應(yīng)24 h時單位質(zhì)量菌渣中含NH3-N的質(zhì)量表示，單位為mg/g.

1.5 NH3致死J2的有效質(zhì)量濃度測定在二分隔培養(yǎng)皿的其中一隔中倒上水瓊脂培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)基上接種雪茄煙葉根結(jié)線蟲J2懸液0.5 mL.在另一隔中放入滅菌脫脂棉球，在棉球上滴加不同劑量的氨水（有效成分28%，分析純，武漢制氨廠），立即用氨氣測定儀（型號：GT-903，深圳市科爾諾電子科技有限公司）測定培養(yǎng)皿中的NH3質(zhì)量濃度.熏蒸24 h時，用適量無菌水漂浮培養(yǎng)基上的J2，在解剖鏡下計數(shù)J2死亡數(shù)（線蟲僵直視為死亡），計算J2死亡率，以確定致死100% J2所需的NH3質(zhì)量濃度.

1.6 盆栽試驗基于上一實驗，確定了致死100%J2所需的NH3最低質(zhì)量濃度為136.8 mg/m3.通過預(yù)實驗，確定了釋放的NH3質(zhì)量濃度≥136.8 mg/m3時菌渣、尿素、土壤的適宜配比和反應(yīng)條件為：用尿素含量為4%的菌渣與土壤按質(zhì)量比為1∶18的比例混合均勻，在w(H2O)≥60%、溫度≥20 ℃條件下放置24 h.按此配比設(shè)置了盆栽試驗的8個處理（表1）：在花盆中裝入各種混料2 kg，然后加入J2稀釋液1 L（含J2約2 000條）使混料水分質(zhì)量分數(shù)在60%左右，用塑料膜密閉整個花盆，在28 ℃下放置3 d時測定各處理的NH3質(zhì)量濃度，然后揭膜、放置1 d以揮發(fā)掉殘余的NH3；然后移栽5葉期的雪茄煙煙苗.以經(jīng)過滅菌使脲酶活性喪失的菌渣替代未滅菌菌渣為陽性對照，以未添加菌渣和尿素的處理為陰性對照，每處理10個重復(fù).在溫室內(nèi)栽培90 d時，拔出煙根，進行根瘤分級，計算病情指數(shù)的防效.防效（%）=(1-x/y)×100%，x、y分別代表處理和陰性對照的病情指數(shù).

表1 “菌渣+尿素”熏蒸土壤對雪茄煙葉根結(jié)線蟲病的防治效果Tab.1 Control effects of fumigated soil with spent mushroom substrate plus urea on root-knot nematode disease of cigar tobacco

2 結(jié)果與分析

2.1 雪茄煙葉根結(jié)線蟲病的病害嚴重度及癥狀在云南省普洱市江城縣整董鎮(zhèn)整董村約13.33 hm2（200余畝）連片種植的雪茄煙葉“云雪1號”大田中，平均煙株發(fā)病率為82.45%，病情指數(shù)為46.32，根結(jié)線蟲病為重度發(fā)生.癥狀表現(xiàn)為：在輕度感染的煙株根系上形成大量大小不等的球狀瘤結(jié)，根系完整[圖1（a）]；在重度感染的煙株上，主根畸形，甚至腐爛，側(cè)根不發(fā)達，形成大量小瘤結(jié)[圖1（b）].地上部在煙葉旺長期前癥狀不明顯，采收期時葉片稍變黃，長勢衰弱，呈缺水缺肥狀[圖1（c）].

2.2 雪茄煙葉根結(jié)線蟲病的病原鑒定隨機挑取雌蟲、雄蟲、二齡幼蟲各30條，用于形態(tài)特征數(shù)據(jù)的測量和形態(tài)描述.雌蟲呈乳白色至棕黃色，梨形，具有長形漸尖的頸部，頸部位于縱向的體中軸線上[圖2（a）]，體長527.5～812.7 μm，口針長14.3～17.6 μm，背食道腺開口到口針基部球的距離為2.1～3.4 μm.會陰花紋背弓圓而扁平，線紋平滑至波浪狀，側(cè)線清楚地將花紋的背線和腹線分開，分為明顯的背區(qū)和腹區(qū)，無線紋通過側(cè)線[圖2（b）].雄蟲體長747.6～131.4 μm，口針長18.5～24.1 μm，背食道腺開口到口針基部球的距離為3.3～5.4 μm，引帶長6.9～9.7 μm.二齡幼蟲[圖2（c）]體長397.4～564.2 μm，口針長8.9～11.7 μm，尾長 46.8～59.7 μm.根據(jù)以上形態(tài)特征，參考根結(jié)線蟲鑒定專著[1,18]，將侵染雪茄煙葉的根結(jié)線蟲初步鑒定為爪哇根結(jié)線蟲（M.javanica）.利用爪哇根結(jié)線蟲特異性引物（Fjav/Rjav）擴增單條雌蟲基因組DNA，獲大小為720 bp的爪哇根結(jié)線蟲特異性條帶[圖2（d）][16]，表明侵染雪茄煙葉的根結(jié)線蟲為爪哇根結(jié)線蟲.

圖1 雪茄煙葉根結(jié)線蟲病危害癥狀Fig.1 Symptoms of root-knot nematode disease on cigar tobacco leaf

圖2 雪茄煙爪哇根結(jié)線蟲形態(tài)及分子鑒定特征Fig.2 Morphological and molecular characteristics of Meloidogyne javanica from infected cigar tobacco

2.3 爪哇根結(jié)線蟲是雪茄煙葉根結(jié)線蟲病病原的科赫法則驗證溫室條件下，將分離自雪茄煙葉感病根系上的J2接種在“云雪1號”幼苗上.第4天時，通過染色發(fā)現(xiàn)根系內(nèi)開始有J2的侵入[圖3（a）]，接種30 d時，根系上線蟲30～50個根瘤[圖3（b），（d）]，地上部葉片開始退綠變黃[圖3（c）]，表現(xiàn)出典型的根結(jié)線蟲病癥狀.接種60 d時，通過檢測根瘤上雌蟲的會陰花紋形態(tài)和分子鑒定[圖2（d）]，確定病原線蟲為爪哇根結(jié)線蟲.在未接種J2的對照中，植株長勢正常，根系上無根瘤[圖3（e），（f）].據(jù)此，確定爪哇根結(jié)線蟲為雪茄煙葉根結(jié)線蟲病的病原.

圖3 科赫法則確定雪茄煙葉根結(jié)線蟲病病原Fig.3 Koch's rule to determine the pathogen nematodein cigar tobacco

2.4 生物源NH3熏蒸土壤防治雪茄煙葉根結(jié)線蟲病的效果采用二分隔平皿法測定了氨水釋放不同質(zhì)量濃度NH3對J2的致死活性，發(fā)現(xiàn)致死100%J2所需的NH3最低質(zhì)量濃度為136.8 mg/m3.金針菇菌渣、杏鮑菇菌渣、香菇菌渣、姬菇菌渣中的脲酶活性分別為0.81、0.49、0.24 mg/g和0.17 mg/g.在這4種菌渣中加入尿素，在w(H2O)≥60%、溫度≥20 ℃條件下放置24 h，菌渣中的脲酶均能催化尿素而釋放NH3.在這4種烘干至恒重的菌渣中，當尿素質(zhì)量分數(shù)為4%以上時，在w(H2O)≥60%、溫度≥20 ℃條件下放置24 h，釋放的NH3質(zhì)量濃度均大于136.8 mg/m3.將含4%尿素的4種菌渣與土壤按質(zhì)量比為1∶18的比例混合，在w(H2O)≥60%、溫度≥20 ℃條件下放置48 h，釋放的NH3最高質(zhì)量濃度能達到136.8 mg/m3.測試了4種食用菌菌渣與尿素配合使用對雪茄煙葉根結(jié)線蟲病的防治效果.結(jié)果（表1）顯示，在相同施用劑量下，菌渣脲酶催化尿素在土壤中釋放的NH3質(zhì)量濃度在130.9（姬菇菌渣+尿素處理組）～218.7 mg/m3（金針菇菌渣處理組），各處理間的NH3質(zhì)量濃度差異顯著.在滅菌菌渣與尿素配合使用時，各處理中僅檢測到很低的NH3質(zhì)量濃度（11.6～12.5 mg/m3），未施用菌渣和尿素的空白對照中，NH3質(zhì)量濃度最低（2.5 mg/m3），顯著低于其它處理.“菌渣+尿素”熏蒸土壤對雪茄煙葉根結(jié)線蟲病的防治在75.5%（姬菇菌渣+尿素處理組）～92.3%（金針菇菌渣處理組），各處理間的防效差異顯著.“滅菌菌渣+尿素”的各處理對根結(jié)線蟲病也表現(xiàn)出較低的防效，但顯著低于“未滅菌菌渣+尿素”的以上各處理，防效在21.5%（滅菌香菇菌渣+尿素）～38.5%（滅菌姬菇菌渣+尿素）之間.

3 討論

在世界范圍內(nèi)，危害烤煙的根結(jié)線蟲種類主要包括南方根結(jié)線蟲、北方根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲[19].在中國，煙草根結(jié)線蟲的種類主要包括南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲、北方根結(jié)線蟲和象耳豆根結(jié)線蟲（M.enterolobii）.其中，南方根結(jié)線蟲為中國大多數(shù)煙區(qū)的優(yōu)勢種，分布廣泛；花生根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲為區(qū)域性的優(yōu)勢種[4].相對于烤煙，目前對雪茄煙病害的病原鑒定、病理流行、品種抗性、防控措施等方面的研究稍顯薄弱.夏長劍等[20]系統(tǒng)調(diào)查了海南省2018—2019年間雪茄煙葉病蟲害的種類，共報道了18種病害、7種蟲害；其中包括根結(jié)線蟲病，并指出海南雪茄煙根結(jié)線蟲病為南方根結(jié)線蟲（M.incognita）和爪哇根結(jié)線蟲（M.javanica）混合發(fā)生所致，但未給出兩種病原線蟲的鑒定特征.本研究基于雌蟲、雄蟲和二齡幼蟲的形態(tài)特征、PCR擴增特異性條帶及科赫法則驗證結(jié)果，將普洱市江城縣雪茄煙葉“云雪1號”品種上發(fā)生的根結(jié)線蟲病病原鑒定為爪哇根結(jié)線蟲（M.javanica），首次明確了云南省內(nèi)一種雪茄煙病原線蟲的種類.當然，隨著調(diào)查區(qū)域和栽培品種的擴大，不排除云南雪茄煙上有其它種類的根結(jié)線蟲侵染，甚至多種病原線蟲復(fù)合危害的現(xiàn)象存在.

雪茄煙葉適宜在溫度適宜、光照充足、雨量充沛、紅壤土至沙壤土、土壤礦物質(zhì)豐富的煙區(qū)種植[21]，這樣的氣候和土壤條件特別適合根結(jié)線蟲的生長、繁殖和侵染.隨著中國雪茄煙葉種植面積的擴大以及連作年限的加長，根結(jié)線蟲病極有可能成為雪茄煙葉種植中的頭號重要病害，盡早開展該病害的防控研究刻不容緩.施用化學(xué)殺線蟲劑是防控?zé)煵莞Y(jié)線蟲病的主要措施.目前，防治線蟲病的藥劑有30多種，常用的有10多種，主要分為熏蒸性藥劑以及非熏蒸性藥劑.由于常年濫用化學(xué)殺線蟲劑，環(huán)境污染、線蟲耐藥性增強等問題逐漸顯現(xiàn)，安全、有效的綠色防控措施備受青睞[22-23].自從廣泛使用的化學(xué)熏蒸劑溴甲烷因破壞臭氧層被禁用之后[24]，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中急需溴甲烷替代品及相應(yīng)的熏蒸技術(shù).氨水是能夠釋放NH3的高氮無機物，對真菌、細菌、線蟲等土傳病害病原有廣譜抑制作用.利用氨水消毒茶園土壤對根結(jié)線蟲病的防效達20%～77.83%[25]；氨水消毒土壤能有效控制香蕉枯萎病[26].利用能釋放NH3的碳酸氫銨等無機氮肥開發(fā)的土壤熏蒸策略廣泛應(yīng)用于各種植物寄生線蟲的防治[10,27]；但只有高濃度的NH3（152 μg·m-3）能抑制根結(jié)線蟲的繁殖及瘤結(jié)的形成，相反低濃度的NH3（76 μg·m-3）能促進根結(jié)線蟲的繁殖[28]，所以選擇適宜的NH3濃度非常關(guān)鍵.中國食用菌產(chǎn)業(yè)每年產(chǎn)生的菌渣量約1.32億t[29]，菌渣中含量豐富的脲酶為利用生物源脲酶催化尿素釋放NH3防治根結(jié)線蟲病提供了可能，然而，相關(guān)研究未見報道.本研究表明4種食用菌（金針菇、杏鮑菇、香菇、姬菇）菌渣脲酶催化尿素釋放氨氣熏蒸土壤對雪茄煙葉根結(jié)線蟲病有良好的防治效果，防效在75.5%～92.3%，并明確了“尿素-菌渣-土壤”之間的配比和熏蒸條件.研究結(jié)果在利用生物源脲酶催化尿素防控根結(jié)線蟲病害方面具有理論指導(dǎo)價值和應(yīng)用價值，也為菌渣資源的循環(huán)利用提供了新途徑.